專利名稱：鋸緣青蟹抗菌肽及其基因和基因的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從鋸緣青蟹(Scylla serrata(forskal))的雄性腺中分離純化到的一種抗菌活性多肽scygonadin，并據(jù)此克隆出的編碼該抗菌肽的基因。
背景技術(shù)：
鋸緣青蟹，英文名mud crab，blue crab拉丁名Scylla serrata(forskal)，俗稱青蟹、閘蟹、蟲尋、蝤蛑，自然分布較廣，在溫帶、亞熱帶、熱帶海區(qū)均有其蹤跡，是重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。近年來，隨著青蟹人工育苗技術(shù)的突破，養(yǎng)殖技術(shù)的改進(jìn)，青蟹養(yǎng)殖逐漸由粗放養(yǎng)殖向集約化養(yǎng)殖轉(zhuǎn)變。但隨著養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，致使養(yǎng)殖環(huán)境惡化，病毒病、細(xì)菌病、真菌病和寄生蟲病等病害不斷暴發(fā)，既造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，又嚴(yán)重挫傷了人們的養(yǎng)殖積極性。
抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是一類具有很強(qiáng)的廣譜抗細(xì)菌活性的天然小肽類物質(zhì)，被認(rèn)為是魚類、甲殼類、貝類等動(dòng)物非特異性免疫防御系統(tǒng)的主要成分之一。當(dāng)生物體受到損傷或病原微生物侵襲時(shí)，能迅速產(chǎn)生抗菌肽，以預(yù)防和殺傷病原微生物的入侵，其合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速、靈活等特點(diǎn)是其他大分子蛋白質(zhì)(如抗體等)和免疫細(xì)胞所不具備的，在防御海水性細(xì)菌和病毒入侵方面起著重要作用。
甲殼動(dòng)物的抗菌肽研究較少，在蟹類中，直到1996年Schnapp等(Schnapp D et al.，Eur.J.Biochem.，1996，240532-539)用離子交換層析和高效液相色譜法(HPLC)，分離岸蟹(Carcinus maenas)血細(xì)胞溶解物獲得抗菌肽(6.5KDa)，并測定其N-末端部分序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物的bactenecin 7相近，為富含脯氨酸的陽離子抗革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌活性多肽。1999年Relf等(RelfJ.M.et al.，Eur.J.Biochem.，1999，264350-357)分離岸蟹的顆粒細(xì)胞獲到一個(gè)11.5kDa的抗菌肽，該蛋白對熱穩(wěn)定，耐高鹽的兩性陽離子多肽，但僅對海洋革蘭氏陽性細(xì)菌起毒殺作用，其氨基酸序列與已知的抗菌肽序列不同，但與人類的抗白細(xì)胞蛋白酶高度同源。1999年V.Jayasankar等(Jayasankar V et al.，Journal ofExperimental Marine Biology and Ecology.1999，236253-259)分離鋸緣青蟹[Scylla serrata(Forskal)]精液獲得一種20KDa的抗菌蛋白，首先證明了無脊椎動(dòng)物精液中存在抗菌活性物質(zhì)，但并未進(jìn)一步深入研究。同年，Khoo等(Khoo LH et al.，Mar Biotechnol.，1999，144-51)報(bào)道了從C.sapidus血細(xì)胞中分離到3.7kDa，抗E.coli活性的抗菌肽——Callinectin，并測定其部分氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其N-末端富含脯氨酸，不形成Pro-Arg-Pro motif，且與已知抗菌肽沒有顯著的同源性。
抗菌肽基本的抗菌機(jī)理是抗菌肽分子破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，導(dǎo)致細(xì)菌停止生長或死亡。其抗菌機(jī)理不同于傳統(tǒng)抗生素，由于分子量小，極易擴(kuò)散到感染部位，使用后不存在產(chǎn)生耐藥性問題，且進(jìn)入機(jī)體后無有害殘留。因此，抗菌肽在海水養(yǎng)殖蟹類的疾病防治上將是一種應(yīng)用前景廣闊的抗菌藥物；但通過蟹類直接提取或利用化學(xué)方法人工合成天然的抗菌肽，受動(dòng)物來源和化學(xué)合成方法的限制，很難獲得足夠量的抗菌肽，且費(fèi)用昂貴，因而分離克隆抗菌肽基因，利用基因工程方法體外大量生產(chǎn)抗菌肽，是獲得高產(chǎn)量的抗菌肽并保證其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大面積推廣應(yīng)用的前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種從鋸緣青蟹的雄性腺中分離純化的抗菌肽scygonadin以及克隆的該抗菌肽基因。該基因可構(gòu)建真核表達(dá)載體建立高效表達(dá)鋸緣青蟹抗菌肽的基因工程菌株，體外大量生產(chǎn)鋸緣青蟹抗菌肽，作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素。
本發(fā)明所說的從鋸緣青蟹的雄性腺中分離純化的鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin分子量約為10.8KDa，其N-末端20個(gè)氨基酸序列為“Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro LysIle Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”。
本發(fā)明所說的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因cDNA共有564nt，其中含有5’端非編碼區(qū)長56nt(5’UTR)，1個(gè)閱讀框長378nt，3’非編碼翻譯區(qū)長130nt(3’UTR)，其GenBank系列號(hào)為AY864802，其序列如下序列表一鋸緣青蟹(Scylla serrata)的scygonadin抗菌肽全長cDNA序列acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca c60gttcatctct cctactcggc cttacagtgg tggtgctgct gggcgtcatc gtgcctccat 120gcatggcagg ccaggcactc aacaaactta tgcctaaaat cgtcagcgcc ataatttata 180tggtcgggca acccaatgca ggtgtcactt ttctgggcca ccaatgtctg gtggagtcaa 240cgaggcaacc agacgggttt tacaccgcaa agatgtcgtg tgcttcctgg actcatgata 300atcctattgt tggggaagga agaagccggg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttccatca 360caaactttgt ccagacagca tccaattaca agaagttcac catagatgag gtcgaggact 420ggattgcttc ttac gac gctcacctga cgtgctctcc gagtccacca aagctgtctt 480tgctggagcc actaagagtg gtttggttat tgaggacaat aaataacttt ctgaatttta 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 564序列表二鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA預(yù)測編碼蛋白氨基酸序列Met Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly-20 -15 -10Val Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met-5 -1 1 5Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala10 15 20Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln25 30 35 40Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His45 50 55Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala60 65 70Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys75 80 85Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr90 95 100序列表三鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA讀碼框及預(yù)測蛋白氨基酸序列acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca atg59Metcgt tca tct ctc cta ctc ggc ctt aca gtg gtg gtg ctg ctg ggc gtc 107Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly Val5 10 15atc gtg cct cca tgc atg gca ggc cag gca ctc aac aaa ctt atg cct 155Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro20 25 30aaa atc gtc agc gcc ata att tat atg gtc ggg caa ccc aat gca ggt 203Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly35 40 45
gtc act ttt ctg ggc cac caa tgt ctg gtg gag tca acg agg caa cca251Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro50 55 60 65gac ggg ttt tac acc gca aag atg tcg tgt gct tcc tgg act cat gat299Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp70 75 80aat cct att gtt ggg gaa gga aga agc cgg gtt gaa ctt gag gcg ctt347Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu85 90 95aaa ggt tcc atc aca aac ttt gtc cag aca gca tcc aat tac aag aag395Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys100 105 110ttc acc ata gat gag gtc gag gac tgg att gct tct tac taagacgctc 444Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr115 120 125acctgacgtg ctctccgagt ccaccaaagc tgtctttgct ggagccacta agagtggttt 504ggttattgag gacaataaat aactttctga attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 564鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽的分離純化及其cDNA基因克隆過程如下1)鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽的分離純化采用離子交換層析、反相層析及聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)方法，分離純化鋸緣青蟹輸精管的酸性萃取液，獲得一個(gè)分子量約為10.8KDa具有抗革蘭氏陽性細(xì)菌的活性多肽scygonadin，并由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測定其N-末端20個(gè)氨基酸序列。
2)鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽抗菌活性的測定采用溶壁微球菌(G+)和嗜水氣單胞菌(G-)為檢測菌，用微量液體培養(yǎng)法測定其抗菌活性。結(jié)果表明，Scygonadin抗菌肽具有很強(qiáng)的抗革蘭氏陽性細(xì)菌和較強(qiáng)的抗革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。
3)鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA基因克隆過程根據(jù)已測定的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽N端20個(gè)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物F1 5’-AAYAAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3’F2 5’-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3’(R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G)，下游引物采用大連寶生物公司的3’-Full RACE Core Set(TaKaRa)的3 site Adaptor Primer(5`-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3`，S2)。以健康鋸緣青蟹的性腺總RNA為模板，采用大連寶生物的3’-Full RACE Core Set試劑盒中的oligodT-3sites Adaptor Primer(S1)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用F1與S2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取1μL產(chǎn)物作為模板，再用F2和S2進(jìn)行PCR得到約400bp特異擴(kuò)增cDNA條帶，經(jīng)測序得到394bp的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通過Blast分析證實(shí)得到的基因片段為新的基因。
