專利名稱：可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒及其在治療肺癌中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組單皰疹病毒和采用該重組病毒進行人類腫瘤的基因治療方法。特別是涉及帶有血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒，及其在治療或預防肺癌中的應用。還涉及含有該重組病毒的藥物組合物。
背景技術(shù)：
肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個極其復雜的多基因調(diào)控異常的過程。該病確診時大多為非早期，所以往往治療效果較差。最新統(tǒng)計表明，肺癌死亡率上升幅度居各類腫瘤之首，到20世紀90年代已達17.54/10萬人，這表明它對人類健康的危害日益嚴重。近年來，隨著醫(yī)學分子生物學技術(shù)和理論的發(fā)展，尤其是DNA重組技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)逐步成熟，利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)向體內(nèi)導入目的基因，用以對肺癌發(fā)病的分子環(huán)節(jié)進行干預，為肺癌的治療開辟了新途徑。
研究表明，肺癌的發(fā)生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和凋亡相關(guān)基因的改變導致細胞增殖和死亡異常的結(jié)果(Mistudomi T et al.，Cancer and Chemotherapy，1996，23990-996)。其發(fā)生是多階段、多步驟、多基因參與的過程，在不同階段相繼或同時有不同基因的改變。肺癌的基因治療就是針對肺癌在發(fā)生、發(fā)展和演變過程中，細胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活這些節(jié)點，采用已知的基因片段導入、轉(zhuǎn)移和重組等技術(shù)來消除激活的癌基因和增殖腫瘤中抑癌基因的功能。概括地說，基因治療包括兩部分一是恢復異常表達或缺失的體細胞基因功能；二是引入有治療價值的其他來源的基因。在肺癌基因治療中，除了考慮打破腫瘤的生長規(guī)律，糾正其惡性表現(xiàn)外，還需要考慮腫瘤局部微環(huán)境及其全身抗腫瘤系統(tǒng)的功能恢復和加強。
目前，研究較多的肺癌的基因治療方法有(1)抑癌基因治療抑癌基因治療是一種基因替代療法，即用野生型的抑癌基因替代失活的抑癌基因，從而達到治療腫瘤的目的。目前研究較多的是用外源性野生型p53基因治療肺癌；(2)反義基因治療即人工合成的與癌基因序列相反的一段核苷酸或?qū)┗蚍聪蜻B接于質(zhì)粒上，經(jīng)載體將它們傳遞到腫瘤細胞，以便在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上阻斷癌基因的過度表達；(3)自殺基因療法自殺基因療法又稱病毒介導活化前體藥物基因治療。其機制是一些基因被導入腫瘤細胞后，通過表達特殊的酶而使前體藥物活化。這些藥物可阻斷腫瘤細胞的核酸代謝，導致腫瘤細胞的死亡。Douglas等將數(shù)種酶和前體藥物聯(lián)合應用，如胞嘧啶脫氨酶和5-氟胞嘧啶，細胞色素P4502B1和環(huán)磷酰胺以及黃嘌呤-鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶和6-硫代黃嘌呤聯(lián)合應用，取得了很好的效果；(4)免疫基因治療免疫基因治療是采用一定的方法或載體將目的基因?qū)肽[瘤細胞或效應細胞——腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，然后將表達目的基因的受體細胞輸入患者體內(nèi)，通過提高人體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別、抑制與殺傷，從而對腫瘤進行治療的一種方法；(5)核酶基因治療；以及(6)多向耐藥基因治療等(Albelda S M，Chest，1997，III Suppl145-149)。
但總的來說，雖然已進行了利用各種方式進行的癌癥基因治療的抗腫瘤率和安全性方面的臨床前的動物實驗，但迄今為止，其臨床結(jié)果都不令人滿意。一般說來，不是抗腫瘤效率低下，就是根本不存在(BuenoR.，Chest 1999，116(3Suppl)444S-45S；Arriola EL et al.Oncogene 1999，18(4)1081-91)。出現(xiàn)這種狀況的原因毫無疑問是多種多樣的，但是癌癥治療的遺傳修飾主要受到無法在足夠大數(shù)量的靶細胞中獲得足夠高水平的基因表達從而獲得臨床效果的限制。
目前基因治療中轉(zhuǎn)基因最有效和應用最多的方法是以病毒作為載體進行基因治療的方法，其中研究最多的為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。美國1995年批準進入臨床的基因治療106項，病毒介導的有92項，占85％，逆轉(zhuǎn)錄病毒76項，占總數(shù)50％以上。以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體可將外源基因整合到細胞核，隨細胞分裂而復制，可持續(xù)表達外源基因。但在安全性上存在問題，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機插入到宿主DNA，可能造成病毒整合部位異常，從而病人成為癌攜帶的危險者。此外，病毒經(jīng)包裝導入細胞后，有重新恢復野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能，對宿主可能造成潛在的病毒感染。
