專利名稱：一種高溫中性蛋白酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中性蛋白酶，特別是涉及到一種高溫中性蛋白酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶作為一大類生物酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、紡織及皮革處理等方面。而高溫蛋白酶具有催化反應(yīng)速度快，無工業(yè)污染，催化反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等特性和優(yōu)點，尤其是在耐熱、耐變性劑、耐有機溶劑等方面具有比較強的優(yōu)點，有重要的應(yīng)用價值，不僅如此，對高溫蛋白酶的耐熱機制的闡明還可以為人們蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然酶，從而提高其穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。但是，現(xiàn)有高溫蛋白酶一般酶產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高。
據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，國內(nèi)外對高溫中性蛋白酶的研究集中于二十世紀(jì)八、九十年代，重點在于菌種的選育、基因工程菌的構(gòu)建及酶的固定化三個方面。菌種的選育進(jìn)展緩慢，發(fā)酵酶活低；基因工程菌的構(gòu)建尚處于研究階段，已構(gòu)建的工程菌表達(dá)量低，還達(dá)不到規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的要求；酶的固定化雖能提高酶的熱穩(wěn)定性，但也存在諸多應(yīng)用上的困難，如使用成本效高等。2002年已由新疆農(nóng)科院微生物應(yīng)用研究所投資的新疆威仕達(dá)生物工程股份有限公司申請了有關(guān)中性蛋白酶的專利(專利申請?zhí)?2158191.6)，即高溫中性蛋白酶菌株、高溫中性蛋白酶及其生產(chǎn)工藝已申請了專利，其它未見有關(guān)高溫中性蛋白酶生產(chǎn)的報導(dǎo)。
該專利根據(jù)新疆農(nóng)科院微生物應(yīng)用研究所1992年從新疆吐魯番火焰山土壤中分離篩選到一株高溫中性蛋白酶產(chǎn)生菌，該菌種經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus LicheniformisCGMCC NO0800)(以下簡稱XJT9503高溫中性酶)，通過新疆農(nóng)科院立項的支持、以及國家“863”科研攻關(guān)，進(jìn)一步對XJT9503高溫中性酶產(chǎn)生菌的生物學(xué)特性、分類、發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件、分離提純及酶學(xué)特性等進(jìn)行了研究。通過搖瓶、7升、25升、250升、3000升及10000升發(fā)酵罐上的中試試驗研究，確定了產(chǎn)酶最佳條件及酶的穩(wěn)定性試驗，確立了一整套科學(xué)的發(fā)酵工藝技術(shù)路線，發(fā)酵平均酶活均在10000u/ml以上，具有好的熱穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)pH7.0-7.2，最適反應(yīng)溫度65℃，彌補了一般中性蛋白酶的不足。通過分級沉淀及柱層析等技術(shù)提純XJT9503高溫中性蛋白酶，獲得工業(yè)級(＞100000u/g)、食品級(＞150000u/g)用高溫中性蛋白酶。利用該技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品將使我國洗滌劑工業(yè)、毛皮工業(yè)、制革工業(yè)、絲紡工業(yè)、藥品及食品工業(yè)產(chǎn)生一次變革，可減少生產(chǎn)過程中對環(huán)境的污染，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。無論直接經(jīng)濟(jì)效益或社會意義都是很大的。
由于微生物生長、代謝等因素，利用常規(guī)生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的蛋白酶量有限，培養(yǎng)條件嚴(yán)格，生產(chǎn)成本較高，造成應(yīng)用困難。生物技術(shù)的發(fā)展為酶的研究提供了新途徑。DNA測序技術(shù)的提高，許多嗜熱菌的基因組已經(jīng)被解析。通過與嗜中溫菌的已知基因序列對比，已推測得到許多酶蛋白基因序列，但酶的特性還需要在基因表達(dá)后得到進(jìn)一步的表征。定向分子進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展也為我們獲得新型酶提供了新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本項研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過對高溫中性蛋白酶的分離、純化及分子生物學(xué)研究，可獲得高溫中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)基因。在獲得基因后，利用基因工程手段構(gòu)建成工程菌，并克隆到表達(dá)載體上，獲得基因工程菌株，并進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，這是一條提高酶產(chǎn)量的有效途徑。
本發(fā)明主要目的在于提供地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶的氨基酸序列，并據(jù)此設(shè)計了DNA引物，用PCR方法從地衣芽孢桿菌XJT9503的總DNA中擴增得到了高溫中性蛋白酶基因Gp1，片段大小為1129個堿基，表達(dá)377個氨基酸，對所獲得的基因進(jìn)行序列分析測定，并與蛋白酶的氨基酸序列分析對比，確認(rèn)了所獲得的基因。將擴增的Gp1基因DNA片段與表達(dá)載體pET-28a連接構(gòu)建成重組分泌型表達(dá)載體pGp1，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)。