3)根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)合成特異引物GSP(密碼子ATG下游201bp-227bp)作為下游引物GSP5`-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3`，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMARTIIA oligo(SMART RACE cDNAAmplification Kit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG作為上游引物，以鋸緣青蟹性腺總RNA為模板，進(jìn)行5`race。
4)為進(jìn)一步獲得5’race產(chǎn)物的量，利用UPM(Clontech).(5′)CTA ATA CGA CTC ACTATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP1進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增得到大約300bp cDNA條帶，測序得283bp鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽含5`端cDNA片段。經(jīng)5’race和3’race的測序結(jié)果拼接而獲得鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽全長cDNA。
本發(fā)明以離子交換、反向?qū)游龅燃夹g(shù)從鋸緣青蟹雄性腺中分離純化到一種新抗菌肽scygonadin，該肽在體外有明顯的抑制或殺死溶壁微球菌(Micrococcus lysoleiksicus)等革蘭氏陽性細(xì)菌和抑制魚類病原菌——嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等革蘭氏陰性細(xì)菌等作用。并以鋸緣青蟹的雄性腺總RNA為模板，根據(jù)測定的scygonadin抗菌肽N端20個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成簡并引物，利用RT-PCR、RACE等分子生物學(xué)技術(shù)手段，成功地克隆到鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin全長cDNA基因序列，該基因?qū)儆谝环N新基因。與國外從岸蟹(Carcinus maenas)血細(xì)胞中分離獲得的6.5KDa、11.5KDa，以及從鋸緣青蟹[Scylla serrata(Forskal)]精液分離到一種20KDa的抗菌肽，其分離的組織部位、分子量大小、肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)以及核苷酸序列都不同?；蚩赏ㄟ^構(gòu)建真核表達(dá)載體建立高效表達(dá)該抗菌肽的基因工程菌株，體外大量生產(chǎn)出抗菌肽，作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產(chǎn)品中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量；也可以作為某些耐藥性抗生素的有效替代品，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細(xì)菌的防治藥物。另外，該基因還可以用于轉(zhuǎn)基因青蟹的育種研究。


圖1為抗菌肽Scygonadin的反相層析及抗菌活性圖。
圖2為抗菌肽scygonadin的SDS-PAGE電泳圖。
圖3為提取的鋸緣青蟹性腺總RNA電泳圖。
圖4為RT-PCR電泳圖。
圖5為5`race電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1.鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽的分離純化解剖分離鋸緣青蟹的輸精管，加入等體積的酸性萃取液[15％乙酸、0.1％三氟乙酸和1mM苯甲酸磺酰氟(PMSF)]，勻漿20min(6000r·min-1)，勻漿液于4℃15000g離心45min，取上清。用等體積萃取液重懸沉淀，超聲波破碎(400w 10s破碎15次)后，4℃15000g離心45min，取上清，合并兩次上清液，冷凍干燥。用0.05M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)溶解樣品，4℃10000g離心10min，取上清，過SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱，用1.5M乙酸銨梯度洗脫，0-50％洗脫5個(gè)柱體積(CV)，50％-80％洗脫2CV，80-100％洗脫5CV。洗脫的組分為350-410ml抗菌活性最強(qiáng)，用反相Source 5R RPC(Amersham瑞典)純化。預(yù)先用A液(0.065％三氟乙酸，2％乙腈)平衡2CV，用B液(0.05％三氟乙酸，80％乙腈)進(jìn)行梯度洗脫(0-15％，1.5CV；15-30％，10CV；30-50％，8CV；80-1001CV)，檢測A280，收集峰值為74.89mL處的組分即為scygonadin抗菌肽樣品(見圖1)，進(jìn)行TricineSDS-PAGE凝膠電泳鑒定(見圖2)，測序(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司)，獲得其N-末端部分序列為“Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr MetVal Gly”。
2.抗菌活性檢測取被檢測的細(xì)菌(嗜水氣單胞菌，G-；溶壁微球菌，G+)斜面一環(huán)，劃線于MHA平板上，28℃倒置培養(yǎng)16～18h。從上述平板上各挑取1個(gè)單菌落接種于MHA斜面培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24h。用0.05M HEPES(pH6.8)洗斜面培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至OD620＝0.1，備用。實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，每個(gè)樣品分別均設(shè)有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)和對照孔。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)孔中分別加入25μL待檢測樣品和25μL細(xì)菌懸液，在陰性對照孔中加入25μL 50mM HEPES和25μL細(xì)菌懸液，另外在對照孔中加入25μL待檢測樣品和25μL 50mM HEPES(空白對照)。而后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于28℃培養(yǎng)3h，每孔中再加入50μL無菌的MHB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2h。每孔中加入10μL MTS-PMS試劑(Promega公司)后，28℃培養(yǎng)1h。在酶標(biāo)儀上測A492的值。按下列公式計(jì)算殺傷指數(shù)(KI)。
