專利名稱：水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種水和土壤中微量馬鈴薯青枯病菌檢測(cè)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬鈴薯青枯病由Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)Yabuuchi et al引起的細(xì)菌性病害，是南方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的主要細(xì)菌性病害。每年因此造成的產(chǎn)量損失大約在10％-15％，發(fā)病嚴(yán)重的地塊產(chǎn)量損失達(dá)80％乃至失收，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。由于馬鈴薯青枯病為細(xì)菌性病害，植株感病是系統(tǒng)性侵染，而且青枯病可經(jīng)水、土壤和種薯傳播蔓延。在馬鈴薯無病種薯繁育中，水和土壤中微量細(xì)菌可能會(huì)成為健康種薯的侵染源，繼而使這些帶菌種薯成為歷年發(fā)病和遠(yuǎn)距離傳播的主要侵染源。解決這一危害的有效途徑就是在馬鈴薯無菌種薯生產(chǎn)中，避免在有病菌的土壤中種植馬鈴薯和避免澆灌帶菌水，保證種薯健康。常用的馬鈴薯青枯病菌鑒定檢測(cè)方法如革蘭氏染色法和血清學(xué)方法。革蘭氏染色法需要加上對(duì)菌體形態(tài)特征進(jìn)行觀察，對(duì)生理生化反應(yīng)特性進(jìn)行測(cè)定，才能最終判定，這種檢測(cè)方法需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化，試驗(yàn)的結(jié)果因培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)基成分和確定陰性陽性的標(biāo)準(zhǔn)不同而變化，穩(wěn)定性差，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于生產(chǎn)上的應(yīng)用。血清學(xué)方法盡管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點(diǎn)，在與其它相近病菌的交叉反應(yīng)或制備的抗血清不能和所有的待檢測(cè)的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在許多領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是利用各種生物所特有的基因組堿基序列，而發(fā)展起來的特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了細(xì)菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是這種技術(shù)要足夠的DNA模板濃度，實(shí)際上在某些條件下足夠數(shù)量的DNA很難獲得，如水體和土壤中目標(biāo)菌體有時(shí)極為微量，很難獲得足夠的目標(biāo)生物DNA用于PCR擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高效、準(zhǔn)確、靈敏的水和土壤中微量馬鈴薯青枯病菌的檢測(cè)技術(shù)。
通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
(1)機(jī)械離心富集A、收集水樣本500-1000ml，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾細(xì)，過80-100目網(wǎng)篩，加水800-1200ml，浸漬10-16小時(shí)，攪動(dòng)，取水相，在5000-6000rpm下離心5-8min，棄上清液相，加100-200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動(dòng)振蕩1-2min，在5000-6000rpm下離心1-2min，棄沉淀，取水相，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)。
(2)半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml，使用時(shí)加0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80-100ml，在無菌條件下加入機(jī)械離心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天；培養(yǎng)液變紅色進(jìn)行第(3)檢測(cè)，如培養(yǎng)液為其他顏色，則樣本中不帶有馬鈴薯青枯病菌。
(3)健康馬鈴薯塊接種檢測(cè)培養(yǎng)液變紅色，取300-500μl菌液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第4—第5天直接檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，如馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細(xì)菌粘液，即所檢樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌(圖1)；如未發(fā)病，則在5000-8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細(xì)菌。
(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA分子水平上的富集A、細(xì)菌裂解液制備取約0.5g收集到的細(xì)菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR擴(kuò)增。
B、PCR擴(kuò)增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設(shè)計(jì)特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應(yīng)程序，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。
25ul PCR反應(yīng)體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl
反應(yīng)程序T＝95℃ 5min C、PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5-10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于80-100V/cm下電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結(jié)果，可以看到1993bp(圖2)的擴(kuò)增片段。即所檢測(cè)的樣本中含有馬鈴薯青枯病細(xì)菌。
