專利名稱：構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制植物病毒病的方法，尤其涉及一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法。
背景技術(shù)：
植物病毒是侵染蔬菜花卉藥材和大田作物的細(xì)胞內(nèi)致病的微生物，因?yàn)槠浒凑占闹鞯募?xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行基本的代謝和復(fù)制侵染過程，因此其不能像細(xì)菌和真菌等病原微生物那樣通過藥物治療達(dá)到根除效果。迄今，對植物病毒進(jìn)行控制仍然沒有“特效藥”，控制的主要方法是預(yù)防其侵染。
實(shí)踐證明預(yù)先接種弱病毒株能夠干擾其后侵染的強(qiáng)病毒株的危害，降低其影響，達(dá)到抗病增產(chǎn)和改善作物品質(zhì)的作用。以黃瓜花葉病毒(CMV)為例，該病毒能夠侵染1,000多種植物，可經(jīng)75種蚜蟲傳播，也是目前世界范圍內(nèi)寄主植物最多、分布最廣、危害最嚴(yán)重的植物病毒之一。預(yù)防病毒傳播媒介昆蟲和獲得無病毒繁殖材料并不是在任何情況下均能夠有效實(shí)施。用弱病毒株進(jìn)行預(yù)防接種的方法是行之有效的方法之一。CMV和其它一些植物病毒往往攜帶一種伴隨侵染的亞病毒因子——衛(wèi)星RNA，它們是“寄生于病毒的病毒”。CMV衛(wèi)星RNA是伴隨輔助病毒CMV復(fù)制的一類低分子量RNA(330-405bp)，不能獨(dú)立復(fù)制。因此對于CMV衛(wèi)星RNA而言，CMV就是輔助病毒；此外，煙草花葉病毒(TMV)、煙草壞死病毒(TNV)、竹子花葉病毒(BaMV)、草莓潛隱環(huán)斑病毒(SLRV)等許多植物病毒均作為輔助病毒攜帶衛(wèi)星RNA。大多數(shù)衛(wèi)星RNA能抑制輔助病毒RNAs的復(fù)制，并改變寄主植物的癥狀表達(dá)；衛(wèi)星RNA有其特異的核苷酸序列，與輔助病毒RNA沒有序列同源性。既然許多衛(wèi)星RNA能抑制病毒復(fù)制，減輕病毒的癥狀，那么把致弱病毒的衛(wèi)星RNA加入自然界流行的輔助病毒中，并預(yù)先接種待保護(hù)的植物，就可能達(dá)到防病效果。根據(jù)這一構(gòu)思我國科學(xué)家組建了衛(wèi)星RNA生防制劑(BCA).并于1983年在國際上首次報(bào)道了用衛(wèi)星RNA防治黃瓜花葉病毒取得成功。
迄今為止，獲得CMV弱病毒株的方法之一是，通過RNA的電泳分離獲得純化的衛(wèi)星RNA，然后盡快將衛(wèi)星RNA與CMV進(jìn)行共同感染。但是，這一方法的局限在于直接通過衛(wèi)星RNA的制備純化具有許多技術(shù)困難，辟如RNA很不穩(wěn)定，不容易獲得一定純度和濃度的衛(wèi)星RNA，通過電泳制備難以在一個(gè)輔助病毒基因組中加入不同的衛(wèi)星RNA，同時(shí)，不能通過基因修飾獲得致弱效果更好的衛(wèi)星。
獲得弱病毒株的另一方法也是最常見的方法是在自然界篩選本身對所保護(hù)的對象作物具備侵染性，而在作物上引起的癥狀輕微的天然弱病毒株，通過接種保護(hù)試驗(yàn)，驗(yàn)證其保護(hù)效果和安全性，然后進(jìn)行田間釋放。就CMV和大部分植物病毒而言，這些天然弱病毒株多數(shù)攜帶衛(wèi)星RNA。但是從自然界本身篩選天然弱病毒株的工作量非常大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，以分子生物學(xué)和現(xiàn)代植物病理學(xué)的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，提供一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，在強(qiáng)病毒株或普通病毒株的基因組中通過基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄后添加外源衛(wèi)星RNA。
一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法的步驟如下1)根據(jù)植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行測序，確定其序列；2)將全長衛(wèi)星RNA的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；3)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，2-55天，在接種葉或鄰近葉片上，再接種上述體外轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，獲得假重組；或者將轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與輔助病毒的總RNA或從強(qiáng)病毒株侵染的植株組織中提取的總RNA，同時(shí)接種敏感的系統(tǒng)寄主，獲得假重組。假重組后1-20天，取接種葉擴(kuò)大接種，獲得具備一個(gè)或者多個(gè)衛(wèi)星RNA的弱病毒株。
