專利名稱：櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
櫛孔扇貝(Chlamys farreri)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellibranchia)翼形亞綱(Pterimorphia)珍珠貝目(Pterioodae)扇貝科(Pectinidae)。櫛孔扇貝產(chǎn)于我國北方近海，在日本、韓國沿海以及俄羅斯南部沿海均有分布。櫛孔扇貝肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國重要的海水養(yǎng)殖對(duì)象，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
在真核生物基因組中，存在著由1-6個(gè)堿基對(duì)組成的簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats)，簡稱SSRs，又稱之為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)。隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和完善，微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)成為國際上主流的標(biāo)記技術(shù)之一。微衛(wèi)星標(biāo)記有諸多優(yōu)點(diǎn)，如隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中，多態(tài)性高；可通過PCR迅速擴(kuò)增，需要的DNA樣品量較少，并且重復(fù)性好；孟德爾式遺傳，共顯性標(biāo)記。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。
遺傳多樣性是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中最為重要的指標(biāo)之一。遺傳多樣性，也叫基因多樣性，是指種內(nèi)不同群體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異的總和。它不但是生物多樣性的重要組成成分，而且是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，遺傳多樣性的大小及其群體遺傳結(jié)構(gòu)跟一個(gè)物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力密切相關(guān)，與生物多樣性的形成、消失和發(fā)展休戚相關(guān)。因此，研究生物的遺傳多樣性對(duì)于保護(hù)、開發(fā)及永續(xù)利用生物種質(zhì)資源都是十分重要的。重要的海水養(yǎng)殖生物在人工放養(yǎng)、放流以及由于人為或自然原因造成的逃逸個(gè)體很容易進(jìn)入野生自然群體從而對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性以及種質(zhì)資源產(chǎn)生極大的影響。由于這種影響是不可逆的，因而會(huì)影響該物種或種群的存在、繁衍。因此如何采取措施，在進(jìn)行海水養(yǎng)殖動(dòng)物品種選育的過程中充分保護(hù)遺傳多樣性的穩(wěn)定也是目前海水養(yǎng)殖業(yè)中需要解決的問題。因此，建立一個(gè)適用的分子標(biāo)記種質(zhì)資源評(píng)價(jià)體系，隨時(shí)檢測和評(píng)價(jià)寶貴的種質(zhì)資源，在養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展的今天顯得尤為重要。同時(shí)利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)分析，對(duì)于櫛孔扇貝資源保護(hù)、持續(xù)利用和品牌戰(zhàn)略具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一組適用于櫛孔扇貝種質(zhì)鑒定和遺傳分析的微衛(wèi)星標(biāo)記，及利用這些標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行櫛孔扇貝種質(zhì)分析——櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
其步驟包括利用已經(jīng)構(gòu)建好的櫛孔扇貝DNA小型插入片段基因組文庫和微衛(wèi)星富集文庫，篩選陽性克隆測序獲得微衛(wèi)星DNA；并利用計(jì)算機(jī)檢索櫛孔扇貝的GenBank數(shù)據(jù)庫，得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)一步優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；然后再對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值(PIC)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系(表1)，而應(yīng)用于櫛孔扇貝種質(zhì)及群體遺傳學(xué)分析；然后利用上述的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組成的評(píng)價(jià)體系再進(jìn)一步對(duì)不同地理群體(種群)的櫛孔扇貝進(jìn)行綜合種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。


圖1位點(diǎn)CFMSP075擴(kuò)增四個(gè)地理群體的帶譜圖(每個(gè)群體示5個(gè)個(gè)體)。
圖2位點(diǎn)CFMSP011擴(kuò)增四個(gè)地理群體的帶譜圖(每個(gè)群體示5個(gè)個(gè)體)。
具體實(shí)施例方式
本方法具體為位點(diǎn)的篩選及其用于種質(zhì)資源評(píng)價(jià)位點(diǎn)的確定，詳細(xì)步驟為1、利用已經(jīng)構(gòu)建好的櫛孔扇貝小型插入片段基因組文庫及微衛(wèi)星富集文庫，通過(GA)20和(CA)20探針篩選文庫，并對(duì)陽性克隆測序獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列。并利用微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter 1.5對(duì)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行微衛(wèi)星DNA的查找，對(duì)于二堿基重復(fù)大于7次、三堿基重復(fù)大于5次、四堿基重復(fù)大于4次、五堿基重復(fù)大于3次和六堿基重復(fù)大于3次的微衛(wèi)星DNA進(jìn)行快速分離得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列；2、在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和Oligo 6.44設(shè)計(jì)引物；引物設(shè)計(jì)應(yīng)滿足下列條件(1)引物長度為20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度大于45℃(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為80-400bp；3、引物的優(yōu)化不同的引物根據(jù)不同的Tm值，在溫度梯度PCR儀上做溫度梯度(在Tm值上下各做10度)優(yōu)化。擴(kuò)增反應(yīng)采用Biometra T-Gradient PCR系統(tǒng)，PCR程序?yàn)?5℃下預(yù)變性5分鐘，95℃變性45秒，退火45秒，72℃延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μL含有正、反引物各0.2μM、dNTPs各0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1個(gè)單位的Taq酶，80ng DNA作為PCR模板，該模板是從40個(gè)個(gè)體中任意取5個(gè)個(gè)體的DNA等量混合得到。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選取雜帶較少、特異性產(chǎn)物亮度較高的PCR反應(yīng)對(duì)應(yīng)的溫度為該引物的最佳退火溫度Ta；4、標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星位點(diǎn)的確立微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用多態(tài)信息含量值[PIC(Polymorphism Information Content)]衡量。一般情況下，多態(tài)信息含量值能反映出某一個(gè)遺傳標(biāo)記所包含的或所能夠提供的遺傳信息的容量，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記可提供豐富的遺傳信息；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記能夠較為合理的提供遺傳信息，而當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差。