專(zhuān)利名稱(chēng)：適于原核表達(dá)系統(tǒng)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工合成的人促紅細(xì)胞生成素基因，具體地說(shuō)涉及可在大腸桿菌中高效表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因。
本發(fā)明還涉及含有重組人促紅細(xì)胞生成素的載體和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明重組人紅細(xì)胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素，能刺激骨髓中的紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與增殖，在紅細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中起著重要的作用，是紅細(xì)胞形成的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，在臨床上可用于治療各種貧血性疾病。
美國(guó)科學(xué)家在1985年首次成功克隆了人EPO基因，為單考貝基因，定位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂7q21-22區(qū)域。整個(gè)基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，編碼193個(gè)氨基酸。其中前端27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)由165個(gè)氨基酸分子組成(EPO分子在后加工修飾過(guò)程中其C-末端Arg166位被切除)。1986-1987年Joseph Eschbath博士等人首次將rhEPO用于臨床病人，開(kāi)始了臨床應(yīng)用驗(yàn)證(Cotes PM，et al.Determination of serum immunoreactive erythropoietin in the investigation oferythrocytosis.N Engl J Med 1986；315283～287.Eschbach JW，et al.Correction of theanemia of end-stage renal disease with recombinant human erythropoietinrusults of acombined phase I and II clinical trials.N Engl J Med 1987；31673～77.Schaefer R M，et，al.Therapy of renal anemia with recombinant human erythropoietin.Dtsch MedWochenschr 1988；113125～129.Matsumoto T，et al.Effect of recombinant humanerythropoietin on cancer drug-induced-anemia.Br J Haematol 1990；75463～468.及Adamson J W.Cytokine biology.Implications for transfusion medicine.Cancer1991；672708～2711.)。
EPO分子是一種含唾液酸的酸性糖蛋白，對(duì)熱(在80℃條件下不變性)和酸堿(穩(wěn)定范圍在PH3.5～10.0之間)較為穩(wěn)定。蛋白質(zhì)肽鏈中Cys161與Cys7、Cys29和Cys33之間分別形成兩對(duì)二硫鍵，其中Cys7和Cys161之間的二硫鍵對(duì)于EPO的生物活性至關(guān)重要，如果二硫鍵被還原，EPO將喪失其生物活性。EPO分子的四個(gè)糖基化位點(diǎn)分別在Asn38、Asn24、Asn83和Ser126上，前三者為N-糖鏈，后者為O-糖鏈。糖鏈的分技程度不同，有雙末梢、三末梢或四末梢，其中四末梢最為常見(jiàn)，由于EPO糖基結(jié)構(gòu)部分占整個(gè)分子量的30-40％，其糖鏈分枝程度的不同使EPO的分子量在30～40KD之間。研究結(jié)果表明，糖鏈的分枝程度對(duì)EPO在體內(nèi)的生物活性有影響，N-端糖鏈的高度分枝對(duì)其維持生物體內(nèi)生物活性是必要的。去唾液酸或去糖基化不影響在體外的生物活性，但卻大大縮短了在體內(nèi)的半衰期(主要經(jīng)肝細(xì)胞吸附代謝)，結(jié)果使其完全不能表現(xiàn)出體內(nèi)生物學(xué)活性。只有EPO分子被充分糖基化后，才能在體內(nèi)才表現(xiàn)出生物活性。因此糖鏈結(jié)構(gòu)的存在對(duì)EPO在體內(nèi)的生物活性至關(guān)重要。
