專利名稱：腸出血性大腸桿菌o157核酸檢測方法及其檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腸出血性大腸桿菌的檢測，尤其是涉及一種采用等長雙鏈熒光探針技術對腸出血性大腸桿菌0157進行檢測的方法及其檢測試劑盒。
背景技術：
腸出血性大腸桿菌0157(E.coli 0157)是致瀉性大腸桿菌的一種主要的血清型，它可引起出血性腸炎，伴有劇烈腹痛、發(fā)熱，嚴重的可造成腎功能不全、溶血性尿毒綜合癥(HUS)、溶血性貧血、血小板減少性紫癜，甚至因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。E.coli 0157引發(fā)的食物中毒在美國、日本、英國、加拿大、澳大利亞等發(fā)達國家接連不斷發(fā)生。1993年，美國發(fā)生了一次涉及到4個州700余名兒童感染的暴發(fā)流行，其中51例發(fā)生了溶血性尿毒綜合癥(HUS)，4例死亡，至1995年底，美國共暴發(fā)流行近50起，每年約2萬人感染。特別是1996年5～8月份，日本發(fā)生由0157污染蘿卜苗及牛肉而導致的集體食物中毒事件，波及東京、大阪、京都等40多個都府縣，患者累計達9000余人，7人死亡。我國于1987年首次從出血性結腸炎患者中分離到0157型大腸桿菌，目前尚未發(fā)現暴發(fā)流行，但多次于山東、江蘇、河北、河南等地的腹瀉患者中檢測出0157。因此對于E.coli 0157的監(jiān)測和檢測對于我國人民的飲食衛(wèi)生安全具有重要意義。
傳統(tǒng)的病原微生物分離、培養(yǎng)與鑒定需時較長，難以適應E.coli 0157流行時診斷、治療的需要，其鑒定慢、靈敏度低的缺點向微生物檢驗提出了更高的要求——更準確、更快速、更安全地檢出與監(jiān)測病原體。雖然各類PCR技術的應用已明顯加快了微生物檢驗的速度，但是由于PCR過程中操作易造成污染而產生假陽性結果和樣品中PCR抑制物的存在而產生假陰性結果，這又限制了PCR技術對E.coli 0157檢測的應用。
實時熒光PCR技術的產生不但很好地解決了PCR的定量問題，同時其閉管操作、實時檢測解決了PCR產物瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳等后續(xù)工作，簡化了步驟，很好地避免了PCR產物的交叉污染，提高了檢測的特異性。
目前，應用實時熒光PCR技術對腸出血性大腸桿菌0157進行檢測有分子信標(NathalieY.Fortin，Ashok Mulchandani，and Wilfred Chen.Use of Real-time Polymerase ChainReaction and Molecular Beacons for the detection of Escherichia coli0157H7.Analytical Biochemiotry.2001，289281-288)和Taqman探針(A.Mark Ibckwc，Pamela M.Watt，Catherine M.Grieve，Vijay K.Sharma，and Steven R.Lyons.MultiplexFluorogenic Real-time PCR for Detection and Quantification of Escherichia coli0157H7 in Dairy Wastewater Wetlands.Applied And Environmental Microbiology.2002，4853-4862；Vijay K.Sharma，Evelyn A.Dean-Nystrom.Detection of enterohemorrhagicEscherichia coli 0157H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encodingintimin and Shiga toxins.Veterinary Microbiology.2003，93247-260)等。探針的識別增強了實驗的可靠性，但是存在探針和實驗的設計過于復雜和實驗成本過高的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在針對現行的E.coli 0157檢測方法鑒定慢，靈敏度低，特異性差，難以適應流行時診斷、治療的問題，提供一種操作簡便、實驗可靠性高、可進行實時檢測、靈敏度高、特異性好、周期短的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法及其試劑盒。為此，本發(fā)明采用等長雙鏈熒光探針進行核酸檢測的技術方案。
本發(fā)明所說的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法如下1)將腸出血性大腸桿菌0157特有的保守序列作為待測靶基因，長度為100-350bp，優(yōu)選100-250bp。
2)根據待測靶基因合成一對與待測靶基因相應的特異性引物，引物長度為18-30bp，退火溫度為45-60℃，優(yōu)選50℃。
3)根據待測靶序列中位于兩個引物之間的序列合成一對等長雙鏈特異性探針，具體要求如下a.所說的一對等長雙鏈特開性探針的長度為18-30bp，探針的退火溫度為50-70℃；b.標記熒光劑的鏈與待測靶基因序列完全匹配，另一條鏈標記淬滅劑；c.兩條鏈的3’端封閉；d.兩條鏈的一個末端存在堿基完全不匹配，不匹配的堿基長度為2-10bp，優(yōu)選5bp。
4)使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應體系的檢測溶液混合物，所說的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說的探針為熒光劑標記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標記探針0.06-0.36μM。