另一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法的步驟如下1)根據(jù)植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行測序，確定其序列；2)在進(jìn)行衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄前，在DNA水平上對衛(wèi)星RNA之cDNA序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得衛(wèi)星RNA因子；3)將上述經(jīng)點(diǎn)突變改造獲得的衛(wèi)星RNA的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；4)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，2-55天，在接種葉或鄰近葉片上，再接種上述體外轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，獲得假重組；或者將轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與輔助病毒的總RNA或從強(qiáng)病毒株侵染的植株組織中提取的總RNA，同時(shí)接種敏感的系統(tǒng)寄主，獲得假重組。假重組后1-20天，取接種葉擴(kuò)大接種，獲得具備一個(gè)或者多個(gè)衛(wèi)星RNA的弱病毒株。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的方法不僅可以大大提高篩選植物病毒弱病毒株的速度，同時(shí)，還使得一些難以達(dá)到的目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)，尤其是通過在cDNA水平上的衛(wèi)星RNA序列改造，可以獲得性狀更優(yōu)的衛(wèi)星RNA變異株，提高衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的弱病毒保護(hù)效果。弱病毒保護(hù)的番茄“烏心果病”和類似病癥的發(fā)病率低于3％；非保護(hù)番茄“烏心果病”和類似病癥的發(fā)病率高于30％，番茄果實(shí)品質(zhì)明顯提高。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案包括以下步驟(1)根據(jù)序列分析軟件Genestar分析確定植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件Primer five設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行測序，確定其序列；(2)將全長衛(wèi)星RNA的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(3)在進(jìn)行衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄前，可根據(jù)需要和設(shè)計(jì)，事先在DNA水平上對衛(wèi)星RNA之cDNA序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得致弱效果更為理想的衛(wèi)星RNA因子。對序列的改造既可以是堿基的插入，也可以是堿基的缺失(或序列刪除)，也可以是序列的替換。
(4)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，2-55天，在接種葉或鄰近葉片上，再接種體外轉(zhuǎn)錄的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲得假重組，假重組后1-20天，取接種葉擴(kuò)大接種。然后通過測定系統(tǒng)葉組織中的dsRNA，或通過RT-PCR等分子生物學(xué)方法確定假重組結(jié)果和新病毒株的穩(wěn)定性。
也可以選擇將轉(zhuǎn)錄的衛(wèi)星RNA與輔助病毒的總RNA，或從強(qiáng)病毒株侵染的植株組織中提取的總RNA同時(shí)接種敏感的系統(tǒng)寄主，假重組后1-20天，優(yōu)選2-6天取接種葉擴(kuò)大接種到其它系統(tǒng)寄主上獲得新的弱病毒株。
根據(jù)需要可以在一個(gè)輔助病毒基因組中通過假重組整合多個(gè)衛(wèi)星RNA在一個(gè)輔助病毒基因組中用衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄和體外重組方法，同時(shí)加入2-20種衛(wèi)星RNA，可獲得同時(shí)具備多個(gè)衛(wèi)星RNA的弱病毒株。
(5)本發(fā)明采用的鑒定假重組效果的dsRNA檢測方法是根據(jù)CF11纖維素在11-18％乙醇含量的溶液中對雙鏈RNA特異性吸附特征，進(jìn)行親和層析的制備和純化輔助病毒和衛(wèi)星RNA特異的dsRNA階段，用凝膠電泳檢測條帶的大?。灰话忝總€(gè)樣品用0.5-5克系統(tǒng)侵染的植物材料。
(6)將獲得的假重組毒株在擴(kuò)大的寄主植物，包括模式植物和多種經(jīng)濟(jì)作物上，篩選鑒定，確定假重組毒株是弱致病或非致病的毒株，并進(jìn)一步確定其安全性。