通過(guò)DNA重組技術(shù)，將人EPO基因轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)后，可由CHO細(xì)胞大量合成重組的人EPO(rhEPO)。rhEPO分子由肽鏈及不同糖基化程度的幾個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)組成，分子大小和生物學(xué)活性等方面均與人內(nèi)源性EPO相同，但在唾液酸含量上存在微小的差別。EPO去糖基后雖然在體外有生物活性，但在體內(nèi)生物活性喪失。1989年6月美國(guó)Amgen公司生產(chǎn)的rhEPO正式獲得美國(guó)FDA注冊(cè)許可，用于臨床治療慢性腎衰竭合并貧血癥。訖今為止近十年的臨床應(yīng)用的結(jié)果表明rhEPO的療效顯著，副作用小，在美國(guó)的年銷(xiāo)售額就達(dá)數(shù)十億美元，是訖今開(kāi)發(fā)的最為成功的生物技術(shù)藥品之一。
但由于其價(jià)格相對(duì)昂貴，使用頻度較高，造成醫(yī)療總體費(fèi)用太高。為了減輕病人在使用rhEPO時(shí)的費(fèi)用負(fù)擔(dān)，使更多的適應(yīng)癥病人能夠有能力接受rhEPO治療，國(guó)內(nèi)外許多廠家都在研究增加rhEPO的生物利用度，減少注射劑量或次數(shù)的方法。Amgen公司第二代長(zhǎng)效的EPO制劑(Aranesp)已在2002年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市銷(xiāo)售。
rhEPO自1989年投入臨床使用迄今已十年，其臨床適應(yīng)癥已由最初的治療慢性腎功能衰竭(CRF)合并貧血擴(kuò)展到多種貧血性疾病的治療，包括腫瘤及腫瘤化療所致的貧血，骨髓增生異常綜合征貧血(Myelodysplastic Syndrome，MDS)，齊多夫定(zidovudine)治療的AIDS病人以及采用自體輸血的手術(shù)病人等。臨床上針對(duì)不同適應(yīng)癥病人，人們采用各自相應(yīng)的治療措施已取得了較為肯定和滿意的結(jié)果。
目前認(rèn)為EPO的糖結(jié)構(gòu)對(duì)維持其體內(nèi)生物效應(yīng)具有重要的作用。但是目前對(duì)EPO糖基化在EPO表達(dá)其生物活性中具體作用的報(bào)道相對(duì)較少，同時(shí)對(duì)EPO的活性部位也有多種說(shuō)法(周廷沖，馬賢凱，唐佩弦等。多肽生長(zhǎng)因子基礎(chǔ)與臨床。中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社。)。現(xiàn)在大量有關(guān)EPO研究都是針對(duì)糖基化的EPO，有關(guān)hEPO基因克隆、在COS和CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中獲得高效表達(dá)的研究很多，可能是基因結(jié)構(gòu)的原因以及EPO蛋白質(zhì)的特殊性，目前檢索到的有關(guān)對(duì)hEPO基因在E.coli中表達(dá)研究以及對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的EPO的相關(guān)性質(zhì)的研究等方面的報(bào)道較少，如文獻(xiàn)Expression and mutagenesis of recombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli，Biochemica et Biophysica Acta 1261(1995)35-43，Roslyn M.Bill etc.；Expression and mutagenesis ofrecombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli Biochimica et Biophysica Acta1261(1995)35-43.Roslyn M.Bill etc.；Asn to Lys mutations at three sites which are N-glycosylated in themammalian protein decrease the aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin，ProteinEngineering，Vol.14 no.2 pp.135-140，2001，Linda O.Narhi etc.
