專利名稱：一種治療斑禿藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療斑禿藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
斑禿是皮膚科臨床常見疾病之一，占皮膚科門診量的10～15％，由于生活節(jié)奏的加快，這一數(shù)字還有進(jìn)一步升高的趨勢，斑禿進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)槠斩d和全禿，這給患者身心帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。在斑禿的的治療中，多以全身或局部應(yīng)用激素，但長期使用激素會產(chǎn)生一系列明顯的副作用如庫欣氏征、皮膚變薄等。如何減少或不用激素治療斑禿是目前亟待解決的問題。
一般認(rèn)為，人毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的發(fā)育及周期性生長調(diào)控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細(xì)胞對調(diào)節(jié)毛囊生長和發(fā)育的機(jī)制，必須從人毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今后毛囊研究的重要內(nèi)容之一。我們在建立人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用低傳代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細(xì)胞有效誘導(dǎo)為凝集性生長狀態(tài)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步分析人毛乳頭細(xì)胞生長活性蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性，我們將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，初步應(yīng)用于斑禿患者，發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療斑禿藥物的制備方法。
本發(fā)明藥物制備的方案是通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)的1.試劑和材料低糖培養(yǎng)基(DMEM)購自Sigma公司。Hepes購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科提供。
2.藥物制備的方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備1).人AB型血清的制備a)采集健康獻(xiàn)血員(經(jīng)查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時(shí)；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的人AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用，也可直接行下例步驟h)；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時(shí)；f)將人AB型血清室溫放置2小時(shí)；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時(shí)；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2).基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3).人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集(1)取意外死亡的正常健康青年(經(jīng)查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭細(xì)胞(參見鐘白玉，楊希川，楊衛(wèi)兵，等。二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細(xì)胞[J]。中華皮膚科雜志，2003；36(7)406。)；(2)培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(3)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在IK16型離心機(jī)(美國SIGMA公司)中3000rpm離心10分鐘；(4)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清(小心不能攪起底部的沉淀)，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 4).人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液凍干粉的制備(1)凍干室紫外線消毒4小時(shí)；(2)操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；(3)將凍干瓶放入凍干機(jī)中；(4)凍干過程I -40℃4小時(shí)II -20℃3小時(shí)III-5℃ 10小時(shí)IV 5℃ 4小時(shí)V 15℃ 3小時(shí)VI 25℃ 5小時(shí)(5)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；(6)打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；(7)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 治療斑禿藥物的理化特性為顏色白色；形態(tài)粉末狀；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是人毛乳頭細(xì)胞為分泌性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)可分泌許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可促進(jìn)毛囊的生長和發(fā)育，在體外實(shí)驗(yàn)我們已證明其有確切的生物學(xué)活性，但其應(yīng)用于臨床還未見報(bào)道，我們在原有的培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，改進(jìn)其培養(yǎng)基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養(yǎng)出人毛乳頭細(xì)胞，我們收集培養(yǎng)過低傳代人毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于臨床治療斑禿，觀察其治療效果，發(fā)現(xiàn)有確切的治療作用，取得了良性的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
應(yīng)用本發(fā)明制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優(yōu)于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清均對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)，本發(fā)明用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，較以前用小牛血清培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞在技術(shù)上取得了突破，這就為本藥物應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)，這也是本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)的核心所在。
具體實(shí)施例方式
藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)。藥物的生物安全性實(shí)施例1).小鼠急性毒性試驗(yàn)我們選用7～9周齡、體重為18～22g的昆明種小鼠。按預(yù)試驗(yàn)公比0.8設(shè)立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個(gè)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后立即觀察、記錄動(dòng)物的中毒反應(yīng)、死亡情況及時(shí)間，連續(xù)觀察14天。