5.陽性對照模板包含待測靶基因的被檢測DNA。
6.陰性對照模板滅菌后的無離子水。
7.實時熒光PCR反應條件 實時熒光PCR反應條件最好為 在步驟1)中，所說的序列優(yōu)選如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT長度為142bp。
另外，腸出血性大腸桿菌0157特異性引物的反應濃度優(yōu)選0.4μM。
在步驟2)中，所說的引物優(yōu)選如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃在步驟3)中，所說的探針的序列優(yōu)選為與靶基因完全匹配鏈(標記熒光劑)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互補鏈(標記淬滅劑)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃另外，等長雙鏈熒光探針與靶基因完全匹配鏈的5’端用FAM熒光劑標記，3’端磷酸化封閉；另一條鏈的3’端用Dabcyl粹滅劑封閉，與熒光劑標記的鏈有5個堿基不互補與靶基因完全匹配鏈FAM-5‘-GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA-3’-phosphorylation不完全互補鏈5‘-ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC-3’-Dabcyl在步驟4)中，混合物中MgCl2的濃度優(yōu)選2.5mM，dNTPs的濃度優(yōu)選0.25mM，Taq酶的濃度優(yōu)選1.8U。
本發(fā)明所說的腸出血性大腸桿菌0157的等長雙鏈探針核酸檢測試劑盒設有盒體、盒蓋，在盒體里設有墊體，墊體上設有至少可分別隔離放置4個Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對照模板、陽性對照模板和混合物的空腔，所說的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物和探針。
試劑盒檢測溶液最好保存于-20℃冰箱。
與已有的E.coli 0157檢測方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1)檢測方法鑒定方法快，實用性好，可以直接取菌進行實時熒光PCR核酸檢測，省去了分離、培養(yǎng)，提取細菌DNA的過程，可以快速完成對于E coli 0157的檢測，提高檢測的效率，操作簡便、實驗可靠性高，周期短。
2)特異性好，應用特異的上下游引物擴增目的片斷，再通過高度特異的等長雙鏈探針進行實時檢測，對于0157的檢測可以達到95％以上，可適應流行時的診斷與治療問題。
3)靈敏度高當從濃度約為1.49×103CFU/ml樣品中取1μl，應用試劑盒即可以檢測出陽性的結果。


圖1為等長熒光探針對不同來源(樣品來源于污染的水、食品、人畜糞便等)0157的檢測結果。
圖2為等長熒光探針對0157、志賀氏菌、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和沙門氏菌的檢測結果。
圖3為等長熒光探針對不同濃度梯度0157的檢測結果。在圖3中，曲線1，2，3，4代表樣品濃度分別為1.49×106，1.49×105，1.49×104，1.49×103 CFU/ml，曲線5為空白對照，曲線6為陰性對照模板。
在圖1-3中，橫坐標為循環(huán)數，縱坐標為相應的熒光值。
具體實施例方式
本發(fā)明所說的腸出血性大腸桿菌0157的等長雙鏈探針核酸檢測試劑盒設有盒體、盒蓋，在盒體里設有墊體，墊體上設有至少可分別隔離放置4個Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對照模板、陽性對照模板和混合物的空腔，所說的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物、探針。試劑盒檢測溶液最好保存于-20℃冰箱，其保持期可達1年。
實施例1等長熒光探針對0157的實時熒光PCR檢測取1μl樣品加入到檢測試劑盒的檢測溶液Mixs中，終體積為20μl。實時熒光PCR的反應程序為PCR擴增程序為94℃變性3min，進入循環(huán)，94℃變性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)，[Gain Fam]＝9。熒光信號強度在退火階段采集。
實施例2等長熒光探針對不同來源0157的檢測(樣品來源于污染的水，食品，人畜糞便等)
分別取不同樣品各1μl加入檢測溶液，按照實施程序的方法進行實時熒光PCR反應，不同樣品的熒光強度有不同高度的升起，代表了陽性結果。(參見圖1)實施例3等長熒光探針對0157，志賀氏菌，侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，沙門氏菌的檢測分別取0157，志賀氏菌，侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，沙門氏菌樣品各1μl加入檢測溶液，按照實施程序的方法進行實時熒光PCR反應，熒光強度有升起，代表了陽性結果.(參見圖2)實施例4等長熒光探針對不同濃度梯度0157的檢測將已知濃度的陽性樣品按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等梯度稀釋，分別取各個梯度的樣品1μl加入檢測溶液，按照實施程序的方法進行實時熒光PCR反應，不同梯度的樣品的熒光強度在不同的循環(huán)數升起。由此可以判斷試劑盒的靈敏度。1.49×102到1.49×106做梯度檢測，可以從濃度為1.49×103CFU/ml的樣品中取1μl即可檢測出陽性。(參見圖3)