在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的EPO蛋白，盡管由于缺少糖基化而在體內(nèi)不具有活性，但由于原核系統(tǒng)生產(chǎn)成本大大低于真核系統(tǒng)，而且研究表明肽鏈上的糖基化程度與其體內(nèi)活性正相關(guān)而與體外活性無(wú)關(guān)，因此對(duì)于非體內(nèi)應(yīng)用的EPO蛋白，依然可以通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備。為了研究原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的EPO相關(guān)性質(zhì)，我們?cè)?jīng)構(gòu)建過(guò)幾種不同的原核表達(dá)載體，但EPO的表達(dá)量都比較少，只能通過(guò)ELISA方法檢測(cè)到目的蛋白，SDS-PAGE電泳基本不能看到表達(dá)條帶。
研究資料表明影響真核基因在E.coli中高效表達(dá)的因素很多，如基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因的5′端和3′端穩(wěn)定性、SD序列的位置以及密碼子的偏愛(ài)性等(Chen.T.InouyeM.Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expressionpreforential usage of minor codons within the first 25 codons of the E.coli gene.NucleiAcids Resesrch 1990.181465～1473.)。同時(shí)，對(duì)真核和原核基因的密碼子的差異性研究也很多，發(fā)現(xiàn)如果稀有密碼子過(guò)多，其表達(dá)量較低(Zhang S，zubay G，Goldman E.Low-usage codons in E.coli.yeast.fruit fly and primates.Gene.1991.10561～72.及Sorensen M A，Kurland CG.Pedersen S.Codon usage determines translation rate in E.coli.J.Mol.Biol.1989.207365～377.)。而在EPO基因中，我們發(fā)現(xiàn)E.coli稀有密碼子占到12％，可能是制約hEPO在E.coli中高效表達(dá)的主要原因之一，因此可以通過(guò)密碼替換來(lái)改變基因結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)建在大腸桿菌中能高效表達(dá)EPO的工程菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種可在原核生物特別是大腸桿菌中高效表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供包含本發(fā)明重組基因的質(zhì)粒和宿主表達(dá)載體。
本發(fā)明的再一目的在于提供含有本發(fā)明重組人促紅細(xì)胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，新的可表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的基因的構(gòu)建是通過(guò)對(duì)已知的人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)基因的堿基序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，消除大腸桿菌稀有密碼子，而代之以大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，并適量調(diào)整GC含量，同時(shí)在目的基因片段的兩端增加3個(gè)酶切位點(diǎn)。密碼替換前后的對(duì)照如表1所示，為方便比較按50個(gè)堿基一組分列，表中給出的是替換前后的全部cDNA序列
表1 hEPO基因密碼替換前后對(duì)照表
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，含有重組hEPO基因的質(zhì)粒載體通過(guò)將合成的hEPO基因經(jīng)酶切后連接進(jìn)入質(zhì)粒而構(gòu)建成本發(fā)明的質(zhì)粒載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合成的hEPO基因中含有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切后，與同樣含有該兩個(gè)酶切位點(diǎn)的PBV220質(zhì)粒連接。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，用獲得的本發(fā)明的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌而得到本發(fā)明的含有重組hEPO基因的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切分析，篩選含有hEPO基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供含有本發(fā)明重組人紅細(xì)胞生成素的抗原和肽鏈蛋白試劑，可用于制備抗EPO單克隆抗體的抗原，也可用于制備檢測(cè)所用的陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。也可用于免疫動(dòng)物的EPO抗原；或制備成EPO陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，用于EPO免疫檢測(cè)的試劑盒，如反相血凝、放射免疫、酶聯(lián)免疫等方法；以及用于EPO依賴(lài)細(xì)胞系的培養(yǎng)或以之檢測(cè)EPO體外活性的標(biāo)準(zhǔn)品等等。