本發(fā)明提供的內(nèi)容包括本發(fā)明提供了SEQ ID NO1列出的核苷酸序列，該片段大小1129個堿基。
通過對地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶基因克隆方法的確定及該基因的全序列測定，根據(jù)氨基酸的序列設(shè)計引物，對地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶生產(chǎn)菌總DNA序列進(jìn)行了PCR擴增，擴增出了一條片段，將此片段連接到pGEM-T載體中，選擇陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。該片段大小1129個堿基，基因的大小是1.1Kb，與氨基酸序列吻合。
本發(fā)明提供了編碼包含SEQ ID NO2中所述的蛋白酶氨基酸序列，該酶共有377個氨基酸組成。
通過對地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)生產(chǎn)的高溫中性蛋白酶酶蛋白進(jìn)行純化、酶的提純工藝的研究，獲得了電泳純蛋白，并對酶蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析及氨基酸序列的部分肽段的測定，將獲得的電泳純酶蛋白通過氨基酸序列進(jìn)行了質(zhì)譜分析及多肽同源性比較，確定了氨基酸的序列。
同時該發(fā)明為獲得該基因，還提供了該酶蛋白的提純方法，即生產(chǎn)該蛋白酶的方法。具體包括如下(1)、將地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心處理去除菌體，收集上清液；(2)、利用20％-30％飽和度的硫酸銨除去大量的雜蛋白，經(jīng)過10000rpm離心處理，收集上清液；(3)、將上清液在-10℃--25℃下使用乙醇可有效的將發(fā)酵液中的蛋白酶沉淀，進(jìn)一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出體積比大于1∶1；(4)、上樣濃度控制在0.5-2.5mg/ml，上樣數(shù)量控制在8ul-32ul；(5)、將沉淀通過SepHadex G100凝膠過濾。
本發(fā)明的蛋白酶純化達(dá)到測序的標(biāo)準(zhǔn)，純化的方法可獲得電泳純蛋白，測序通過質(zhì)譜分析及部分肽段的氨基酸序列測定，所獲得的氨基酸序列大小與所測結(jié)果一致。
該發(fā)明同時提供了該基因克隆的方法。
通過氨基酸測序分析系統(tǒng)測定純化的蛋白得到蛋白酶的部分氨基酸序列，根據(jù)得到的氨基酸序設(shè)計了引物，其上游引物為Gp1P1，下游引物為Gp1P2，上下游引物中均引入了BamHI酶切位點。具體如下其上游引物為Gp1P1＞AG GACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位點)；下游引物為Gp1P2＞CA TACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位點)。
兩引物跨度為1.2Kb。Gp1基因引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。將從地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)純化的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果擴增出了一條1.1Kd的特異DNA片段。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有上面的基因、編碼上面的蛋白酶組成型啟動子或調(diào)節(jié)性啟動子、作為選擇性標(biāo)記的抗生素抗性基因和轉(zhuǎn)錄終止子的新的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了一種重組分泌型表達(dá)載體，通過將擴增的Gp1基因DNA片段與表達(dá)載體pET-28a連接構(gòu)建成重組分泌型表達(dá)載體。
本發(fā)明選擇的表達(dá)載體pET-28a是通過中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，是一種普遍的表達(dá)載體，可通過市場購買。
通過選擇合適的酶切位點，設(shè)計出具有酶切位點、起始及終止密碼子的引物對XJT9503高溫中性酶生產(chǎn)菌株總DNA進(jìn)行PCR擴增，將克隆出的基因片段酶切后與同樣酶切后的表達(dá)載體pET28a進(jìn)行正向連接，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)。
本發(fā)明通過對地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌BL21中的表達(dá)。將克隆出的基因片段與表達(dá)載體pET28a進(jìn)行正向連接，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有正常的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶活性。
構(gòu)成常規(guī)重組方法的一系列步驟基本上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如技術(shù)人員可以利用J.Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》P34(科學(xué)出版社(1992))指導(dǎo)的方法容易地實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