雖然，研究較為充分的用于肺癌治療的病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovius)和腺病毒(AV)。但其缺點也十分明顯1)如上文所述，逆轉(zhuǎn)病毒經(jīng)包裝導入細胞后，有重新恢復野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能，從而產(chǎn)生具有復制能力的病毒，宿主存在病毒感染的風險；2)由于逆轉(zhuǎn)錄病毒是隨機整合至宿主基因組，因而可能會引起“插入誘變”——可引發(fā)一些插入位點附近的原癌基因的激活，誘發(fā)癌癥；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝外源DNA能力十分有限，其一般只能包裝小于8kb的外源DNA；4)逆轉(zhuǎn)錄病毒還要求靶細胞表面要具有反轉(zhuǎn)錄病毒的相應受體。對于腺病毒來說，其缺點也是十分明顯的1)腺病毒幾乎可以感染所有的細胞，因此缺乏特異性；2)腺病毒因為不能整合到宿主染色體上，所以不能持續(xù)表達所需產(chǎn)物，表達時間短暫，需重復給予載體制劑治療；3)腺病毒的病毒顆粒可引起強的免疫應答，可能刺激免疫反應，使反復治療的效果會逐漸降低。
此外，常用于腫瘤治療的病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒，均為非復制性的病毒載體，由于不能實現(xiàn)腫瘤特異性的復制而限制了病毒在腫瘤中的擴散，只能完全依賴其攜帶的基因?qū)δ[瘤的作用，從而其臨床效果十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
肺癌和其他腫瘤一樣，其生長、轉(zhuǎn)移以及預后均有賴血管生成?；谠撛?，申請人試圖利用在基因分子水平阻斷肺癌營養(yǎng)血管的生成這一原理，來有效的治療肺癌。
目前最有希望的利用抗血管生成方式來治療肺癌的技術(shù)方案是用一種或多種抗血管生成藥物/蛋白長時間作用，從而達到一個穩(wěn)定的、持續(xù)的效果。但目前技術(shù)上實施這一設(shè)想存在諸多問題如何選擇對肺癌治療特別有效的抗血管生成藥物/蛋白或基因，如何提高基因的導入機體的效率，如何提高基因治療的安全性減少載體對機體的免疫原性和毒性作用，如何提高基因在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)化能力等等。本發(fā)明的技術(shù)方案克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一系列問題，實現(xiàn)了有效治療肺癌的目標。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體作為基因治療的載體所存在的多方面的缺陷，本發(fā)明選用了缺失了部分基因的I型單純皰疹病毒(HSV-1)作為載體。
HSV-1是一種常見的能感染神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞的人類病毒，其具有表面覆蓋有糖蛋白外膜的由162個衣殼蛋白亞基組成的二十面體衣殼。其為雙鏈線形DNA病毒，約153kb，編碼約84個蛋白。自從1980年起，HSV-1就在基因治療中作為載體用于治療癌癥和其他疾病。
與其他常用的載體相比，HSV-1具有許多優(yōu)點1)具有最大的容積，可插入至少30kb的外源基因而不影響病毒的組裝；2)其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，大多數(shù)的重組HSV-1病毒在多次感染動物，再在體外大量繁殖后，仍然保持其原來的遺傳即表象特征，從而其安全性高；3)感染能力強，能感染多種類型的宿主細胞，除了在神經(jīng)元中潛伏外，其還可感染多種組織，包括肌肉、腫瘤、肺、肝、胰島。HSV-1的感染能力可與腺病毒相當，比逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染能力幾乎強1000倍左右；4)此外，對HSV-1感染后的人類病理學、分子生物學和臨床方面已有深入的研究，并已建立了相應的動物模型，這與其他的新建議用來進行基因治療的病毒相比，對HSV-1的了解要徹底的多，從而臨床使用非常安全；5)HSV-1以非整合宿主細胞染色體的方式來進行感染，從而不存在造成宿主細胞遺傳突變的可能，從而與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，安全性要高的多；6)臨床上，已開發(fā)出多種抗HSV-1感染的藥物，如Acyclovir(ACV)或Ganciclovir(GCV)等在臨床上已實踐多年用于治療皰疹病毒感染，從而一旦臨床基因治療失控，上述藥物可有效的抑制病毒生長，從而中斷感染，為進行基因治療的個體提供了進一步的安全防護；7)HSV-1免疫刺激作用較弱，與腺病毒不同，HSV-1病毒具有掩蔽被感染的宿主細胞，使之不受機體免疫系統(tǒng)攻擊的能力；8)HSV-1可進行遺傳工程改造從而有條件的在靶向的腫瘤細胞中特異性的復制。