本發(fā)明通過(guò)密碼替換來(lái)改變基因序列，構(gòu)建了新的表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素蛋白的基因及其表達(dá)載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)密碼替換后，hEPO能在E.coli中高效表達(dá)，為研究原核系統(tǒng)表達(dá)的EPO的相關(guān)性質(zhì)提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明所涉及的EPO為無(wú)糖基化的EPO肽鏈，因生產(chǎn)成本較生產(chǎn)具糖基化的rhEPO低，可直接用于僅用其體外活性而不需體內(nèi)活性的領(lǐng)域。
本發(fā)明的制備重組hEPO的方法中，構(gòu)建高效表達(dá)的工程菌在保證產(chǎn)物高表達(dá)的前提下，采用高密度發(fā)酵技術(shù)，提高菌體發(fā)酵密度，不僅能減少培養(yǎng)體積，而且有利于下游純化，很大程度上降低各種成本。


圖1為本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建步驟示意圖；圖2為本發(fā)明構(gòu)建的基因在E.coli中的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖；圖中1陰性對(duì)照2、3、4、5、6PBV220-hEPO/DH5α圖3為本發(fā)明的rhEPO Western blot結(jié)果；圖中1陰性對(duì)照2試管表達(dá)產(chǎn)物3發(fā)酵罐表達(dá)產(chǎn)物圖4示出培養(yǎng)溫度對(duì)本發(fā)明rhEPO表達(dá)影響的電泳圖；圖中1蛋白分子量標(biāo)記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2在30℃培養(yǎng)3在28℃培養(yǎng)4在35℃培養(yǎng)5陰性對(duì)照?qǐng)D5為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)本發(fā)明rhEPO表達(dá)影響的電泳圖；
圖中1蛋白分子量標(biāo)記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2培養(yǎng)5hr3培養(yǎng)4hr4培養(yǎng)3hr5培養(yǎng)2hr6陰性對(duì)照?qǐng)D6為密碼修改前后hEPO的表達(dá)對(duì)照?qǐng)D；圖中1蛋白分子量標(biāo)記(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)2PBV220-EPO-DH5α，密碼未修改，未誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照樣品3PBV220-EPO-DH5α，密碼未修改，誘導(dǎo)表達(dá)的樣品4PBV220-EPO-DH5α，密碼已修改，未誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照樣品5PBV220-EPO-DH5α，密碼已修改，誘導(dǎo)表達(dá)的樣品圖7為兩種氨基酸序列(167AA和166AA，均包括第一位Met)的EPO蛋白表達(dá)對(duì)照?qǐng)D；圖中1密碼修改后，表達(dá)的167AA(含167位Arg)樣品2密碼修改后，表達(dá)的166AA(不含167位Arg)樣品31之誘導(dǎo)表達(dá)前對(duì)照樣品42之誘導(dǎo)表達(dá)前對(duì)照樣品具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述，說(shuō)明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1重組人促紅細(xì)胞生成素基因(rhEPO)的合成和表達(dá)載體構(gòu)建1.菌株及質(zhì)粒質(zhì)粒PBV220全長(zhǎng)3.66Kb，串聯(lián)噬菌體PLPR啟動(dòng)子，下游為核糖體基因終止信號(hào)，氨芐青霉素抗性，制備方法見(jiàn)含PLPR啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用，病毒學(xué)報(bào)，1990，6(2)11，該質(zhì)粒由作者贈(zèng)送。大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自于GIBCO公司DH5α標(biāo)準(zhǔn)株。
2.工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、T4連接酶以及Taq DNA聚合酶購(gòu)于Roche公司，質(zhì)粒純化試劑盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)購(gòu)于Promega公司，蛋白分子量標(biāo)記購(gòu)于華美公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 3.人促紅細(xì)胞生成素基因的合成人體內(nèi)表達(dá)的EPO分子由166個(gè)氨基酸構(gòu)成的糖基化蛋白質(zhì)，在后加工修飾過(guò)程中其C-末端Arg166位被切除，成為由165個(gè)氨基酸組成的成熟hEPO。hEPO的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2。其中大腸桿菌稀有密碼子的比例占到12％。為了讓基因最佳化表達(dá)，我們通過(guò)對(duì)基因的重新設(shè)計(jì)和合成，消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子。將hEPO中的絕大部分稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，并適量調(diào)整GC含量，同時(shí)在目的基因片段的兩端增加3個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR IGAATTC；Nde ICATATG；BamH IGGATCC。密碼替換前后對(duì)照如表1中所示，替換后合成的序列中編碼序列如SEQ ID NO.3所示。由于大腸桿菌基因表達(dá)以甲硫氨酸起始，實(shí)際得到的肽鏈在SEQ ID NO.2序列N端多一個(gè)甲硫氨酸，共167個(gè)氨基酸的肽鏈，蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有其它改變。