本發(fā)明分離和純化了地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)產(chǎn)生的蛋白酶，進(jìn)行了蛋白酶的氨基酸序列測定，進(jìn)行了基因克隆并測定其序列，序列分析結(jié)果是SEQID NO1中列出的蛋白酶的氨基酸序列與B.lichenformis 6816絲氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在96％的相似性。另外，發(fā)現(xiàn)在存在蛋白酶抑制劑，如EDTA，蛋白酶的相對活性變低(參見圖)。這些觀察到的現(xiàn)象支持了本發(fā)明的蛋白酶是中性蛋白酶的說法。對酶的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-取勝丙烯酰胺凝膠)電泳及質(zhì)譜分析結(jié)明表明本發(fā)明蛋白酶帶的分子量為27.3KDa。
有益效果本發(fā)明的蛋白酶純化達(dá)到測序的標(biāo)準(zhǔn)，純化的方法可獲得電泳純蛋白，測序通過質(zhì)譜分析及部分肽段的氨基酸序列測定，所獲得的氨基酸序列大小與所測結(jié)果一致。
重組質(zhì)粒在宿主BL21中有很好的穩(wěn)定性，在有選擇壓力條件下傳代60次基本穩(wěn)定，傳代80次重組質(zhì)粒保留率達(dá)68％以上。


圖1為高溫中性蛋白酶表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
圖2為氨基酸序列分析，樣品的質(zhì)譜分析圖譜。
圖3為蛋白酶氨基酸測序結(jié)果圖4不同濃度IPTG對高溫中性蛋白酶表達(dá)的影響結(jié)果具體實施方式
實例1地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶的簡要制備流程醪液預(yù)處理(初酶)→離心除雜→硫酸銨→離心→乙醇沉淀→收集酶泥→冷凍干燥→Sephadex G100凝膠過濾→電泳分析→氨基酸測序地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心處理去除菌體，離心后上清液通過1、鹽沉淀在中性鹽中以硫酸銨沉淀效果最好，利用25％飽和度的硫酸銨可以除去大量的雜蛋白，經(jīng)過10000rpm離心處理，收集上清液。
2、有機溶劑沉淀法我們將上清液在低溫下使用乙醇可有效的將發(fā)酵液中的蛋白酶沉淀，進(jìn)一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出體積比大于1∶1。
3、將以上的處理液經(jīng)過10000rpm離心后，將沉淀通過SepHadex G100凝膠過濾。
上樣前用0.01NPBS上樣的體積約為床體積的1％，即0.1毫升，濃度為10-30毫克/毫升。調(diào)整流速0.05毫升/分鐘，使樣品慢慢滲入色譜柱內(nèi)，當(dāng)樣品加完至快干時，小心加入洗脫液洗脫。我們采用的是含鹽洗脫劑0.5NNaCL，它的作用是抑制交聯(lián)葡聚糖的吸附性質(zhì)，流速控制與上樣流速一致。收集最高峰即可獲得電泳純酶蛋白。將SepHadex G100凝膠過濾后收集的酶樣在經(jīng)過乙醇沉淀濃縮后迅速在10000rpm離心后進(jìn)行冷凍干燥。-20℃保存。上樣時溶解在樣品緩沖液中即可。樣品濃度2mg/ml為最佳，上樣數(shù)量控制在18ul-22ul為宜。將純化的酶蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析。
表1SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)分離膠和濃縮膠的配制


實例2地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶的氨基酸序列分析我們將純化的酶蛋白在北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進(jìn)行氨基酸序列分析，樣品的質(zhì)譜分析圖譜(可參見圖2)以及蛋白酶氨基酸測序結(jié)果(可見參圖3)。質(zhì)譜分析結(jié)果表明純化蛋白分子量為27.3kDa。
實例3地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶的氨基酸序的引物設(shè)計根據(jù)所測定的氨基酸序列測定結(jié)果設(shè)計一對簡并引物，用于PCR擴增Gp1基因。其上游引物為Gp1P1，下游引物為Gp1P2。兩引物跨度為1.2Kb。Gp1基因引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。結(jié)果擴增出了一條特異基因片段。
P15＞AG

GACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位點)P25＞CA

TACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位點)利用Gp1表達(dá)引物，以TGp1質(zhì)粒為模板進(jìn)行質(zhì)粒PCR擴增Gp1基因。
取表達(dá)載體pET28a 4μl，用BamHI酶切后與回收后的Gp1基因在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，隨機挑取轉(zhuǎn)化板菌落于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜(含卡那霉素60-100μg/ml)，用小量提質(zhì)粒法提質(zhì)粒，提出的質(zhì)粒先通過電泳初步篩選出較大的質(zhì)粒，然后用BamHI對初篩選出的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，Gp1引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的重組質(zhì)粒命名為B-pGp1。