殺傷指數(shù)(％)＝[1-(實(shí)驗(yàn)組A492-空白對照A492)/(陰性對照A492-空白對照A492)]×100結(jié)果判定KI值越大，表示抗菌活性越強(qiáng)。
3鋸緣青蟹性腺總RNA的提取稱取100mg鋸緣青蟹雄性腺組織，用液氮研磨成粉末狀，加到含有1mL Trizol的一無核酸酶離心管中。2～8℃下12000g離心10min，吸出粉紅色上清，室溫下溫育5min，徹底去除核蛋白復(fù)合物，然后加200μL氯仿，蓋緊蓋子。劇烈振蕩15sec，室溫下溫育2～3min，2～8℃下12000g離心15min。取上清至另一無核酸酶離心管，再加500μL異丙醇，輕輕混勻以沉淀RNA。室溫溫育10min，2～8℃下12000g離心10min，離心管底部可見一膠樣沉淀即為RNA。棄上清，用1mL 75％乙醇洗滌RNA沉淀，2～8℃下7500g離心5min。涼干RNA沉淀，并用100μL無核酸酶水溶解。測OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，于1％瓊脂糖凝膠電泳上分析(見圖3)。
4.RT-PCR擴(kuò)增目的片段scygonadin抗菌肽基因4.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與3’RACE根據(jù)分離純化的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽N-末端測定的20個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)上游引物F1 5’-AAY AAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3’和F2 5`-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3’(簡并性為R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G)，下游引物采用3’-Full RACE CoreSet(TaKaRa)的3 site Adaptor Primer(5`-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3`，S2)。以健康鋸緣青蟹的性腺總RNA為模板，采用3’-Full RACE Core Set試劑盒中(TaKaRa)的oligodT-3sites Adaptor Primer(S1)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用F1與S2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取1μL作為模板，再用F2和S2進(jìn)行PCR得到約400bp特異擴(kuò)增cDNA條帶，經(jīng)測序得到394bp的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；在0.2mL離心管中加入以下物質(zhì)2μL 10×RNA PCR buffer，4μL MgCl2(25mM)，2μL dNTP Mixture(10mM each)，1μL AMV Reverse Transcriptase XL(5U·μL-1)，0.5μL RNase inhibitor(40U·μL-1)，1μL oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5μM)and 1μL鋸緣青蟹性腺總RNA，補(bǔ)充無RNase蒸餾水使總體積達(dá)20μL?；旌虾?，稍許離心后置于PCR儀上，運(yùn)行如下列程序30℃，10min；48℃，30min；95℃，5min；5℃，5min。
4.2PCR反應(yīng)分別加入10×Mg2+free buffer 10.0μL、MgCl2(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、F1(10μM)2.0μL、S2(10μM)2.0μL、cDNA 4.0μL、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL，用無核酸酶水補(bǔ)齊至總體積100μL。94℃預(yù)變性2min；94℃變性40sec，60℃復(fù)性45sec，72℃延伸60sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min進(jìn)行擴(kuò)增。產(chǎn)物用雙蒸水稀釋100倍后，取4.0μL到下列反應(yīng)體系中后加入10×Mg2+free buffer 10.0μL、MgCl2(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、F2(10μM)2.0μL、S2(10μM)2.0μL、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至總體積100μL。94℃預(yù)變性2min；94℃變性40sec，60℃復(fù)性45sec，72℃延伸60sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增獲得約400bp特異擴(kuò)增cDNA條帶(見圖4)經(jīng)測序得到394bp的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通過Blast分析證實(shí)得到的基因片段為新的基因。為獲得該基因全長cDNA序列，進(jìn)行5’race。
5.5′RACE5.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)合成特異引物GSP(密碼子ATG下游201bp-227bp)作為下游引物GSP5`-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3`，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMARTIIA oligo(SMART RACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做為上游引物。取3.0μL總RNA，1.0μL 5′-CDS引物和1.0μL SMART II A oligo加入0.2mL的離心管中，70℃，10min，立即置于冰上，再加入5×First-Strand Buffer 2.0μL、DTT(20mM)1.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、PowerScript Reverse Transcriptase1.0μL至總體積10μL，42℃延伸90min；72℃溫育7min滅活酶；5℃，5min。
