專利名稱：一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于森林病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種能對(duì)的松材線蟲和擬松材線蟲進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松樹萎蔫病是一種毀滅性的森林病害，具有危害極其嚴(yán)重、蔓延速度快、防治困難等特點(diǎn)，一旦發(fā)生將給國民經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境造成極大的損失，現(xiàn)已成為我國林業(yè)生產(chǎn)上的頭號(hào)生物災(zāi)難，其病原松材線蟲為我國對(duì)內(nèi)對(duì)外的重要檢疫對(duì)象。由于缺乏較好的松樹萎蔫病發(fā)生后的應(yīng)對(duì)措施，目前對(duì)于松樹萎蔫病的治理主要是通過清除傳染源和切斷傳染途徑來控制其傳播蔓延的速度，具體做法是在松樹萎蔫病發(fā)生區(qū)伐除病樹并銷毀防止擴(kuò)散，在松樹萎蔫病未發(fā)生區(qū)則做好對(duì)內(nèi)對(duì)外的檢疫工作防止傳入。上述兩項(xiàng)工作涉及的技術(shù)關(guān)鍵是林間病樹的診斷和松木制品中病原線蟲的檢測(cè)。
對(duì)于松樹萎蔫病的診斷和檢疫最直接、最有效的方法是快速準(zhǔn)確的鑒定出病木或松木制品中的病原線蟲種類，長期以來松材線蟲的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)，尤其是對(duì)雌、雄成蟲某些特征的觀察。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡便、直觀，存在的弊端是1.在松木材質(zhì)中有眾多的線蟲，有些種類的線蟲形態(tài)特征與松材線蟲相似，特別松材線蟲的致病力較弱的近緣種擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus)，其形態(tài)與松材線蟲很容易混淆，使得鑒定的準(zhǔn)確性完全依靠操作者的經(jīng)驗(yàn)；2.松材線蟲在形態(tài)上有變異的情況存在，在實(shí)際操作時(shí)至少需要對(duì)雌、雄成蟲各10條以上進(jìn)行觀察才能確診，費(fèi)工、費(fèi)時(shí)；3.形態(tài)學(xué)鑒定只適用于成蟲，不適宜幼蟲，而病木中的松材線蟲在很多情況下是以幼蟲的形式存在，使的該方法在實(shí)際應(yīng)用中受到限制.。
近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用PCR技術(shù)對(duì)松材線蟲進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定已成為趨勢(shì)。松材線蟲PCR鑒定包含兩項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，即PCR擴(kuò)增技術(shù)和線蟲DNA制備技術(shù)。早期的PCR鑒定包括采用隨機(jī)引物擴(kuò)增的RAPD-PCR技術(shù)和采用線蟲通用引物擴(kuò)增后再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切的PCR-RFLP技術(shù)，線蟲DNA的制備多采用酚仿抽提法，它們的共同缺點(diǎn)是由于使用非松材線蟲專用的特異引物而造成鑒定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性不高，而且需要大量線蟲制備DNA，制備時(shí)間長。林茂松等發(fā)明的《松材線蟲檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法》(專利號(hào)ZL2003l0106109.5)提供一種松樹萎蔫病診斷的新方法，該方法采用三條特異引物對(duì)分離自松樹病木的單條線蟲進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定準(zhǔn)確率高，自獲得線蟲分離液后8小時(shí)內(nèi)可完成鑒定，大大提高了松樹萎蔫病的診斷效率。但由于采用了蛋白酶消化法提取單條線蟲的DNA，使得提取時(shí)間延長，同時(shí)在線蟲樣品在轉(zhuǎn)移過程中易丟失，增加了操作的難度。采用PCR反應(yīng)中加入熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR可以在每一輪循環(huán)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，而不必等到PCR反應(yīng)全部結(jié)束后才能檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，因此能大大縮短PCR擴(kuò)增的時(shí)間。Cao等(Phytopathology 200595566-571)建立的松材線蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)可以將獲得線蟲DNA樣品后的檢測(cè)時(shí)間縮短至1小時(shí)內(nèi)。但該方法的完成必須依賴價(jià)格昂貴熒光實(shí)時(shí)PCR儀、檢測(cè)設(shè)備和試劑，因而使其應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種快速、準(zhǔn)確，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的松樹萎蔫病病原線蟲的PCR檢測(cè)方法。
本發(fā)明包括以下步驟(1)根據(jù)松材線蟲和擬松材線蟲的rDNA序列設(shè)計(jì)用于松材線蟲PCR檢測(cè)的一對(duì)引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，用于擬松材線蟲PCR檢測(cè)的一對(duì)引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’。
(2)用于PCR檢測(cè)的單條線蟲DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2～4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、BM1和BM2及的線蟲檢測(cè)液，晾干待用；在解剖鏡下從線蟲分離液中挑取一條線蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥時(shí)，用鑷子取一塊已干燥的含線蟲檢測(cè)試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