本發(fā)明的有益效果是，克服了常用的馬鈴薯青枯病菌鑒定檢測(cè)方法如革蘭氏染色法和血清學(xué)方法不足。革蘭氏染色法需要加上對(duì)菌體形態(tài)特征進(jìn)行觀察，對(duì)生理生化反應(yīng)特性進(jìn)行測(cè)定，才能最終判定，這種檢測(cè)方法需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化，試驗(yàn)的結(jié)果因培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)基成分和確定陰性陽性的標(biāo)準(zhǔn)不同而變化，穩(wěn)定性差，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于生產(chǎn)上的應(yīng)用。血清學(xué)方法盡管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點(diǎn)，在與其它相近病菌的交叉反應(yīng)或制備的抗血清不能和所有的待檢測(cè)的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了細(xì)菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是這種技術(shù)要足夠的DNA模板濃度，本發(fā)明通過三級(jí)富集法克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，在未能獲得足夠DNA模板濃度，如水體和土壤中目標(biāo)菌體有時(shí)極為微量，很難獲得足夠的目標(biāo)生物DNA時(shí)，仍用于PCR擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度。


圖1是經(jīng)本發(fā)明處理后，二級(jí)富集培養(yǎng)液接種馬鈴薯塊發(fā)生青枯病癥狀。
圖2是經(jīng)本發(fā)明處理后，馬鈴薯青枯病菌DNA分子水平上PCR擴(kuò)增的結(jié)果(1-馬鈴薯軟腐病菌，2-馬鈴薯環(huán)腐病菌，3-不帶有馬鈴薯青枯病菌土壤第二級(jí)富集后混合菌，4-第二級(jí)富集后，培養(yǎng)液顏色淡紅色，培養(yǎng)液中帶有馬鈴薯青枯病菌的混合菌，5-馬鈴薯青枯病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，6-井水水樣第二級(jí)富集后不含馬鈴薯青枯病菌的混合菌，7-1kb梯度分子標(biāo)記)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1、取水樣取一個(gè)飲用水的水庫(kù)水500ml，在15000rpm下離心10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml，使用時(shí)加入0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80ml，在無菌條件下加入機(jī)械離心富集液，于28-30℃，250rpm下振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)液變紅色。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測(cè)取500μl培養(yǎng)液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結(jié)果馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細(xì)菌粘液，即所檢水樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；與此同時(shí)，在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細(xì)菌。
4、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA分子水平上的富集A、細(xì)菌裂解液制備取約0.5g收集到的細(xì)菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，取裂解液1.0μl直接用于PCR擴(kuò)增。
B、PCR擴(kuò)增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設(shè)計(jì)特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應(yīng)程序，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增25ul PCR反應(yīng)體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl反應(yīng)程序T＝95℃ 5min C、PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于100V/cm下電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結(jié)果，可以看到1993bp的擴(kuò)增片段。即所檢測(cè)的樣本中含有馬鈴薯青枯病細(xì)菌。
實(shí)施例二
1、取水樣水樣來源于實(shí)例一中的同一水庫(kù)，但自一馬鈴薯種薯企業(yè)的入水口處經(jīng)紫外線處理過，取水1000ml，在15000rpm下離心10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集在實(shí)例一同樣條件下振蕩培養(yǎng)4天，培養(yǎng)液變成品紅色。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測(cè)取500μl培養(yǎng)液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結(jié)果馬鈴薯塊未出現(xiàn)典型青枯病癥狀。在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細(xì)菌。
4、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA分子水平上的富集和富集產(chǎn)物的檢測(cè)所用方法同實(shí)例一，結(jié)果仍然檢測(cè)到了一條1993bp的擴(kuò)增片段。表明經(jīng)紫外線處理后，入水口中的水含的青枯病菌量非常低，經(jīng)本發(fā)明的三級(jí)富集仍能有效地檢測(cè)到馬鈴薯青枯病菌。