4.序列合成方法方法參考Jelenkovic G，Billings S，Chen Q，et al.Transformation of eggplant withsynthetic ccry IIIA gene produces a high level of resistance to the Colorado potatobeetle.J Amer Soc Hort Sci，1998.123(1)19～25，采用全基因合成的方法，首先使用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約為80nt的oligo，這些oligo之間互相形成約18nt的overlap，然后進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增后得到全長(zhǎng)基因，電泳回收后進(jìn)行克隆，再測(cè)序得到序列正確的克隆。
為了合成表達(dá)成熟hEPO的165個(gè)氨基酸(由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列缺少第166位精氨酸)的基因序列，設(shè)計(jì)如下兩條引物，用PCR法從含有經(jīng)密碼替換后的EPO基因的質(zhì)粒中重新擴(kuò)增出缺少第166位精氨酸密碼(CGT)的EPO基因(以下步驟和實(shí)施例均使用如SEQ ID NO.4所示的表達(dá)165個(gè)氨基酸的基因序列)，按上述方法同樣獲高效表達(dá)，見(jiàn)圖7。同樣，在大腸桿菌中表達(dá)的肽鏈為N端增加一個(gè)甲硫氨酸共166個(gè)氨基酸的肽鏈。
引物5’GAG GAA TTC ATA TGG CTC CGC CGC GTC TG 3’5’CAG CTG GGA TCC TCA ATC ACC GGT ACG GCA 3’5.重組質(zhì)粒構(gòu)建和篩選鑒定將經(jīng)測(cè)序正確的目的基因用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切得到編碼序列(SEQ ID NO.4)，電泳后回收后與用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I同樣雙酶切的PBV220質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切分析，篩選含有hEPO基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子。
重組質(zhì)粒的構(gòu)建路線見(jiàn)圖1。
6.EPO基因在大腸桿菌中的表達(dá)將重組子接種于5ml LB培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm搖床培養(yǎng)14h左右。然后以1∶30的比例轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4h左右(A600≈0.8時(shí))。再以42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取培養(yǎng)物1ml，離心后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot鑒定所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2重組人促紅細(xì)胞生成素的制備高密度發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件1.LB種子培養(yǎng)基每立升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，PH7.0，高壓滅菌，使用時(shí)加入氨芐青霉素至100ug/ml。
2.發(fā)酵用培養(yǎng)基每10L含K2HPO412g，KH2PO4·3H2O 20g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 10g，葡萄糖500g，酵母粉480g，蛋白胨430g，高壓滅菌后使用。
3.發(fā)酵培養(yǎng)將保存的菌種劃平皿，挑取單個(gè)菌落，接種于LB種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14～16h后，再以1∶30的比例擴(kuò)大培養(yǎng)12h。然后接種于NBSMPP-40發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中每間隔1個(gè)小時(shí)補(bǔ)料一次，并根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況調(diào)整PH和氧溶解度(DO)。
實(shí)施例3結(jié)果測(cè)定1.EPO體外細(xì)胞學(xué)活性測(cè)定方法參考《MTT比色法與ELISA法測(cè)定rhEPO體外生物學(xué)活性的比較[細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(J Cell Mol Immunol)2000；16(5)]韓蕾，韓為躍》，收獲菌體以超聲波破菌后離心。上清液直接進(jìn)行UT7細(xì)胞活性檢測(cè)，沉淀以6倍體積的7M尿素溶解后進(jìn)行UT7細(xì)胞活性檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品為rhEPO(麒麟鯤鵬公司利血寶)3000IU/瓶(2ml)。
結(jié)果對(duì)照的載體菌上清及沉淀溶解液中均未測(cè)得UT7細(xì)胞活性。構(gòu)建的工程菌破菌上清液測(cè)得8IU/ml，沉淀溶解液400倍稀釋后測(cè)得700IU/ml。
2.密碼修改前后及誘導(dǎo)前后的hEPO表達(dá)量測(cè)定將獲得的hEPO與對(duì)照組比較，結(jié)果見(jiàn)圖6。
3.rhEPO的DNA序列測(cè)定構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA序列測(cè)定的結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列完全一致，且氨基酸序列與文獻(xiàn)(Goldwasser E，et，al.Erythropoietinthe primary regulator of red cellformation.Insporn MB.Roberts AB.Eds.Peptide growth factors and their receptors.BerlinSpringer-verlag.1990747～770.)報(bào)道的rhEPO氨基酸序列除起始甲硫氨酸外完全一致。