其最后一條特性使得HSV-1成為首個用于癌癥治療的腫瘤裂解性病毒載體(Martuza RLet al.Science 1991；252(5007)854-6)。已知，當病毒的早期基因，例如胸腺激酶(tk)或核苷酸還原酶基因(也就是，HSV中的ICP6基因)被缺失后，HSV-1具有能在激增的細胞中復制并導致細胞溶解，但不能在有絲分裂后期或增殖緩慢的細胞中復制的特性。G207是目前臨床上用于癌癥治療的HSV-1突變子該病毒衍生于野生型的HSV-1F株，其中導致腦炎的病毒雙拷貝ICP34.5基因雙雙進行了1kb的缺失突變，并且在編碼核苷酸還原酶的ICP6基因中插入lacZ基因使其失活，并保留了TK基因，使HSV能在腫瘤中大量復制，但不能在正常細胞中復制。這種遺傳改造減弱了HSV-1的神經(jīng)毒性，并使G207優(yōu)選的在快速增殖的腫瘤細胞中復制。實驗證實，在體內(nèi)和體外，G207能有效的殺滅各種細胞類型的人類腫瘤，其已經(jīng)通過來I期臨床實驗，證實在人體和動物體中均無細胞毒性；同時，由于保留了TK基因，可使用抗無環(huán)鳥苷等的一些常規(guī)抗病毒藥物如Acyclovir(ACV)或Ganciclovir(GCV)，來防止病毒過量復制造成的毒性反應。
本發(fā)明人在G207載體的基礎(chǔ)上，通過選擇抗血管生成的血管抑素和內(nèi)皮抑素的融合基因來代替G207中的lacZ基因，從而構(gòu)建得到了除了具有能有效的裂解腫瘤的效果外，還具有抗血管生成的功能的重組病毒AE618。
由于原發(fā)性瘤及其轉(zhuǎn)移瘤需要新的血管生成來支持其生長和存在，并且已知非小細胞肺癌需要較高的血管生成。基于上述原因，申請人選擇了血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因作為治療基因用于針對性的治療肺癌。
血管抑素(angiostatin)是O’Reilly等于1994年發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子，其來源于腫瘤細胞，為纖維蛋白溶酶原1-4 kringles的裂解片段，能強烈特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，阻止新生血管生成。Ambs等研究表明，將血管抑素的cDNA構(gòu)建于質(zhì)粒PMB75.6后轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞B16F10，體外培養(yǎng)腫瘤增殖被抑制，而將篩選獲得不同表達量(低中高表達)的細胞系分別接種于C57BL/6小鼠，結(jié)果顯示腫瘤生長抑制程度與血管抑素表達量成正比，但作用較短暫。用高表達的細胞系靜脈注射接種，26天后，肺腫瘤轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(＜3個/側(cè))，而對照組有一半小鼠多于150個/側(cè)，提示血管抑素高表達能有效抑制原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤，呈劑量依賴性，并需反復使用。
內(nèi)皮抑素(endostatin)是O’Reilly等1997年發(fā)現(xiàn)的又一種血管生成抑制因子，是膠原VIII因子的C末端片段，其抑制血管內(nèi)皮細胞增殖作用與血管抑素相當，兩者抗血管生成作用強于其他血管生成抑制因子。Yoon等將轉(zhuǎn)染了內(nèi)皮抑素基因的腫瘤細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，4周后很少出現(xiàn)或不出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移腫瘤。而皮下注射未能抑制肺轉(zhuǎn)移腫瘤的形成，可能與不同組織內(nèi)皮抑素表達量不同有關(guān)；他們還用25％轉(zhuǎn)染了內(nèi)皮抑素基因的腫瘤細胞和75％未轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞混合接種于小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)其抑制原發(fā)腫瘤形成的效果與100％轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制基因的腫瘤細胞相當。提示只要少量內(nèi)皮抑制基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞就能抑制腫瘤細胞生長。研究還表明，內(nèi)皮抑素主要抑制不同臟器內(nèi)原發(fā)或轉(zhuǎn)移癌的形成，對于已形成的腫瘤效果較差。
在本發(fā)明中，我們采用了類似G207分子架構(gòu)的病毒，作為原始的病毒載體，構(gòu)建了表達抗血管生成蛋白的重組病毒載體。攜帶的融合基因受到人延長因子基因(hEF-1)啟動子的調(diào)控，并在其5’末端具有IL12的信號肽。我們采用在ICP6的編碼區(qū)插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因來使ICP6失活，從而獲得新的重組病毒AE618。