(7)當(dāng)新病毒株的弱病毒保護(hù)效果不夠理想或其它條件需要時(shí)，在已經(jīng)獲得的假重組病毒株的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步添加其它序列和大小的致弱衛(wèi)星RNA，以獲得更為理想的弱病毒株。
(8)對新毒株在不同的寄主植物上應(yīng)用，獲得抗病增產(chǎn)和改善品質(zhì)的效果。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1以黃瓜花葉病毒(CMV)半夏分離物CMV-BX為強(qiáng)病毒株，以一株來自十字花科白菜的衛(wèi)星RNA YI(339nt)為衛(wèi)星RNA因子，采用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和重組來獲得攜帶衛(wèi)星RNA假重組CMV弱病毒株。其PCR上游引物為5’＞TAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTTGATGG＜3’；其反向引物為5’＞GGGTCCTGTAGAGGAATGTG＜3’。首先在CMV系統(tǒng)寄主(心葉煙)上接種不含衛(wèi)星RNA的CMV-BX，4天后用衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對接種葉片進(jìn)行二次接種，2天后將接種葉組織，勻漿后轉(zhuǎn)接其他心葉煙，25℃下，培養(yǎng)7天后通過提取病毒ds-RNA確認(rèn)重組效果，獲得對半夏CMV有保護(hù)作用的弱病毒株CMV-BXs1。
實(shí)施例2以黃瓜花葉病毒(CMV)半夏分離物CMV-BX為強(qiáng)病毒株，以一株來自十字花科白菜的衛(wèi)星RNA YI(339nt)為衛(wèi)星RNA因子，首先在衛(wèi)星RNA的cDNA水平上，采用易錯(cuò)PCR方法進(jìn)行突變研究，獲得一株新的336nt的衛(wèi)星RNA的cDNA克隆，利用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來獲得新的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將其接種在預(yù)先侵染CMV-BX的系統(tǒng)寄主(心葉煙)上，2天后將接種組織勻漿后轉(zhuǎn)接其他心葉煙，25℃下，7天后通過提取病毒ds-RNA檢測確認(rèn)重組效果，獲得對半夏CMV有保護(hù)作用的攜帶衛(wèi)星RNA人工突變株的弱病毒株CMV-BXs2。
實(shí)施例3.
以煙草花葉病毒(TMV)番茄分離物為強(qiáng)病毒株，以一株來自煙草的TMV衛(wèi)星RNA為衛(wèi)星RNA因子，采用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來獲得攜帶衛(wèi)星RNA假重組TMV弱病毒株。先在TMV系統(tǒng)寄主(番茄)上接種不含衛(wèi)星的TMV，2天后用衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對接種葉片進(jìn)行二次接種，2天后將接種組織勻漿后轉(zhuǎn)接更多番茄植株，25℃下，7天后通過提取病毒ds-RNA檢測確認(rèn)重組效果，獲得對番茄TMV有保護(hù)作用的弱病毒株TMV-s。
實(shí)施例4.
以黃瓜花葉病毒(CMV)番茄分離物CMV-FQ為強(qiáng)毒株，以一株來自十字花科白菜的衛(wèi)星RNA-YI(339nt)和一株來自茄科辣椒的衛(wèi)星RNA-Yns(368nt)為衛(wèi)星RNA因子。先在CMV系統(tǒng)寄主(心葉煙)上接種不含衛(wèi)星RNA的CMV-FQ；接種2天后，采用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得兩株衛(wèi)星RNA的全長RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對接種葉進(jìn)行二次接種，2天后將接種組織勻漿后轉(zhuǎn)接更多的系統(tǒng)寄主植株(心葉煙、番茄、西葫蘆等)，25℃下培養(yǎng)，7天后通過提取病毒ds-RNA檢測確認(rèn)重組效果，獲得對番茄CMV有保護(hù)作用的攜帶有兩株衛(wèi)星RNA因子的弱病毒株CMV-FQss。
實(shí)施例5以黃瓜花葉病毒(CMV)番茄分離物CMV-FQ為強(qiáng)毒株，以一株來自十字花科白菜的衛(wèi)星RNA-YI(339nt)為衛(wèi)星RNA因子。先在系統(tǒng)寄主(心葉煙)上不含衛(wèi)星RNA的CMV-FQ，接種5天后，提取接種組織的總RNA；將其與采用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得的衛(wèi)星RNA-Yns的全長RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，接種于系統(tǒng)寄主植株上；2天后將接種組織勻漿后轉(zhuǎn)接更多的系統(tǒng)寄主植株(心葉煙、番茄、西葫蘆等)，25℃下培養(yǎng)，7天后通過提取病毒ds-RNA檢測確認(rèn)重組效果，獲得對番茄CMV有保護(hù)作用的攜帶有衛(wèi)星RNA-YI的弱病毒株CMV-FQs。
