專利名稱：誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，屬植物保護領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)的毀滅性病害，世界各水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，每年造成11-30％的產(chǎn)量損失，經(jīng)濟損失達1.57億美元，足以為六千萬人口提供一年的糧食，因此受到世界各國水稻育種學(xué)家、植物病理學(xué)家、遺傳學(xué)家的廣泛關(guān)注。稻瘟病菌還是經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的良好試驗材料，該病害系統(tǒng)是真菌—植物互作研究的模式系統(tǒng)。近年來的研究獲得了許多與侵染相關(guān)的形態(tài)分化和致病因子的遺傳資源和信息，為稻瘟病菌基因組學(xué)研究打下了良好的基礎(chǔ)。
通過致病相關(guān)基因的功能研究，可深入了解稻瘟病菌的致病機制、并以此為途徑尋找水稻中與致病基因相對應(yīng)的抗病基因，研究寄主—病原物互作機制和抗病機制，預(yù)測稻瘟病菌群體中致病基因的分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達和變化、誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的功能域與致病功能域的關(guān)系，預(yù)測水稻中相應(yīng)抗病基因的抗性持久性。通過鑒定致病基因控制的致病相關(guān)因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點，最終為有效控制稻瘟病提出新的策略。但是多年的研究結(jié)果表明，目前還沒有能夠誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，從而無法確定其致病相關(guān)因子，限制了對其致病機理的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是克服稻瘟病菌在人工培養(yǎng)條件下無法產(chǎn)生致病性蛋白的不足，提供了一種能夠誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為(1)將斜面上保存的稻瘟病菌株接種在普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)。普通固體培養(yǎng)基上由以下成分組成葡萄糖15g/L、酵母粉5g/L、脂粉12g/L、H2O1L。(2)形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色。普通液體培養(yǎng)基中由以下成分組成Na3C6H5O7-2H2O 2.5g/L、KH2PO45.6g/L、NH4NO32.0g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、CaCl2-H2O 0.1g/L、Biotin 5.0μg/L、Thiamine 10.0mg/L、Trace elements 0.1mL、Sucrose 15g/L、Citric acid 5.00g/L、ZnSO4-7H2O 5.00g/L、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O 1.00g/L、CuSO4-5H2O 0.25g/L、MnSO4-H2O 0.05g/L、H3BO30.05g/L、Na2MoO4-2H2O 0.05g/L、H2O 1L。(3)將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm搖床培養(yǎng)48小時。致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成Na3C6H5O7-2H2O 2.5g/L、KH2PO45.6g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、CaCl2-H2O 0.1g/L、Biotin 5.0μg/L、Thiamine 10.0mg/L、Trace elements 0.1ml、Sucrose 15g/L、Citric acid 5.00g/L、ZnSO4-7H2O 5.00g/L、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O1.00g/L、CuSO4-5H2O 0.25g/L、MnSO4-H2O 0.05g/L、H3BO30.05g/L、Na2MoO4-2H2O0.05g/L、H2O 1L。(4)將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。(5)將得到的蛋白提取物用300μL除離子水溶解后在4葉期水稻葉片上做接種試驗，驗證所提取蛋白的致病性。
本發(fā)明的有益效果是解決了稻瘟病菌在人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生致病性相關(guān)蛋白的問題，通過對液體培養(yǎng)基配方的調(diào)整，去掉NH4NO3，造成氮饑餓狀態(tài)，從而誘導(dǎo)了稻瘟病菌大量分泌致病性蛋白。通過對這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究稻瘟病菌與水稻之間在蛋白質(zhì)水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識別、信號傳導(dǎo)等機理，對于稻瘟病菌致病機理的研究具有重要意義。
具體實施例方式具體實施方式
為首先將稻瘟病菌株在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入普通液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，最后提取稻瘟菌分泌蛋白。蛋白提取物在水稻葉片上接種，調(diào)查壞死斑。
實施例一將斜面上保存的稻瘟病菌弱致病性菌株93-12-1a、95-8-3c、93-1-2a、95-22-1a接種在由葡萄糖(15g/L)、酵母粉(5g/L)、脂粉(12g/L)和H2O(1L)組成的普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)。形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、NH4NO3(2.0g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1mL)、Sucrose(15g/L)、Citric acid(5.00g/L)、ZnSO4-7H2O(5.00g/L)、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O(1.00g/L)、CuSO4-5H2O(0.25g/L)、MnSO4-H2O(0.05g/L)、H3BO3(0.05g/L)、Na2MoO4-2H2O(0.05g/L)和H2O(1L)組成的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)，3天后在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色。將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1ml)、Sucrose(15g/L)、Citric acid(5.00g/L)、ZnSO4-7H2O(5.00g/L)、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O(1.00g/L)、CuSO4-5H2O(0.25g/L)、MnSO4-H2O(0.05g/L)、H3BO3(0.05g/L)、Na2MoO4-2H2O(0.05g/L)和H2O(1L)組成的致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。
實施例二將斜面上保存的稻瘟病菌中等致病性菌株93-2-1a、95-7-1d、94-006-1a、94-12-2a接種在由葡萄糖(15g/L)、酵母粉(5g/L)、脂粉(12g/L)和H2O(1L)組成的普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)。形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、NH4NO3(2.0g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1mL)、Sucrose(15g/L)和H2O(1L)組成的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)，3天后在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色。將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1ml)、Sucrose(15g/L)和H2O(1L)組成的致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。