由于實際上在人體作用的藥物受到各種因素的影響，例如腫瘤局部的滲透性、藥物在不同類型腫瘤內(nèi)的降解速度、腫瘤對血管供應的敏感性等等，基于理論構(gòu)建的重組病毒是否能有效的實現(xiàn)其預期的治療目的，必須通過實驗，特別是動物模型的驗證才能成立。尤其是，由于不同的腫瘤組織起源不同，往往差別更大。此外，腫瘤的產(chǎn)生是基于基因突變，這標志著腫瘤細胞的基因具有不穩(wěn)定性，這使得基因治療藥物的效果往往與預先理論設(shè)想的相去甚遠，使得藥物的有效性無法預測。因此，我們通過下文中的實施例中的具體實驗，進一步驗證了我們構(gòu)建獲得的可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒的治療效果。我們的實驗數(shù)據(jù)證實，AE618重組病毒不僅能通過病毒復制的方式裂解殺死肺癌細胞，還能通過其分泌的抗血管生成蛋白來抑制腫瘤的生長。
一方面，本發(fā)明涉及一種可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒，其特征在于所述的單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因均被部分缺失，并在其非復制所必須的基因內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使該基因失活。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其中所述的非復制所必須的基因為ICP6基因。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其能選擇性的在肺癌腫瘤細胞內(nèi)復制。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其能通過病毒復制的方式選擇性的在肺癌腫瘤內(nèi)擴散，能感染至靶細胞以外的腫瘤細胞。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其能通過病毒復制的方式裂解性的殺死分裂旺盛的肺癌腫瘤細胞。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其分泌的血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，從而抑制肺癌腫瘤的生長。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其為溫度敏感突變株，在高于39.5℃的條件下所述的重組病毒增殖失活。
如上文所述的重組單皰疹病毒，其對常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC敏感，常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC可抑制所述重組單皰疹病毒的生長。
一方面，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒的方法，其步驟是1)部分缺失單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因；2)在HSV-1的ICP6基因的內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使ICP6基因失活。
另一方面，本發(fā)明涉及一種含有上述重組單皰疹病毒的藥物組合物。
如上文所述的藥物組合物，其中所述的藥物組合物可以是注射劑、噴射劑及其他常規(guī)的藥物劑型形式。
包括本發(fā)明的藥物的藥物組合物可以通過已知的方法配制，例如通過與藥學上可接受的載體混合。這種載體和配制的方法的例子可從Remington’s藥物科學上查到。為了形成一適于有效給藥的藥學上可接受的組合物，該組合物將含有有效量的所述藥物。藥物的有效量將根據(jù)各種因子如個體的條件，重量，性別和年齡而變化。其他的因子包括給藥模式。藥物組合物可通過各種途徑對個體給藥，例如局部的(包括腫瘤內(nèi)的)，和全身的。
本發(fā)明的藥物可以以傳統(tǒng)用于給藥的賦形劑的廣泛的治療藥劑形式來給藥。例如，所述藥物可以以各種劑量的形式，如片劑，膠囊(每一片包括定時釋放和持續(xù)釋放的制劑)，丸劑，粉劑，粒劑，溶液，懸浮液，脂質(zhì)體和其他可能的藥物劑型方式，或通過注射方式，經(jīng)靜脈或腫瘤內(nèi)直接給藥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，其特征在于所述的單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因均被部分缺失，并在其ICP6基因的內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使ICP6基因失活。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療和預防肺癌復發(fā)的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能選擇性的在肺癌腫瘤細胞內(nèi)復制。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能通過病毒復制的方式選擇性的在肺癌腫瘤內(nèi)擴散，能感染至靶細胞以外的腫瘤細胞。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能通過病毒復制的方式裂解性的殺死分裂旺盛的肺癌腫瘤細胞。