4.EPO高效表達(dá)及Western blot鑒定SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定結(jié)果顯示，搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)均得到高表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到30％左右，而且高表達(dá)的條帶都具有rhEPO抗原性，見(jiàn)圖2、圖3。
實(shí)施例4各種條件對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響1.溫度對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，工程菌在30℃培養(yǎng)42℃誘導(dǎo)時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高，達(dá)到33％；在35℃進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，雖然細(xì)菌的生長(zhǎng)較快，菌密度明顯增加，但hEPO表達(dá)量卻很低，為20％；在28℃時(shí)培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)速率較慢，菌密度增加緩慢，但工程菌hEPO的表達(dá)量較高，達(dá)到25％。見(jiàn)圖4。
2.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)15h左右開(kāi)始升溫誘導(dǎo)，大約誘導(dǎo)4h左右，表達(dá)量可以達(dá)到34％；如果誘導(dǎo)時(shí)間逐步縮短，目的蛋白的表達(dá)量有所減少；但是通過(guò)SDS-PAGE電泳綜合比較，大約誘導(dǎo)3h左右，情況比較好。一是目的蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，達(dá)到28％，而且雜蛋白的量也不高，更加有利于下游純化工作，見(jiàn)圖5。
3.溶氧量與培養(yǎng)基對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，溶氧量控制在20％時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物的量比較高，雜蛋白較少；同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)根據(jù)OD值的變化適時(shí)補(bǔ)充葡萄糖、酵母粉和蛋白胨，葡萄糖的濃度應(yīng)維持在1g/L左右，以利于細(xì)菌生長(zhǎng)。
4.密碼修改和誘導(dǎo)對(duì)hEPO表達(dá)的影響圖6中，由第2、3比較可見(jiàn)，在目的分子量(18～20K)處可見(jiàn)較弱的表達(dá)條帶，掃描定量占總蛋白量不足1％；由4、5比較可見(jiàn)，在目的分子量(18～20K)處可見(jiàn)較強(qiáng)的表達(dá)條帶，掃描定量占總蛋白量的25％。
由以上各實(shí)施例表明，通過(guò)密碼替換改變基因序列后，rhEPO能在E.coli中高效表達(dá)，因此為原核系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)制備hEPO奠定了基礎(chǔ)。
構(gòu)建高效表達(dá)的工程菌在保證產(chǎn)物高表達(dá)的前提下，采用高密度發(fā)酵技術(shù)，提高菌體發(fā)酵密度，不僅能減少培養(yǎng)體積，而且有利于下游純化，很大程度上降低各種成本。由于發(fā)酵是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，影響大腸桿菌高密度高表達(dá)發(fā)酵的因素主要有溫度、PH、補(bǔ)料調(diào)控、氧溶解度(DO)等方面。根據(jù)實(shí)際情況，我們研究了溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響；同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中采用間隙補(bǔ)料方式。由于細(xì)菌的生長(zhǎng)是以指數(shù)形式增加，因此它對(duì)葡萄糖的要求也以這種形式增加，而我們采取的間隙補(bǔ)料方式即能保證葡萄糖加入量與細(xì)菌的生長(zhǎng)需求一致，有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，提高目的蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明制備的重組hEPO，其為無(wú)糖基化的EPO肽鏈，因生產(chǎn)成本較生產(chǎn)具糖基化的rhEPO低，目前的研究已經(jīng)證明肽鏈上的糖基化程度與其體內(nèi)活性正相關(guān)而與體外活性無(wú)關(guān)，可直接用于僅用其體外活性而不需體內(nèi)活性的領(lǐng)域。
本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌高效表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)與抗EPO單克隆抗體斑點(diǎn)雜交，可產(chǎn)生陽(yáng)性斑點(diǎn)；而對(duì)照的載體菌不產(chǎn)生陽(yáng)性斑點(diǎn)。證明本發(fā)明所獲的EPO肽鏈具有EPO特有的抗原活性，可開(kāi)發(fā)生產(chǎn)出用于制備抗EPO單克隆抗體的抗原，也可用于制備檢測(cè)所用的陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。因此本發(fā)明的hEPO可以用于制備EPO肽鏈蛋白試劑；也可用于免疫動(dòng)物的EPO抗原；或制備成EPO陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，用于EPO免疫檢測(cè)的試劑盒，如反相血凝、放射免疫、酶聯(lián)免疫等方法。