2).家兔熱原試驗(yàn)選3只體重為1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔1小時(shí)測量體溫1次，共3次。
3).細(xì)菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種于普通血平板上，培養(yǎng)48小時(shí)后觀察結(jié)果。
4).真菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10日后觀察結(jié)果。
試驗(yàn)結(jié)果小鼠急性毒性試驗(yàn)顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各組動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)明確的中毒癥狀，在整個(gè)試驗(yàn)期限內(nèi)無動(dòng)物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗(yàn)顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各動(dòng)物的體溫變化均符合熱原試驗(yàn)的要求。細(xì)菌和真菌培養(yǎng)均未見細(xì)菌和真菌生長。
藥物的臨床實(shí)施例選擇50例年齡在12～64歲的斑禿患者為人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療組，其中26例為人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療組中多發(fā)性斑禿患者，選擇與人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療患部距離在2厘米以上的患部作為去炎松治療組；選擇與人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液距離在5厘米以上的患部作為空白自身對照患部，以上3組均常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射治療，2月后觀察療效。
表1各組斑禿治療2月后情況(％)

*與空白對照組比較，P＜0.01，*與去炎松組比較，P＜0.01人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在通過生物安全鑒定后，我們在患者知情同意的情況下應(yīng)用于患部。50例人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療的斑禿患者中，除2例無效外其余均有一定療效，這與去炎松治療組比較取得了良好的療效。人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療組中有29例為復(fù)發(fā)性斑禿患者且多次臨床治療無效，在這29例患者中除1例無效外其余均有一定療效，說明人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在治療復(fù)發(fā)性斑禿上明顯優(yōu)于患者以前治療所使用過的方法。在人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療的50例斑禿患者中，我們選擇26例多發(fā)性斑禿患者，在同一患者頭部不同的斑禿患部分別應(yīng)用人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液和去炎松，發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在治療斑禿時(shí)，其促進(jìn)頭發(fā)生長的速度明顯快于去炎松治療組，而且新生毛發(fā)在光澤度上也明顯優(yōu)于去炎松治療組。人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療斑禿患者時(shí)新生毛發(fā)的生長先是呈島狀生長的，而去炎松則是呈現(xiàn)平原狀生長，說明毛發(fā)的生長是有一定的相互促進(jìn)作用，也可能與一定的毛乳頭生長活性蛋白濃度依賴有關(guān)。我們用利多卡因生理鹽水溶液作空白對照，發(fā)現(xiàn)有3例新發(fā)斑禿患者有一定療效，而復(fù)發(fā)性斑禿無一有效，說明對于新發(fā)的斑禿，用一定的刺激是有一定的療效的，而復(fù)發(fā)性斑禿用普通刺激則效果較差，這也與過去臨床上用生姜、辣椒膏、石碳酸等外用治療斑禿結(jié)果相一致。
權(quán)利要求
1.一種治療斑禿藥物的制備方法，其特征在于用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。(1)上述人AB型血清制備的步驟為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時(shí)；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，e)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；f)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?3)上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存?zhèn)溆谩?4)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集過程為a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭；b)培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；c)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機(jī)中離心；d)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-20℃凍存?zhèn)溆谩?5)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為a)凍干室紫外線消毒4小時(shí)；b)操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；c)將凍干瓶放入凍干機(jī)中；d)連續(xù)凍干過程I -40℃4小時(shí)II -20℃3小時(shí)III -5℃ 10小時(shí)IV 5℃ 4小時(shí)V 15℃ 3小時(shí)VI 25℃ 5小時(shí)e)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療斑禿藥物的制備方法，其特征在于上述人AB型血清制備的步驟也可為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時(shí)；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時(shí)；f)將人AB型血清室溫放置2小時(shí)；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時(shí)；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療斑禿藥物的制備方法。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基按15ml人AB型血清、85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03g L－谷氨酰胺配比構(gòu)成。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清為人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液，將所收集的人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制備成凍干粉。本發(fā)明所制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優(yōu)于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)，克服激素治療斑禿給人體帶來的副作用。
文檔編號C12N5/08GK1824310SQ200510048870
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者羅洋 申請人:羅洋