(3)PCR擴(kuò)增在步驟(2)得到的單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化的擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，54～55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
(4)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5～10μl步驟(3)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠在電泳結(jié)束經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，如檢測(cè)到一條分子量為501bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為松材線蟲，如檢測(cè)到一條分子量為160bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為擬松材線蟲。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在1.本發(fā)明采用了機(jī)械破碎和濾紙直接吸附的方法制備用于PCR擴(kuò)增的單條線蟲DNA模板，無需蛋白酶消化和酚仿抽提，線蟲DNA的制備時(shí)間縮短到了15min之內(nèi)，從而使從獲得線蟲分離液開始的整個(gè)鑒定過程在4小時(shí)內(nèi)完成，同時(shí)在解剖鏡下將線蟲DNA吸附于濾紙上后便于觀察，不易發(fā)生線蟲DNA在轉(zhuǎn)移中丟失的情況，使得操作更為方便。
2.本發(fā)明用于PCR檢測(cè)的引物為根據(jù)松材線蟲和擬松材線蟲rDNA區(qū)的特異序列設(shè)計(jì)的專用引物，鑒定的穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高。
3.本發(fā)明采用普通PCR儀和常規(guī)試劑，檢測(cè)成本，利于推廣應(yīng)用。
4.檢測(cè)的靈敏度高，單條線蟲制備的DNA足以完成檢測(cè)，可以對(duì)成蟲和幼蟲進(jìn)行檢測(cè)。


圖1松材線蟲種群成蟲和幼蟲的擴(kuò)增結(jié)果圖2擬松材線蟲種群成蟲和幼蟲的擴(kuò)增結(jié)果.
圖3對(duì)不同來源的松材線蟲和擬松材線蟲種群的擴(kuò)增結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例一1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測(cè)的特異引物的設(shè)計(jì)采用線蟲ITS通用引物擴(kuò)增不同來源的2個(gè)松材線蟲和5個(gè)擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴(kuò)增片段；雙脫氧終止法測(cè)定各擴(kuò)增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測(cè)液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于廣東的松材線蟲分離液中挑取一條典型的成蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測(cè)試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴(kuò)增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測(cè)；取5μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測(cè)到一條分子量為501bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為松材線蟲(圖1、圖3)。
實(shí)施例二1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測(cè)的特異引物的設(shè)計(jì)采用線蟲ITS通用引物擴(kuò)增不同來源的2個(gè)松材線蟲和5個(gè)擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴(kuò)增片段；雙脫氧終止法測(cè)定各擴(kuò)增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測(cè)液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于江蘇的松材線蟲分離液中挑取一條典型的幼蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測(cè)試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴(kuò)增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測(cè)取10μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測(cè)到一條分子量為501bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為松材線蟲(圖1、圖3)。
實(shí)施例三1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測(cè)的特異引物的設(shè)計(jì)采用線蟲ITS通用引物擴(kuò)增不同來源的2個(gè)松材線蟲和5個(gè)擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴(kuò)增片段；雙脫氧終止法測(cè)定各擴(kuò)增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成4mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測(cè)液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于云南的擬松材線蟲分離液中挑取一條典型的成蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測(cè)試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴(kuò)增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測(cè)到一條分子量為160bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為擬松材線蟲(圖2、圖3)。