權利要求
1.腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于其步驟為1)將腸出血性大腸桿菌0157特有的保守序列作為待測靶基因，長度為100-350bp；2)根據待測靶基因合成一對與待測靶基因相應的特異性引物，引物長度為18-30bp，退火溫度為45-60℃；3)根據待測靶序列中位于兩個引物之間的序列合成一對等長雙鏈特異性探針，具體要求如下a.所說的一對等長雙鏈特異性探針的長度為18-30bp，探針的退火溫度為50-70℃；b.標記熒光劑的鏈與待測靶基因序列完全匹配，另一條鏈標記淬滅劑；c.兩條鏈的3’端封閉；d.兩條鏈的一個末端存在堿基完全不匹配，不匹配的堿基長度為2-10bp；4)使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應體系的檢測溶液混合物，所說的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說的探針為熒光劑標記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標記探針0.06-0.36μM；5)陽性對照模板包含待測靶基因的被檢測DNA；6)陰性對照模板滅菌后的無離子水；7)實時熒光PCR反應條件
2.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟1)中，所說的特有的保守序列長度為100-250bp。
3.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟1)中，所說的序列優(yōu)選如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT長度為142bp。
4.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟1)中，腸出血性大腸桿菌0157特異性引物的反應濃度優(yōu)選0.4μM。
5.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所說的退火溫度為50℃。
6.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所說的引物優(yōu)選如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃
7.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟3)中，所說的不匹配的堿基長度為5bp；所說的探針的序列優(yōu)選為與靶基因完全匹配鏈(標記熒光劑)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互補鏈(標記淬滅劑)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃等長雙鏈熒光探針與靶基因完全匹配鏈的5’端用FAM熒光劑標記，3’端磷酸化封閉；另一條鏈的3’端用Dabcyl粹滅劑封閉，與熒光劑標記的鏈有5個堿基不互補。
8.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟4)中，使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應體系的檢測溶液混合物，所說的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說的探針為熒光劑標記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標記探針0.06-0.36μM。
9.如權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測方法，其特征在于在步驟4)中，混合物中MgCl2的濃度優(yōu)選2.5mM，dNTPs的濃度優(yōu)選0.25mM，Taq酶的濃度優(yōu)選1.8U。
10.腸出血性大腸桿菌0157的等長雙鏈探針核酸檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、盒蓋，在盒體里設有墊體，墊體上設有至少分別隔離放置4個Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對照模板、陽性對照模板和混合物的空腔，所說的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物、探針。
全文摘要
腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測方法及其試劑盒，涉及一種采用等長雙鏈熒光探針技術對腸出血性大腸桿菌O157進行檢測的方法及其試劑盒。提供一種操作簡便、實驗可靠性高、可進行實時檢測、靈敏度高、特異性好、周期短的腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測方法及其試劑盒。其步驟為將腸出血性大腸桿菌O157特有的保守序列作為待測靶基因；根據待測靶基因合成一對特異性引物；合成一對等長雙鏈特異性探針；組成熒光PCR反應體系的檢測溶液混合物；陽性對照模板包含待測靶基因的被檢測DNA；陰性對照模板滅菌后的無離子水。
文檔編號C12Q1/68GK1680602SQ20051005231
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月5日 優(yōu)先權日2005年2月5日
發(fā)明者陳亮, 于廣福, 邵寒娟, 牛建軍 申請人:廈門大學