實例4基因的擴增方法PCR反應(yīng)在50μl體系里進(jìn)行。取XJT9503提取的DNA1μl做模板，依次加入滅菌去離子水20μl，Taq酶混合溶液25μl，Gp1P1 2μl(25pmol)，Gp1P2 2μl(25pmol)，于PCR自動循環(huán)儀內(nèi)擴增GPl基因cDNA，循環(huán)參數(shù)為94℃變性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，循環(huán)數(shù)為30個，最后72℃延伸10min，循環(huán)結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后紫外下觀察，分析PCR產(chǎn)物。
實例5不同濃度IPTG對高溫中性蛋白酶表達(dá)的影響我們將重組菌B-pGp1在含有0.5-1％酪素的LB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)(含卡那霉素50-100μg/ml)，選擇生長并具有透明圈的菌落進(jìn)行鑒定。酶活測定結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有正常的生物學(xué)活性。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示具有明顯的特異性表達(dá)條帶，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為27.0×103，同核酸序列測定所推導(dǎo)的值相符。搖瓶實驗確定了重組菌的最佳表達(dá)條件為IPTG0.75mmol/L，培養(yǎng)起始pH＝6，培養(yǎng)溫度為37℃。重組菌所得酶活為2184u/ml。
試驗發(fā)現(xiàn)，在IPTG濃度低于0.75mmol/L時酶的表達(dá)水平隨誘導(dǎo)物濃度的提高而提高，繼續(xù)提高IPTG的濃度酶活反而有所下降(參見圖4)。
實例6重組菌酶活的測定方法——根據(jù)中華人民共和國輕工業(yè)部于1993-07-29發(fā)布，并于1994-03-01實施的《中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》QB/T 1803、1804-93，QB/T 1805、1806-93，工業(yè)酶制劑通用試驗方法，及該高溫中性蛋白酶特性，在測試過程中溫度定為65℃、pH為7.2。
(1)定義1克固體酶粉(或1ml液體酶)，在一定溫度下和pH條件下，1分鐘水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個酶活力單位，以u/g(u/ml)表示。
(2)福林法2.1原理XJT9503高溫中性蛋白酶在65℃，pH7.2條件下，水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光光度計測定，計算其酶活力。
2.2試劑與溶液2.2.1福林試劑的制備適用于常規(guī)實驗室制備方法。
使用溶液一份福林試劑與兩份水混合，搖勻。
2.2.2碳酸鈉溶液c(Na2CO3)＝0.4mol/L稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.3三氯乙酸c(CCl3COOH)＝0.4mol/L稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.40.02M、pH7.2磷酸緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)4.90g和磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)0.99g，加水溶解并定溶至1000ml。
2.2.550g/L酪素溶液稱取酪素1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液濕潤后，加入適量的pH7.2的磷酸緩沖液約80ml，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用適量的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液于冰箱中保存，有效期為三天。
2.2.6 100ug/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，用1mol/L鹽酸60ml溶解后定溶至100ml，即為1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.3儀器和設(shè)備2.3.1恒溫水浴65±0.2℃、40±0.2℃。
2.3.2分光光度計應(yīng)符合GB 9721的規(guī)定。
2.2.4測定步驟2.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制a.L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按下表配制

b.分別取上述溶注液各1.00ml(須做平行試驗)，各加0.4mol/ml碳酸鈉溶液5.00ml、福林試劑1.00ml，置于40℃水浴中顯色20分鐘，取出用分光光度計于波長680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0號管為空白，分別測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(此線應(yīng)通過零點)。
根據(jù)作圖或用回歸方程，計算出當(dāng)吸光度為1時的酪氨酸的量(ug)，即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在100左右。
2.2.4.2待測酶樣的制備與測定a.稱取酶粉1-2g，精確至0.0002g(或吸取液體酶1.00ml)，用少量pH7.2的磷酸緩沖液溶解，并用搗研，然后將上清液傾入容量瓶中，沉渣中再添加適量緩沖液，研搗3-4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻，用四層紗布過濾，濾液根據(jù)酶活力再一次用緩沖液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，供測試用(稀釋至測試液吸光值在0.25-0.45范圍內(nèi))，稀釋好的酶液置于冰箱中保存。