實(shí)施例6以弱病毒株CMV-BXs為CMV毒株，以一株來自茄科辣椒的衛(wèi)星RNA-Yns(368nt)為衛(wèi)星RNA因子。先在系統(tǒng)寄主(心葉煙)上接種含衛(wèi)星RNA-YI的CMV-BXs；接種2天后，采用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得衛(wèi)星RNA-Yns的全長RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對接種葉進(jìn)行二次接種，2天后將接種組織勻漿后轉(zhuǎn)接更多的系統(tǒng)寄主植株(心葉煙、番茄、西葫蘆等)，25℃下培養(yǎng)，7天后通過提取病毒ds-RNA檢測確認(rèn)重組效果，獲得對半夏CMV有保護(hù)作用的攜帶有兩株衛(wèi)星RNA因子的弱病毒株CMV-BXss。
實(shí)施例7，在分離自煙草的CMV壞死株系YNs1添加1個(gè)衛(wèi)星RNA(343nt)，獲得弱病毒株Y1s的抗病毒效果是病情指數(shù)下降33％，小區(qū)試驗(yàn)顯示產(chǎn)量增加16--23％；進(jìn)一步添加334~396nt的衛(wèi)星RNA19個(gè)，其中11個(gè)衛(wèi)星RNA能夠穩(wěn)定共存，獲得新的弱病毒株Y11s的接種試驗(yàn)顯示其病情指數(shù)下降63％以上，小區(qū)試驗(yàn)顯示產(chǎn)量增加28~123％。
實(shí)施例8，在半夏脫病毒快繁過程中，先獲得脫病毒種苗，然后接種人工構(gòu)建的弱病毒株CMV-BXss，再將攜帶弱病毒株的半夏通過組培快繁擴(kuò)大，獲得工廠化生產(chǎn)的抗CMV半夏種苗。2年栽培試驗(yàn)顯示100％的攜帶弱病毒株的擴(kuò)繁苗均攜帶CMV，但是，沒有形成明顯癥狀；對照(無病毒種苗)在栽培2年后基本上都表現(xiàn)病毒侵染癥狀；弱病毒病害種苗產(chǎn)量高于不保護(hù)種苗60％以上，半夏品質(zhì)明顯提高。
實(shí)施例9，將CMV弱病毒FQss和TMV弱病毒TMV-s同時(shí)接種番茄幼苗，40天后進(jìn)入大田栽培，弱病毒保護(hù)番茄“烏心果病”和類似病癥的發(fā)病率低于3％；非保護(hù)番茄“烏心果病”和類似病癥的發(fā)病率高于30％，番茄果實(shí)品質(zhì)明顯提高。
對照例1以黃瓜花葉病毒(CMV)半夏分離物CMV-BX為強(qiáng)病毒株，以一株來自十字花科白菜的衛(wèi)星RNA YI(339nt)為衛(wèi)星RNA因子，采用直接分離衛(wèi)星RNA來獲得攜帶衛(wèi)星RNA假重組CMV弱病毒株。首先在CMV系統(tǒng)寄主(心葉煙)上接種含衛(wèi)星RNA的CMV-YI，接種5天后提取組織總RNA，進(jìn)行RNA電泳分離衛(wèi)星RNA，割膠回收衛(wèi)星RNA；用衛(wèi)星RNA回收產(chǎn)物在接種CMV-BX 4天的心葉煙上對接種葉片進(jìn)行二次接種，2天后將接種葉組織，勻漿后轉(zhuǎn)接其他心葉煙，25℃下，培養(yǎng)7天后通過提取病毒ds-RNA確認(rèn)重組效果。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)未獲得對半夏CMV有保護(hù)作用的弱病毒株CMV-BXs1，組織中侵染有原輔助病毒CMV-YI。以電泳分離CMV中的衛(wèi)星RNA，其活性的保持具有一定的難度，完全與基因組的分離也需要較高的技術(shù)性，其工作的難度較體外重組系統(tǒng)要大得多。
對照例2自然分離攜帶衛(wèi)星RNA的CMV分離物作為弱毒株，自2003年3月-2004年1月，每周采集田間具有明顯CMV侵染癥狀的茄科樣品8株，通過提取病毒ds-RNA確認(rèn)是否存在攜帶衛(wèi)星RNA的CMV分離物，共獲得攜帶衛(wèi)星RNA的CMV分離物四株，對其進(jìn)行病毒分離鑒定后，實(shí)驗(yàn)室僅保存有三株分別攜帶有衛(wèi)星RNA的CMV分離物CMV-YI；CMV-LJ；CMV-TJ；其中僅CMV-YI具有明顯的弱毒病癥，而其他兩株衛(wèi)星RNA的存在并無致弱效果。分離純化工作長達(dá)一年，工作量非常之大，其工作效率較體外重組系統(tǒng)要低得多。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于方法步驟如下1)根據(jù)植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行測序，確定其序列；2)將全長衛(wèi)星RNA的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；3)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，2-55天，在接種葉或鄰近葉片上，再接種上述體外轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，獲得假重組；或者將轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與輔助病毒的總RNA或從強(qiáng)病毒株侵染的植株組織中提取的總RNA，同時(shí)接種敏感的系統(tǒng)寄主，獲得假重組。