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒分泌的血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，從而抑制肺癌腫瘤的生長。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒為溫度敏感突變株，在高于39.5℃的條件下所述的重組病毒增殖失活，從而提高基因治療的安全性。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒對常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC敏感，可通過常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC來抑制所述重組單皰疹病毒的生長，從而提高基因治療的安全性。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒可與各種常規(guī)的其他抗癌藥物或手術(shù)、放療、化療藥物聯(lián)合應用。
如上文所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒通過局部或全身注射的方式給藥。
對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，本發(fā)明所采用的各種基因工程操作方法、實驗條件、常規(guī)試劑均采用本領(lǐng)域常用的各種方法、條件和常規(guī)試劑，在現(xiàn)有的教科書(如，分子克隆實驗指南，第二版)中均有詳細的記載，因此本說明書不對其作進一步的說明。本發(fā)明所采用的各類試劑、載體均為商業(yè)化可購得的試劑、載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)中的有關(guān)教導，按照本說明書的記載能毫無困難的實施本發(fā)明。
本發(fā)明所述技術(shù)方案的各種改進，對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的，其并未背離本發(fā)明的范圍和主旨。雖然下文將結(jié)合特定實施例來進一步闡明本發(fā)明，但應當這樣理解，權(quán)利要求所要求保護的發(fā)明不應當過分的局限于該特定實施例的技術(shù)方案中。事實上，本發(fā)明試圖包括那些對于化學或生物學或相關(guān)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，對為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的而記載的技術(shù)方案的顯而易見的各種改進。上述說明書中提到的所有出版物在此并入?yún)⒖肌?br>

圖1采用對照感染，或采用G207和AE618感染處理的肺癌細胞A549中的血管抑素和內(nèi)皮抑素的表達。結(jié)果顯示，采用AE618感染顯著增加了A549細胞中的內(nèi)皮抑素和血管抑素的表達。而作為對照的未感染組和不帶血管抑制因子和內(nèi)皮抑制因子的病毒G207組均不表達融合蛋白。第二行采用微管蛋白作為蛋白加樣量的內(nèi)對照。
圖2AE618和G207對肺癌細胞H460的細胞裂解效果比較。(A)在0.1的M.O.I下，在處理后的1至5天，對分別采用表達血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白的病毒AE618處理和對照病毒G207處理的肺癌細胞H460進行活細胞計數(shù)，計數(shù)結(jié)果沒有顯著差異；(B)分別采用AE618和G207處理H460肺癌細胞，在處理后第3天進行活細胞技術(shù)。在滴度為0.001至10之間，兩種處理獲得的技術(shù)結(jié)果之間沒有顯著差異。該結(jié)果表明，重組病毒AE618保留了對肺癌細胞的裂解性殺傷的能力，對腫瘤細胞有完全的抑制作用。
圖3人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)與以0.1的M.O.I的AE618或G207感染的H460肺癌細胞共培養(yǎng)。在處理后的第3天和第4天，與G207處理的對照組相比，采用AE618處理的對照組中的人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)數(shù)量顯著下降，出現(xiàn)明顯的生長抑制。這說明被AE618感染的肺癌細胞能釋放血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白，從而對血管細胞的生長產(chǎn)生了抑制。
圖4在SCID鼠模型中，AE618對人腫瘤細胞的抗腫瘤效果。從感染后第6天開始，重組病毒AE618的體內(nèi)抗腫瘤效果顯著高于G207。本圖以感染后的每一天的原始腫瘤的尺寸倍數(shù)變化來表示。病毒感染的肺癌腫瘤模型表明，注射AE618病毒的腫瘤其生長速率遠低于不注射病毒的PBS對照組，也顯著地低于不表達血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白的對照病毒G207組。
圖5質(zhì)粒pICP34.5-BLU的質(zhì)粒圖譜。
圖6HSV-1ICP 34.5基因位置結(jié)構(gòu)。
圖7質(zhì)粒pICP34.5-BLU28的質(zhì)粒圖譜。
圖8重組病毒v345281的構(gòu)建過程。