依據(jù)上述優(yōu)化獲得的Ta值，選取40個(gè)個(gè)體作為群體進(jìn)行多態(tài)性信息含量值的計(jì)算。PCR程序?yàn)樵?5度下預(yù)變性5分鐘，95度變性45秒，Ta(各引物優(yōu)化的最佳退火溫度)退火45秒，72度下延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μL，含有正反引物各0.2μM、dNTPs 0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1個(gè)單位的Taq酶、20ng DNA模板。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，電泳完畢后用溴化乙錠(濃度為0.15μg/mL)染色，紫外觀察成像并對(duì)電泳譜帶利用公式PIC＝1-∑Pi2進(jìn)行計(jì)算，其中Pi是第i個(gè)等位基因的頻率，所有位點(diǎn)的等位基因頻率由軟件POPGENE32計(jì)算得出。根據(jù)PIC值的計(jì)算結(jié)果，去除重復(fù)性、穩(wěn)定性差，PIC小于0.25標(biāo)記，最后共篩選出重復(fù)性、穩(wěn)定性好，PIC值大于0.25的10個(gè)位點(diǎn)，如表1，作為櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星評(píng)價(jià)體系，用于櫛孔扇貝的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。
以下為利用上面得到的評(píng)價(jià)體系進(jìn)行櫛孔扇貝不同群體評(píng)價(jià)的實(shí)例及其方法步驟。
1、提取櫛孔扇貝DNA選用采自膠南(青島市)、長島(煙臺(tái)市)、尋山(威海市)和日照的櫛孔扇貝樣品，每個(gè)取樣地隨機(jī)選取40只健康的貝，貝樣活體解剖后取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10min。將核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存用于PCR擴(kuò)增。
2、PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件為40ng櫛孔扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。使用這兩對(duì)引物時(shí)設(shè)置的PCR程序參數(shù)為95℃變性45秒，Ta退火45秒，72℃延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)(pUC19/HaeIII)。電泳2-3小時(shí)后用溴化乙錠(濃度0.15mg/mL)染色，凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像(代表圖譜見圖1、圖2)，并利用軟件Quantity One對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量相比照，對(duì)每個(gè)個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的大小確定，從而進(jìn)行快速的、準(zhǔn)確的確定基因型。將譜帶轉(zhuǎn)換成軟件POPGENE32能夠識(shí)別的數(shù)據(jù)，利用軟件POPGENE32對(duì)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。其結(jié)果可以反應(yīng)出不同地理群體(種群)的Hardy-Weinberg平衡性、雜合度、等位基因頻率等遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，從而應(yīng)用于櫛孔扇貝不同地理群體(種群)的種質(zhì)資源分析。因此，以10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系的建立，為相關(guān)研究室之間數(shù)據(jù)的比對(duì)和交流提供了基礎(chǔ)，也有望為保護(hù)和持續(xù)利用櫛孔扇貝種質(zhì)資源，建立集約型、健康型養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，堅(jiān)持品牌戰(zhàn)略提供技術(shù)支持。

表1 用于櫛孔扇貝種質(zhì)資源分析的標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是利用已經(jīng)構(gòu)建好的櫛孔扇貝DNA小型插入片段基因組文庫和微衛(wèi)星富集文庫及計(jì)算機(jī)檢索櫛孔扇貝的GenBank數(shù)據(jù)庫，得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)一步優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記，然后再對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系。
2.一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是上述得到含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的步驟為利用已經(jīng)構(gòu)建好的櫛孔扇貝小型插入片段基因組文庫及微衛(wèi)星富集文庫，通過(GA)20和(CA)20探針篩選文庫，并對(duì)陽性克隆測序獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列。并利用微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter 1.5對(duì)GenBank進(jìn)行微衛(wèi)星DNA的查找，對(duì)于二堿基重復(fù)大于7次、三堿基重復(fù)大于5次、四堿基重復(fù)大于4次、五堿基重復(fù)大于3次和六堿基重復(fù)大于3次的微衛(wèi)星DNA進(jìn)行快速分離得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列。
3.一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是上述在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物步驟為在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和Oligo 6.44設(shè)計(jì)引物；引物設(shè)計(jì)應(yīng)滿足下列條件(1)引物長度為20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度大于45℃(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為80-400bp。
4.一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系。
5.一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用，其特征是上述的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組成的標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系應(yīng)用于不同地理群體的櫛孔扇貝綜合種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。
全文摘要
一種櫛孔扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其方法是利用已構(gòu)建好的櫛孔扇貝DNA小型插入片段基因組文庫和微衛(wèi)星富集文庫及計(jì)算機(jī)檢索櫛孔扇貝的GenBank數(shù)據(jù)庫，得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，并優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；再對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系，應(yīng)用于櫛孔扇貝種質(zhì)及群體遺傳學(xué)分析；利用上述的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組成的評(píng)價(jià)體系再進(jìn)一步對(duì)不同地理群體(種群)的櫛孔扇貝進(jìn)行綜合種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。有望為保護(hù)和持續(xù)利用櫛孔扇貝種質(zhì)資源，建立集約型、健康型養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和品牌戰(zhàn)略提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N15/65GK1831125SQ200510044798
公開日2006年9月13日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者包振民, 胡景杰, 汪小龍, 戰(zhàn)愛斌, 陸維, 惠敏 申請人:中國海洋大學(xué)