實(shí)施例三1、取土樣自一發(fā)生馬鈴薯青枯病的地塊耕作層5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表層5cm深土壤100g和200g，碾細(xì)，過80目網(wǎng)篩，加水1200ml，浸漬16小時(shí)，攪動(dòng)，取水相，在6000rpm下離心8min，棄上清液相，加200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動(dòng)振蕩2min，在5000rpm下離心2min，棄沉淀，取水相，在15000rpm下離心8min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集同實(shí)例一培養(yǎng)條件，發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表層5cm深土壤100g和200g，培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)液顏色分別為發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層的兩個(gè)樣本全變紅色，荒坡地表層土5cm深土壤的兩個(gè)樣本未變紅色，而呈半混濁狀。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測(cè)同實(shí)例一的第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結(jié)果來自發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g的兩個(gè)樣本接種菌液使馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細(xì)菌粘液，即所檢水樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；而來自荒坡上表層5cm深土壤100g和200g的兩個(gè)樣本未見發(fā)病。與此同時(shí)，在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細(xì)菌。
4、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA分子水平上的富集和富集產(chǎn)物的檢測(cè)所用方法同實(shí)例一，結(jié)果在來自發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g的兩個(gè)樣本檢測(cè)到了一條1993bp的擴(kuò)增片段，而在來自荒坡上表層5cm深土壤100g和200g的兩個(gè)樣本中未見到這一1993bp的擴(kuò)增片段。表明采用土壤中馬鈴薯青枯病菌三級(jí)富集檢測(cè)法，發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層土壤中兩個(gè)土樣均檢測(cè)到馬鈴薯青枯病菌，荒坡上表層5cm土壤中兩個(gè)土樣均不帶青枯病菌。
權(quán)利要求
1.一種水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測(cè)方法，其步驟如下(1)機(jī)械離心富集A、收集水樣本500-1000ml，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾細(xì)，過80-100目網(wǎng)篩，加水800-1200ml，浸漬10-16小時(shí)，攪動(dòng)，取水相，在5000-6000rpm下離心5-8min，棄上清液相，加100-200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動(dòng)振蕩1-2min，在5000-6000rpm下離心1-2min，棄沉淀，取水相，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機(jī)械離心富集液)；(2)半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基80-100ml，在無菌條件下加入機(jī)械離心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天；培養(yǎng)液變紅色進(jìn)行第(3)檢測(cè)，如培養(yǎng)液為其他顏色，則樣本中不帶有馬鈴薯青枯病菌；(3)健康馬鈴薯塊接種檢測(cè)培養(yǎng)液變紅色，取300-500μl菌液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃，第4至第5天直接檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，如馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細(xì)菌粘液，即所檢樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；如未發(fā)病，則在5000-8000rpm下離心培養(yǎng)液，棄上清和收集細(xì)菌；(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA分子水平上的富集A、細(xì)菌裂解液制備取約0.5g收集到的細(xì)菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR擴(kuò)增。B、PCR擴(kuò)增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設(shè)計(jì)特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應(yīng)程序，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增25ul PCR反應(yīng)體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0ul反應(yīng)程序T＝95℃ 5min C、PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5-10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于80-100V/cm下電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結(jié)果，可以看到1993bp的擴(kuò)增片段，即所檢測(cè)的樣本中含有馬鈴薯青枯病細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水和土壤中馬鈴薯青枯病菌檢測(cè)方法，其特征是，所述半選擇性TZC培養(yǎng)基由葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml構(gòu)成，使用時(shí)加入氯化三苯四氮唑(TZC)至終濃度為0.005％。
全文摘要
本發(fā)明為一種水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測(cè)方法。它采用機(jī)械離心富集，TZC半選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)富集和DNA分子水平上的PCR擴(kuò)增富集等三級(jí)富集方法，檢測(cè)水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌。它靈敏、準(zhǔn)確，在馬鈴薯無病種薯繁育和大田生產(chǎn)上有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1793867SQ20051004873
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者何月秋, 趙明富, 姬廣海, 周惠萍 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)