圖9質(zhì)粒pGT65質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜。
圖10質(zhì)粒pBLUESCRIPT-KS的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜。
圖11質(zhì)粒pICP6-SU6/KS的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖12質(zhì)粒pAE的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖13AE618的溫度敏感性檢測結(jié)果。
圖14AE618對GCV的敏感性結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術(shù)方案將采用如下非限制性實施例進一步的說明。
實施例1重組病毒AE618的構(gòu)建
(a)HSV-1病毒的F株病毒DNA的制備方法用于重組的HSV-1病毒的F株由美國ATCC公司購得。用該病毒在MOI＝1的條件下感染培養(yǎng)的Vero細胞(美國ATCC公司)。24-36小時后待大部細胞呈現(xiàn)細胞病變(CPE)時，收集細胞并轉(zhuǎn)入15ml離心管離心去除細胞培養(yǎng)液。加入0.3ml細胞裂解液(含100Mm NaCl，10Mm Tris.HClpH 8，25Mm EDTA pH8和0.5％SDS)裂解感染細胞并用RNaseA(10mg/ml)65度處理1小時，上述裂解液先用等體積的酚再用等體積的酚/氯仿(1∶1)混合液抽提，含DNA的水相溶液轉(zhuǎn)移到新的離心管后加入1/2體積的7.5M醋酸胺和2倍體積的無水酒精，靜置10分鐘后離心得到病毒DNA沉淀，用20-100ul Tris/EDTA緩沖液溶解后于4℃保存，制備得到原始HSV-1病毒DNA。
(b)缺失基因ICP34.5的具體實驗步驟構(gòu)建質(zhì)粒pICP34.5BLU28取5μg純化的HSV-1F株病毒DNA用限制性內(nèi)切酶PstI消化并分離純化得到包含有ICP34.5基因的一個14509bp的片段。該片段進而用XhoI和SapI(NEWENGLAND)消化分離得到一個5853bp的較小片段，該XhoI/SapI片段在將SapI端用T4DNA合成酶補平后克隆入質(zhì)粒pBLUESCRIPT的XhoI和EcoRV端得到質(zhì)粒pICP34.5-BLU(圖5)，質(zhì)粒pICP34.5-BLU用Bsu36I(NEW ENGLAND，BIOLABS)和BstEII消化得到1699bp(BstEII/Bsu36I)和7089bp(Bsu36I/BstEII)兩個片段，前者包含有ICP34.5基因3’端的大部，電泳分離后，將7089bp片段保存而1699bp片段進一步用AseI消化，電泳分離后得到一個705bp(AseI/Bsu36I)和一個994bp(BstEII/AseI)的片段，如圖6所示，后者包含ICP34.5基因從第84個脫氧核糖核酸(相當于第28個氨基酸)以后的所有堿基編碼序列，與此同時合成一條雙鏈寡核苷酸(正鏈5’GTTACCGTTTAAACAT 3’，反鏈5’TAATGTTTAAACG 3’)，其一端為BstEII，另一端為AseI，最后，將上述7089bp(Bsu36I/BstEII)，705bp(AseI/Bsu36I)和寡核苷酸鏈混合，加入T4連接酶和相應的緩沖液在室溫下反應30分鐘后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到質(zhì)粒pICP34.5-BLU28(圖7)，其中包含的ICP34.5基因編碼區(qū)的第84到991個堿基被上述合成的寡核苷酸所取代，從而ICP34.5基因編碼區(qū)第28個氨基酸3’端以后被全部去除。
(c)重組病毒v345281的構(gòu)建過程(見圖8)。
重組質(zhì)粒pICP34.5BLU28(圖7)與純化的HSV-1F株病毒DNA共轉(zhuǎn)染Vero細胞獲得具有缺失ICP34.5基因的重組病毒(v345281)(共轉(zhuǎn)染的具體過程見圖8)。
質(zhì)粒pICP34.5-BLU28與5μg純化的HSV-1病毒DNA用LIPOFECTAMINE(GIBCOBRL)按公司的產(chǎn)品說明書所推薦的方法共同轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的Vero細胞內(nèi)，基于同源重組機制，病毒基因組中原有的ICP34.5基因被質(zhì)粒中的DNA序列所替代，而產(chǎn)生重組的HSV-1病毒，從上述過程中共得到92個病毒斑，分別感染在96孔細胞培養(yǎng)板上生長的Vero細胞，待全部細胞出現(xiàn)病變后，收集病毒并取部分病毒按上述的方法提取病毒DNA，重組病毒的挑選采用Southem Blotting，首先，以0.3μg被去除ICP34.5基因序列的片段(991bp，BstEII/AseI)作為模版制備標記有32P的探針(random primer labelingkit，GIBCO BRL)，然后，每株病毒各取0.1μg點在cellulous膜上，上述探針在60度下雜交15小時以鑒定病毒ICP34.5基因區(qū)的存在與否，在上述92株病毒中有5株表現(xiàn)有ICP34.5缺失，用BamHI和NcoI對該5株病毒的DNA消化后作凝膠電泳，并進一步從質(zhì)粒pICP34.5-BLU28上切下的BamHI/AseI(1315bp)片斷為模版得到32P標記的探針作Southern鑒定。發(fā)現(xiàn)其中一株為兩個ICP34.5基因拷貝均缺失，命名為v34528。經(jīng)DNA測序鑒定，證實其兩個ICP34.5基因均已被去除。