b.測定先將酪素溶液放入65℃恒溫水浴中，預(yù)熱5分鐘。
c.計算X＝A*K*4/10*N式中X-樣品的酶活力，u/ml(u/g)；A-樣品平行試驗的平均吸光度；K-吸光常數(shù)；4-反應(yīng)試劑的總體積，ml；10-反應(yīng)時間10分鐘，以分鐘計；N-稀釋倍數(shù)。
所測定的結(jié)果表示為整數(shù)。平行試驗相對誤差不超過3％。
實例7抑制劑對酶活性的影響EDTA對陽性克隆蛋白酶活性的抑制遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pMSF對蛋白酶活性的抑制作用，說明此克隆所產(chǎn)生的蛋白酶為中性蛋白酶。B-pGP1分泌的胞內(nèi)蛋白酶對pMSF敏感，表明該酶活性中心可能含有絲氨酸殘基；EDTA強烈抑制酶活性，表明金屬離子(如Ca2+)對酶活性或穩(wěn)定性具有重要影響；向EDTA處理過的酶液中補加過量的Cacl2能恢復(fù)部分活力，表明EDTA對部分酶活的抑制作用是可逆的；EDTA與pMSF都只能抑制部分酶活，當(dāng)它們同時作用時，酶活才幾乎被完全抑制(參見表3)。
表3EDTA和pMSF對克隆菌B-pGP1蛋白酶活性的抑制

實例8質(zhì)粒的穩(wěn)定性工程菌質(zhì)粒在不加壓的情況下連續(xù)轉(zhuǎn)種4次，統(tǒng)計在加和不加Kan的平皿中的菌落數(shù)，結(jié)果見表4。表4數(shù)據(jù)表明，帶有重組質(zhì)粒pGp1的E.coli BL21在傳代60次質(zhì)?；颈３址€(wěn)定，隨著轉(zhuǎn)種次數(shù)的增加。存在質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，傳代80次僅有68％的菌株攜帶重組質(zhì)粒。
表4工程菌B-pGP1連續(xù)轉(zhuǎn)種后在卡那霉素平皿上的菌落數(shù)

SEQUENCE LISTING<110>新疆農(nóng)科院微生物所<120>一種高溫中性蛋白酶及其制備方法<130>高溫中性蛋白酶<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1131<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1131)<400>1atg agg aaa aag agt tct tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg ctc48Met Arg Lys Lys Ser Ser Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu1 5 10 15gtg ttc acg acg gca ttc agc gat tcc gct tct gct gct caa ccg gcg96Val Phe Thr Thr Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala20 25 30aaa aat gtt gaa aag gat tat att gtc gga ttt aag tca gga gtg aaa144Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys35 40 45acc gca tct gtc aaa aag gac atc atc aaa gag agc ggc gga aaa gtg192Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val50 55 60gac aag cag ttt aga atc atc aac gcg gca aaa gcg aag cta gac aaa240Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys65 70 75 80gaa gcg ctt aag gaa gtc aaa aat gat ccg gat gtc gct tat gtg gaa288Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu85 90 95gag gat cat gtg gcc cat gcc tcg gcg caa acc gtt cct tac ggc att336Glu Asp His Val Ala His Ala Ser Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile
100 105 110cct ctc att aaa gcg gac aaa gcg cac gct caa cgc ttt aag gga gcg384Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Ala His Ala Gln Arg Phe Lys Gly Ala115 120 125aat gta aaa gta gcc gtc ctg gat aca gga atc caa gct tct cat ccg432Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro130 135 140gac ttg aac gta gtc ggc gga gca agc ttt gtg gct ggc gaa gct tat480Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr145 150 155 160aac acc gac ggc aac aga cac ggc acg cat gtc gcc tgt aca gta gct528Asn Thr Asp Gly Asn Arg His Gly Thr His Val Ala Cys Thr Val Ala165 170 175gcg ctt gac aat aca acg ggt gta ata cgc gtt gcg cca agc gta tcc576Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Ile Arg Val Ala Pro Ser Val