本發(fā)明所組建的工程菌高效表達(dá)的產(chǎn)物(SDS-PAGE可見(jiàn)表達(dá)條帶)經(jīng)EPO依賴(lài)細(xì)胞系UT7檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)具有EPO特有的維持UT7細(xì)胞生長(zhǎng)的活性；而對(duì)照的載體菌(SDS-PAGE未見(jiàn)表達(dá)條帶)未檢出相應(yīng)的EPO活性。此實(shí)驗(yàn)證明所獲的EPO肽鏈具有EPO特有的體外細(xì)胞學(xué)活性，可用于制備EPO依賴(lài)細(xì)胞系生長(zhǎng)所必需的細(xì)胞因子添加劑。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25SEQUENCE LISTING<110>成都生物制品研究所<120>適于原核表達(dá)系統(tǒng)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因及其表達(dá)載體<130>2832<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>CDS<222>(1)..(501)<223>編碼人重組人促紅細(xì)胞生成素基因<400>1gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc 48Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc144Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg192Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg240Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat288Len Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg336Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110gga gcc cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct384Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc432Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc480Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160tgc agg aca ggg gac aga tga501Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>Artificial(人工序列)<400>2
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(501)<400>3gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgatcgttg a 501
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25<210>4<211>498<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(498)<400>4gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgattga 498
權(quán)利要求
1.一種可在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因，其特征在于其含有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的重組質(zhì)粒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述質(zhì)粒載體是將SEQ ID NO.4所示核苷酸序列經(jīng)酶切后與PBV220連接而構(gòu)建的。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的宿主細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞是用含有SEQ IDNO.4序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α而制備。
7.一種重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白，其特征在于它由權(quán)利要求1所述的基因編碼，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白，其特征在于所述原核表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
9.含有權(quán)利要求7所述重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白的抗原。
10.含有權(quán)利要求7所述重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白的肽鏈蛋白試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及能在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素基因、其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞。通過(guò)對(duì)已知的hEPO基因的堿基序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，消除大腸桿菌稀有密碼子，而代之以大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，獲得了高效表達(dá)的重組基因。本發(fā)明所涉及的EPO為無(wú)糖基化的EPO肽鏈，因生產(chǎn)成本較生產(chǎn)具糖基化的rhEPO低，可直接用于僅用其體外活性而不需體內(nèi)活性的領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1657619SQ20051005099
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月18日
發(fā)明者葛永紅, 嚴(yán)君喜, 陳智勇 申請(qǐng)人:成都生物制品研究所