(d)在基因ICP6的位置插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因的具體實驗步驟構(gòu)建具有含Endostatin和Angiostatin的融合基因表達盒及ICP6旁側(cè)序列的重組質(zhì)粒pAE，重組質(zhì)粒pAE與重組病毒V34528的病毒DNA共轉(zhuǎn)染VERO細胞，獲得在ICP6基因位置中插入表達Endostatin和Angiostatin的融合基因的重組病毒AE618。
構(gòu)建重組質(zhì)粒pAE的具體實驗步驟1.首先將ICP6基因克隆到克隆載體pBlueScriptKS中獲得質(zhì)粒pICP6-SU6/KS。含EndostatinAngiostatin的融合基因表達盒的質(zhì)粒pGT65(圖9)購自InvivoGen Co.。質(zhì)粒pICP6-SU6/KS的制備取2μg質(zhì)粒pBLUESCRIPT-KS(圖10)用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI各10單位在50ul相應的緩沖液中于37度下消化2小時后，用1％瓊脂凝膠電泳分離并經(jīng)小提DNA純化柱(QIAGIN)純化后得到質(zhì)粒片段，同時取5μg的通過前述方法純化得到的HSV-1 F株病毒DNA，采用限制性內(nèi)切酶BglII和SacI在同樣的消化條件下消化，并分離純化得到包含有ICP6基因的一個3573bp的片段，該BglII/SacI片段與上述pBLUESCRIPT-KS質(zhì)粒的BamHI/SacI片段混合后，加入5單位的T4 DNA連接酶和相應的反應緩沖液達到總體積20ul，室溫下反應30分鐘后，取5ul轉(zhuǎn)入敏化的DH5 Ecoli細胞。在含有100μg/ml ampiciline的培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時后長出的菌落，用QIAGEN的質(zhì)粒小量提純套液，提取并酶切鑒定得到質(zhì)粒pICP6-SU6/KS(圖11)。
2.將Endostatin，Angiostatin的融合基因表達盒插入質(zhì)粒pICP6-SU6/KS獲得重組質(zhì)粒pAE。
質(zhì)粒pAE的構(gòu)建上述質(zhì)粒pICP6-SU6/KS在插入的HSV-1的ICP6基因中有兩個BamHI切點(如圖11所述)，該質(zhì)粒用BamHI在上述條件下消化后，加入5ul含10單位T4DNA合成酶和四種脫氧核糖核酸(各自濃度為10uM)的混合溶液繼續(xù)在37度反應30分鐘以補平，電泳純化后去除兩BamHI點之間的片段(764bp)并得到質(zhì)粒片段(5736pb)，同時，將含Endostatin，Angiostatin的融合基因表達盒的質(zhì)粒pGT65(圖9)用與上述類似的反應條件用XhoI和SwaI消化并用T4 DNA合成酶在同樣條件下補平兩端，電泳純化后得到含EndoAngio基因表達單位的片段(2854pb)，該片段和上述5736pb的pICP6-SU6/KS質(zhì)粒片段用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中得到質(zhì)粒pAE。質(zhì)粒pAE的內(nèi)切酶譜見圖12。
3.將重組質(zhì)粒pAE與重組病毒V34528的病毒DNA共轉(zhuǎn)染VERO細胞，獲得在ICP6基因位置中插入表達Endostatin和Angiostatin的融合基因的重組病毒AE618。
用與上述構(gòu)建v34528病毒同樣的方法，將質(zhì)粒pAE與純化的v34528病毒DNA共同轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的Vero細胞內(nèi)，基于上述相同的同源重組機制，ICP6基因編碼區(qū)段的序列被pAE中的Endo:Angio融合基因表達單位的DNA序列代替，在得到的53株病毒中，用PCR方法鑒定是否包含有Endo:Angio融合基因表達單位。PCR上游和下游引物的序列選自Endo:Angio融合基因表達單位內(nèi)部，其理論PCR產(chǎn)物的長度應為330bp。上游和下游引物的序列如下上游5’ACGCATCTTCTCC TTTGACGG 3’下游5’GTCCCTCTGTAGTTCTTTCCATT 3’PCR條件為0.05μg病毒DNA模版，0.5單位TaqDNA合成酶，5％DMSO和10mMMgCl2，首先在94℃下失活5’之后按94℃ 45”-52℃ 45”-72℃ 45”作25次循環(huán)。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示其中有9株為重組病毒，經(jīng)測序鑒定，證實這些病毒基因組中的ICP6基因中第536到第1300的堿基對按設(shè)計要求被上述Endo:Angio基因表達單位的片段所替代，同時兩個ICP34.5基因拷貝均缺失其編碼區(qū)的第84到991個堿基，該病毒命名為AE618，篩選分離后的AE618病毒在Vero細胞上生長繁殖后置于攝氏零下80度保存。