假重組后1-20天，取接種葉擴(kuò)大接種，獲得具備一個(gè)或者多個(gè)衛(wèi)星RNA的弱病毒株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述設(shè)計(jì)的PCR引物分為上游引物和下游引物，上游引物為5’>TAAGCTTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNN<3’，其中TAAGCTTAATACGACTCACTATA為T7啟動(dòng)之序列，緊隨其后的是1-2個(gè)G；N為所需要轉(zhuǎn)錄的衛(wèi)星RNA對應(yīng)序列，其長度為3-30；進(jìn)行衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄的下游引物為衛(wèi)星RNA的反向引物。
3.一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于方法步驟如下1)根據(jù)植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行測序，確定其序列；2)在DNA水平上對衛(wèi)星RNA之cDNA序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得衛(wèi)星RNA因子；3)將上述經(jīng)點(diǎn)突變改造獲得的衛(wèi)星RNA的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；4)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，2-55天，在接種葉或鄰近葉片上，再接種上述體外轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，獲得假重組；或者將轉(zhuǎn)錄的1種或2-20種衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與輔助病毒的總RNA或從強(qiáng)病毒株侵染的植株組織中提取的總RNA，同時(shí)接種敏感的系統(tǒng)寄主，獲得假重組。假重組后1-20天，取接種葉擴(kuò)大接種，獲得具備一個(gè)或者多個(gè)衛(wèi)星RNA的弱病毒株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述cDNA序列進(jìn)行點(diǎn)突變是堿基的插入、堿基的缺失、序列刪除或序列的替換。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述設(shè)計(jì)的PCR引物分為上游引物和下游引物，上游引物為5’>TAAGCTTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNN<3’，其中TAAGCTTAATACGACTCACTATA為T7啟動(dòng)之序列，緊隨其后的是1-2個(gè)G；N為所需要轉(zhuǎn)錄的衛(wèi)星RNA對應(yīng)序列，其長度為3-30；進(jìn)行衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄的下游引物為衛(wèi)星RNA的反向引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建植物病毒弱病毒株的方法。步驟如下1)根據(jù)植物病毒衛(wèi)星RNA兩端保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，獲得衛(wèi)星RNA的cDNA，將全長衛(wèi)星RNA的cDNA構(gòu)建到質(zhì)粒上，然后進(jìn)行測序，確定其序列；2)將全長衛(wèi)星RNA的cDNA或者序列改造后的cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得純化的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；3)預(yù)先接種強(qiáng)毒株至系統(tǒng)寄主，在接種葉或鄰近葉片上，再接種上述體外轉(zhuǎn)錄的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲得假重組，假重組后，取接種葉擴(kuò)大接種，獲得具備衛(wèi)星RNA的弱病毒株。本發(fā)明的方法大大提高篩選植物病毒弱病毒株的速度，通過在cDNA水平上的衛(wèi)星RNA序列改造，可以獲得性狀更優(yōu)的衛(wèi)星RNA變異株，提高衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的弱病毒保護(hù)效果，明顯提高果實(shí)品質(zhì)。
文檔編號C12N7/01GK1654638SQ20051004895
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日
發(fā)明者陳集雙, 竺錫武, 金波, 廖乾生, 商晗武, 陳海敏 申請人:浙江理工大學(xué)