實(shí)施例四1.用于松材線蟲和擬松材線蟲檢測(cè)的特異引物的設(shè)計(jì)采用線蟲ITS通用引物擴(kuò)增不同來源的2個(gè)松材線蟲和5個(gè)擬松材線蟲種群，獲得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的擴(kuò)增片段；雙脫氧終止法測(cè)定各擴(kuò)增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0軟件分析，找出松材線蟲和擬松材線蟲種群間的差異序列，根據(jù)差異序列利用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)松材線蟲的特異引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，擬松材線蟲的特異引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1區(qū)，BX2位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為160bp；DNA合成儀合成上述4條寡聚核苷酸引物。
2.用于單條線蟲PCR鑒定的DNA模板制備在一塊經(jīng)高壓滅菌并剪成2mm的方形定量濾紙上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、M1和BM2的線蟲檢測(cè)液，晾干待用；在解剖鏡下從來源于湖南的擬松材線蟲分離液中挑取一條典型的幼蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥；用鑷子取已干燥的含線蟲檢測(cè)試劑的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液。
3.病原線蟲的PCR特異擴(kuò)增在單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。
4.PCR產(chǎn)物檢測(cè)取10μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μl 6×電泳上樣緩沖液，進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后凝膠塊用溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，檢測(cè)到一條分子量為160bp的電泳譜帶，表明受檢線蟲為擬松材線蟲(圖2、圖3)。
權(quán)利要求
1.一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)根據(jù)松材線蟲的rDNA序列設(shè)計(jì)用于松材線蟲PCR檢測(cè)的一對(duì)引物BX15’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’根據(jù)擬松材線蟲的rDNA序列設(shè)計(jì)用于擬松材線蟲PCR檢測(cè)的一對(duì)引物BM15’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’(2)用于PCR檢測(cè)的單條線蟲DNA模板制備在解剖鏡下從線蟲分離液中挑取一條線蟲入預(yù)先滴在載玻片的雙蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待線蟲蟲體周圍的水接近完全干燥時(shí)，用鑷子取一塊預(yù)先滴有2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特異引物BX1、BX2、BM1和BM2的線蟲檢測(cè)試劑并已干燥的濾紙片覆蓋于線蟲蟲體上，鑷子輕按濾紙片將線蟲壓破，將濾紙片移入裝有15μl雙蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加熱10min，冷卻至室溫，8000rpm離心30s得到單條線蟲DNA模板制備液(3)PCR擴(kuò)增在步驟(2)得到的單條線蟲DNA模板制備液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至25μl；置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增(4)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5～10μl步驟(3)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠在電泳結(jié)束經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察，如檢測(cè)到一條分子量為501bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為松材線蟲，如檢測(cè)到一條分子量為160bp的電泳譜帶表明受檢線蟲為擬松材線蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測(cè)方法，其特征是所述的用于PCR檢測(cè)的單條線蟲DNA模板制備的濾紙片為經(jīng)高壓滅菌處理，并剪成邊長2～4mm的方形定量濾紙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測(cè)方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增條件是預(yù)變性94℃ 2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃ 45s，54～55℃ 60s，72℃ 60s；最后再72℃延伸10min。
全文摘要
本發(fā)明屬于森林病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種松材線蟲和擬松材線蟲的檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案包括四個(gè)步驟①設(shè)計(jì)用于松材線蟲和擬松材線蟲PCR檢測(cè)的特異引物各一對(duì)；②用機(jī)械破碎和濾紙吸附的方法獲得單條線蟲DNA作為模板；③進(jìn)行松材線蟲和擬松材線蟲的特異PCR擴(kuò)增；④PCR產(chǎn)物檢測(cè)。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確、靈敏地從線蟲分離液中鑒定出松材線蟲或擬松材線蟲，為危險(xiǎn)性的松樹線蟲萎蔫病的診斷及檢疫提供了一種快速、準(zhǔn)確且便于操作的方法，本發(fā)明可用于松材線蟲及擬松材的成蟲和幼蟲。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1793866SQ20051004872
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者王揚(yáng), 喻盛甫, 楊佩文, 胡先奇 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)