5.2PCR反應(yīng)加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerase mix1.0μL、cDNA 5.0μL、UPM(2.0μM)1.0μL、GSP(10μM)1.0μL，用無核酸酶水補(bǔ)齊至50μL。94℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸2min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。
5.3嵌套PCR利用UPM(Clontech.)(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP進(jìn)行嵌套PCR。取上步反應(yīng)產(chǎn)物5.0μL，加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerasemix1.0μL、NUMP(2.0μM)5.0μL、GSP 10μM)1.0μL，用無核酸酶水補(bǔ)齊至50μL。94℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，68℃復(fù)性30sec，72℃延伸2min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增得到大約300bp cDNA條帶，測序得283bp鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽含5`端cDNA片段(見圖5)。
6.序列分析與基因確定擴(kuò)增獲得的cDNA產(chǎn)物由上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA核苷酸序列測定。序列同源性比對和相似性搜索用NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST在線軟件進(jìn)行；多序列比較用DNAssist2.0軟件；以BLAST2軟件輔助進(jìn)行序列拼接；信號(hào)肽預(yù)測用SIGNALP在線查找(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。
所擴(kuò)增獲得的鋸緣青蟹抗菌肽基因全長cDNA序列提交國際GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行新基因比較鑒定。
權(quán)利要求
1.鋸緣青蟹抗菌肽，其特征在于所說的從鋸緣青蟹的雄性腺中分離純化的鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin分子量約為10.8KDa，其N-末端20個(gè)氨基酸序列為“Gly Gln Ala Leu Asn LysLeu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”。
2.鋸緣青蟹抗菌肽基因，其特征在于所說的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因cDNA共有564nt，其中含有5’端非編碼區(qū)長56nt(5’UTR)，1個(gè)閱讀框長378nt，3’非編碼翻譯區(qū)長130nt(3’UTR)，其GenBank系列號(hào)為AY864802，其序列如下序列表一鋸緣青蟹(Scylla serrata)的scygonadin抗菌肽全長cDNA序列acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca c 60gttcatctct cctactcggc cttacagtgg tggtgctgct gggcgtcatc gtgcctccat 120gcatggcagg ccaggcactc aacaaactta tgcctaaaat cgtcagcgcc ataatttata 180tggtcgggca acccaatgca ggtgtcactt ttctgggcca ccaatgtctg gtggagtcaa 240cgaggcaacc agacgggttt tacaccgcaa agatgtcgtg tgcttcctgg actcatgata 300atcctattgt tggggaagga agaagccggg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttccatca 360caaactttgt ccagacagca tccaattaca agaagttcac catagatgag gtcgaggact 420ggattgcttc ttac gac gctcacctga cgtgctctcc gagtccacca aagctgtctt 480tgctggagcc actaagagtg gtttggttat tgaggacaat aaataacttt ctgaatttta 540aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa564序列表二鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA預(yù)測編碼蛋白氨基酸序列Met Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly-20 -15 -10Val Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met-5 -1 1 5Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala10 15 20Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln25 30 35 40Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His45 50 55Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala60 65 70Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys75 80 85Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr90 95 100序列表三鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA讀碼框及預(yù)測蛋白氨基酸序列acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca atg59Metcgt tca tct ctc cta ctc ggc ctt aca gtg gtg gtg ctg ctg ggc gtc 107Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly Val5 10 15atc gtg cct cca tgc atg gca ggc cag gca ctc aac aaa ctt atg cct 155Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro20 25 30aaa atc gtc agc gcc ata att tat atg gtc ggg caa ccc aat gca ggt 203Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly35 