Ser180 185 190ttg tac gcg gtt aaa gta ctg aat tca agc gga agc gga tca tac agc624Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser195 200 205ggc att gta agc gga atc gag tgg gcg aca aca aac ggc atg gat gtt672Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val210 215 220atc aat atg agc ctt ggg gga gca tca ggc tcg aca gcg atg aaa cag720Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln225 230 235 240gca gtc gac aat gca tat gca aga ggg gtt gtc gtt gta gct gca gca768Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala245 250 255ggg aac agc gga tct tca gga aac acg aat aca att ggc tat cct gcg816Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala260 265 270aaa tac gat cct gtc atc gct gtt ggt gcg gta gac tct aac agc aac864Lys Tyr Asp Pro Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn275 280 285aga gct tca ttt tcc agt gtg gga gca gag ctt gaa gtc atg gct cct912Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro290 295 300
ggc gca ggc gta tac agc act tac cca acg aat act tat gca aca ttg960Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu305 310 315 320aac gga acg tca atg gct tct cct cat gta gcg gga gca gca gcc ttg1008Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu325 330 335atc ttg tca aaa cat ccg aac ctt tca gct tca caa gtc cgc aac cgt1056Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg340 345 350ctc tcc agc acg gcg act tat ttg gga agc tcc ttc tac tat ggg aaa1104Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys355 360 365agg tct gat caa tgt tta agg atc cgc1131Arg Ser Asp Gln Cys Leu Arg Ile Arg370 375<210>2<211>377<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)<400>2Met Arg Lys Lys Ser Ser Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu1 5 10 15Val Phe Thr Thr Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala20 25 30Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys35 40 45Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val50 55 60Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys65 70 75 80
Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu85 90 95Glu Asp His Val Ala His Ala Ser Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile100 105 110Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Ala His Ala Gln Arg Phe Lys Gly Ala115 120 125Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro130 135 140Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr145 150 155 160Asn Thr Asp Gly Asn Arg His Gly Thr His Val Ala Cys Thr Val Ala165 170 175Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Ile Arg Val Ala Pro Ser Val Ser180 185 190Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser195 200 205Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val210 215 220Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln225 230 235 240Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala245 250 255Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala260 265 270Lys Tyr Asp Pro Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn
275 280 285Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro290 295 300Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu305 310 315 320Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu325 330 335Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg340 345 350Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys355 360 365Arg Ser Asp Gln Cys Leu Arg Ile Arg370 37權(quán)利要求
1.一種蛋白酶，該蛋白酶包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；
2.一種編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，該序列如SEQ ID NO1所示；
4.如權(quán)利要求2所述核苷酸序列的突變體或變異體；
5.一種表達(dá)載體，其含有如權(quán)利要求2至4任一項所述的核苷酸序列、組成型啟動子或調(diào)節(jié)性啟動子、作為選擇性標(biāo)記的抗性基因和轉(zhuǎn)錄終止子；
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其為重組分泌型表達(dá)載體；
7.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其含有T7啟動子以及具有6個組氨酸的標(biāo)記結(jié)構(gòu)；
8.一種制備權(quán)利要求1所述的蛋白酶的方法，該方法包括以下步驟，(1)、將地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高溫中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心處理去除菌體，收集上清液；(2)、利用20％-30％飽和度的硫酸銨除去大量的雜蛋白，經(jīng)過10000rpm離心處理，收集上清液；(3)、將上清液在-10℃--25℃下使用乙醇可有效的將發(fā)酵液中的蛋白酶沉淀，進(jìn)一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出體積比大于1∶1；(4)、上樣濃度控制在0.5-2.5mg/ml，上樣數(shù)量控制在8ul-32ul；(5)、將沉淀通過SepHadex G100凝膠過濾；
9.一種制備如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列的方法，其特征在于，根據(jù)SEQ IDNO2所示氨基酸序列設(shè)計上、下游引物，該上、下游引物的跨度為1.2Kb并在其中均引入了BamH I酶切位點；利用所述上、下游引物將從地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)純化的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴增；
10.如權(quán)利要求9所述的克隆的方法，其特征在于，(1)、上游引物為Gp1P1＞AGGGATCCGACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位點)；(2)、下游引物為Gp1P2＞CAGGATCCTACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位點)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)生產(chǎn)高溫中性蛋白酶及其制備方法。通過對高溫中性蛋白酶的分離、純化及分子生物學(xué)研究，可獲得高溫中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)基因。該基因片段大小為1129個堿基，表達(dá)377個氨基酸。并據(jù)此設(shè)計了DNA引物，同時克隆出該基因的全基因序列，確定酶蛋白的純化方法及基因克隆的方法，并對表達(dá)載體進(jìn)行了選擇，使該基因與pET28a進(jìn)行連接，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)。在獲得基因后，并克隆到表達(dá)載體上，可能獲得高效表達(dá)的基因工程菌株，再進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，能顯著提高酶產(chǎn)量的有效途徑。利用該技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品將使我國洗滌劑工業(yè)、毛皮工業(yè)、制革工業(yè)、絲紡工業(yè)、藥品及食品工業(yè)產(chǎn)生一次變革，可減少生產(chǎn)過程中對環(huán)境的污染，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。無論直接經(jīng)濟(jì)效益或社會意義都是很大的。
文檔編號C12P21/02GK1814755SQ200510052338
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月6日
發(fā)明者馮蕾, 楊新平, 秦新政, 陳竟, 古麗努爾, 屈新蘭 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所