實施例三將斜面上保存的稻瘟病菌較強致病性菌株94-014-1a、95-11-1a、95-19-1a、95-23-4a接種在由葡萄糖(15g/L)、酵母粉(5g/L)、脂粉(12g/L)和H2O(1L)組成的普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)。形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、NH4NO3(2.0g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1mL)、Sucrose(15g/L)、Citric acid(5.00g/L)、ZnSO4-7H2O(5.00g/L)、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O(1.00g/L)、CuSO4-5H2O(0.25g/L)、MnSO4-H2O(0.05g/L)、H3BO3(0.05g/L)、Na2MoO4-2H2O(0.05g/L)和H2O(1L)組成的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)，3天后在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色。將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1ml)、Sucrose(15g/L)和H2O(1L)組成的致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。
實施例四將斜面上保存的稻瘟病菌強致病菌株95-63C接種在由葡萄糖(15g/L)、酵母粉(5g/L)、脂粉(12g/L)和H2O(1L)組成的普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)。形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、NH4NO3(2.0g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1mL)、Sucrose(15g/L)和H2O(1L)組成的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)，3天后在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色。將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL由Na3C6H5O7-2H2O(2.5g/L)、KH2PO4(5.6g/L)、MgSO4-7H2O(0.2g/L)、CaCl2-H2O(0.1g/L)、Biotin(5.0μg/L)、Thiamine(10.0mg/L)、Trace elements(0.1ml)、Sucrose(15g/L)、Citric acid(5.00g/L)、ZnSO4-7H2O(5.00g/L)、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O(1.00g/L)、CuSO4-5H2O(0.25g/L)、MnSO4-H2O(0.05g/L)、H3BO3(0.05g/L)、Na2MoO4-2H2O(0.05g/L)和H2O(1L)組成的致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。
將上述實施例一、實施例二、實施例三和實施例四所提取、保存的分泌蛋白接種在國際水稻所育成的24個持有不同抗稻瘟病基因的近等基因上，72小時后調(diào)查壞死斑大小。結(jié)果表明壞死斑由內(nèi)至外，依次形成白斑、水漬圈和黃斑圈的典型癥狀，而且菌株的致病性越強，誘導(dǎo)蛋白的致病性也越強。壞死斑大小見下表

上述結(jié)果表明，通過本方法誘導(dǎo)不同致病性的稻瘟病菌株產(chǎn)生的分泌蛋白，對含有不同已知抗病基因的水稻近等基因系都有較強的致病作用，表明此方法在稻瘟病菌致病性研究中具有重要作用。
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，其步驟為(1)將斜面上保存的稻瘟病菌株接種在普通固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)；普通固體培養(yǎng)基由以下成分組成葡萄糖15g/L、酵母粉5g/L、瓊脂粉12g/L、H2O1L；(2)形成較大的菌落后，用接種針挑取3塊約0.5cm2的菌絲塊，轉(zhuǎn)接到50mL的普通液體培養(yǎng)基中，28℃150rpm振蕩培養(yǎng)；3天后在無菌狀態(tài)下，用2層沙布過濾，濾出的菌絲塊用無菌水沖洗至無色；普通液體培養(yǎng)基主要由以下成分組成Na3C6H5O7-2H2O 2.5g/L、KH2PO45.6g/L、NH4NO32.0g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、CaCl2-H2O 0.1g/L、Biotin 5.0μg/L、Thiamine 10.0mg/L、Trace elements 0.1mL、Sucrose15g/L、H2O 1L；(3)將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃150rpm振蕩培養(yǎng)48小時；致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要由以下成分組成Na3C6H5O7-2H2O 2.5g/L、KH2PO45.6g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、CaCl2-H2O 0.1g/L、Biotin 5.0μg/L、Thiamine10.0mg/L、Trace elements 0.1mL、Sucrose 15g/L、H2O 1L；(4)將培養(yǎng)好的菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，-20℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，其特征是步驟(2)中普通液體培養(yǎng)基還包含以下成分Citric acid 5.00g/L、ZnSO4-7H2O 5.00g/L、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O 1.00g/L、CuSO4-5H2O 0.25g/L、MnSO4-H2O 0.05g/L、H3BO30.05g/L、Na2MoO4-2H2O 0.05g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，其特征是步驟(3)中致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含以下成分Citric acid 5.00g/L、ZnSO4-7H2O 5.00g/L、Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O 1.00g/L、CuSO4-5H2O 0.25g/L、MnSO4-H2O 0.05g/L、H3BO30.05g/L、Na2MoO4-2H2O 0.05g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生致病性蛋白的方法，屬于植物保護領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是將斜面上保存的稻瘟病菌株接種在普通固體培養(yǎng)基，28℃下擴繁。形成較大的菌落后，轉(zhuǎn)接到50mL的普通液體培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)3天后，培養(yǎng)液用無菌水沖洗，至菌絲塊無色。將沖洗好的菌絲塊轉(zhuǎn)接到50mL致病蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。菌液抽濾、凍干后得到稻瘟菌分泌蛋白的提取物，－20℃保存。此方法可以誘導(dǎo)稻瘟病菌大量產(chǎn)生致病性相關(guān)蛋白，填補了國內(nèi)外稻瘟病菌致病機理研究中不能獲得致病蛋白的空白，意義重大。
文檔編號C12P21/02GK1807586SQ200510048728
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者李成云, 朱有勇, 周江鴻, 楊靜, 蘇源, 周曉罡, 李進斌, 王云月, 劉林, 業(yè)艷芬, 葉敏 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)