40 45gtc act ttt ctg ggc cac caa tgt ctg gtg gag tca acg agg caa cca 251Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro50 55 60 65gac ggg ttt tac acc gca aag atg tcg tgt gct tcc tgg act cat gat 299Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp70 75 80aat cct att gtt ggg gaa gga aga agc cgg gtt gaa ctt gag gcg ctt 347Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu85 90 95aaa ggt tcc atc aca aac ttt gtc cag aca gca tcc aat tac aag aag395Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys100 105 110ttc acc ata gat gag gtc gag gac tgg att gct tct tac taagacgctc 444Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr115 120 125acctgacgtg ctctccgagt ccaccaaagc tgtctttgct ggagccacta agagtggttt 504ggttattgag gacaataaat aactttctga attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 564。
3.鋸緣青蟹抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于克隆過程如下1)鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽的分離純化采用離子交換層析、反相層析及聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離純化鋸緣青蟹輸精管的酸性萃取液，獲得一個(gè)分子量約為10.8KDa具有抗革蘭氏陽性細(xì)菌的活性多肽scygonadin，其N-末端部分序列為“Gly Gln Ala Leu Asn LysLeu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”；2)鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽cDNA基因克隆過程根據(jù)已測定的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽N端20個(gè)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物F1 5’-AAYAAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3’；F25’-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3’(R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G)，下游引物采用大連寶生物公司的3’-Full RACE Core Set(TaKaRa)的3site Adaptor Primer(5`-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3`，S2)，以鋸緣青蟹的性腺總RNA為模板，采用大連寶生物的3’-Full RACE Core Set試劑盒中的oligodT-3sites Adaptor Primer(S1)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用F1與S2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，再用F2和S2進(jìn)行PCR得到約400bp特異擴(kuò)增cDNA條帶，經(jīng)測序得到394bp的鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；3)根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)合成特異引物GSP(密碼子ATG下游201bp-227bp)作為下游引物GSP5`-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3`，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMARTIIA oligo(SMART RACE cDNAAmplification Kit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG作為上游引物，以鋸緣青蟹性腺總RNA為模板，進(jìn)行5`race；4)利用UPM(Clontech).(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GTNUPM(Clontech)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP1進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增得到大約300bp cDNA條帶，測序得283bp鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽含5`端cDNA片段；經(jīng)5’race和3’race的測序結(jié)果拼接而獲得鋸緣青蟹scygonadin抗菌肽全長cDNA。
全文摘要
鋸緣青蟹抗菌肽及其基因和基因的克隆方法，涉及一種抗菌活性多肽scygonadin及其基因。從鋸緣青蟹雄性腺中分離純化得抗菌肽scygonadin，并以鋸緣青蟹的雄性腺總RNA為模板，根據(jù)測定的scygonadin抗菌肽N端20個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成簡并引物，利用RT－PCR、RACE等分子生物學(xué)技術(shù)手段，克隆到鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin全長cDNA基因序列。該基因可通過構(gòu)建真核表達(dá)載體建立高效表達(dá)該抗菌肽的基因工程菌株，體外生產(chǎn)抗菌肽，作為飼料免疫添加劑替代傳統(tǒng)飼料中的抗生素，也可以作為抗生素的有效替代品，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細(xì)菌的防治藥物。另外，還可以用于轉(zhuǎn)基因青蟹的育種研究。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1721439SQ200510053239
公開日2006年1月18日 申請日期2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月17日
發(fā)明者王克堅(jiān), 黃文樹, 李少菁, 王桂忠 申請人:廈門大學(xué)