培養(yǎng)所采用的細胞系非小細胞肺癌細胞系NCI-H460(ATCC HTB-177)和A549(ATCCCCL-185)來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。將該細胞培養(yǎng)于添加有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中(Dulbecco’s modified Eagle medium)。
人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)培養(yǎng)于添加有2％ FCS和豬腦提取物部分富含的成纖維細胞生長因子(1μg/m))的MCDB 107(JRH Biosciences，Lenexa，KS)培養(yǎng)基中。
實施例2在感染AE618的癌細胞中檢測融合蛋白的表達感染前，在37℃下，在10cm平皿中平板培養(yǎng)肺癌A549細胞(1×106)4小時。然后將其分別采用G207、AE618、或空白對照來進行感染(每一感染滴度M.O.I.＝1.0)，并將感染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時。采用PBS沖洗培養(yǎng)細胞樣品兩次，隨后從平皿中將細胞輕輕刮下，并采用細胞裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，1％ NP40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％ SDS)來裂解細胞。將全部細胞裂解產(chǎn)物煮沸，并經(jīng)Bradford法(Bio-Rad，Hercules，CA)來檢測蛋白質(zhì)濃度。取等量的蛋白(100μg)樣品在還原條件下在15％的丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)膜至Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(Millipore，Bedford，MA)，接著將膜置于5％的脫脂奶粉中封閉，并在4℃下，將其置于含有0.2％的Tween-20的TBS(TBS-T)中過夜，隨后在室溫下與一抗溫育1小時。采用TBS-T洗膜3次，每次5分鐘。針對內(nèi)皮抑素和血管抑素的一抗購于R & D Systems Inc.(Minneapolis，MN)，針對γ-微管蛋白(sc-7396同上)的一抗購于Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)。采用與辣根過氧化物酶結(jié)合的兔抗羊抗體(Pierce，Rockford，IL)作為二抗。通過魯米諾化學發(fā)光試劑(Santa Cruz)來顯色蛋白質(zhì)。
通過上述的免疫印跡實驗，結(jié)果顯示在以1.0 M.O.I.的AE618感染24小時后的A549肺癌細胞中，內(nèi)皮抑素和血管抑素的表達均顯著增加。與空白對照相比，采用G207感染的A549細胞中上述蛋白的表達沒有任何的增加(圖1)。該結(jié)果有力的證明了本發(fā)明構(gòu)建得到的AE618重組病毒中整合的endostatin-angiostatin融合蛋白基因得到了表達并具有完整的功能。
實施例3重組病毒AE618的細胞裂解效應的檢測將A549和H460肺癌細胞系(1×105)均置于12孔組織培養(yǎng)板中，在37℃下培養(yǎng)4小時，隨后以各種濃度的G207和AE618重組病毒以及空白對照來感染細胞，并將細胞繼續(xù)培養(yǎng)幾天。在經(jīng)胰蛋白酶處理后，收集細胞并重懸于PBS溶液中。向細胞懸液中加入等體積的含0.1％臺酚藍的PBS。隨后利用血細胞計數(shù)器來進行活細胞計數(shù)。所有的細胞計數(shù)均取3份樣本計數(shù)的平均值。
對于感染后1至5天的H460肺癌細胞的細胞計數(shù)結(jié)果表明，與空白對照相比，從感染后的第二天開始采用病毒處理的組中的活細胞數(shù)目顯著下降(p＜0.001)。在采用AE618處理的組和G207處理的組之間的活細胞計數(shù)比較不存在顯著差異(p＞0.05，圖2A)。
此外，同樣的采用滴度為0.001至10的AE618和G207分別感染H460細胞系。處理后第3天開始進行活細胞計數(shù)。如圖2B所示，在所有的滴度下兩種病毒處理后的細胞計數(shù)沒有顯著不同。
上述的實驗結(jié)果表明，我們構(gòu)建得到的重組病毒AE618仍然完整的保持了其親本病毒對肺癌細胞的裂解作用。
實施例4由采用AE618感染的癌癥細胞分泌的蛋白對HUVEC生長的抑制作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)(3×106)培養(yǎng)于35mm的6孔雙層培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24小時后，將分別被滴度為0.1的空白對照、G207和AE618重組病毒感染的H460肺癌細胞(5×104)接種于底部具有0.4-μm大小的微孔的細胞培養(yǎng)池中(Cat.#353090，BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，并將其置于生長有HUVEC的培養(yǎng)孔中。上述微孔允許培養(yǎng)孔和細胞培養(yǎng)池的培養(yǎng)基中的蛋白相互流通。該培養(yǎng)基中加入了0.2％的人γ-球蛋白(ICNBiomedicals，Inc.)來防止HUVEC受到感染的H460細胞釋放的病毒的二次感染。從而上述操作使得HUVEC與被病毒感染的H460細胞實現(xiàn)了共培養(yǎng)。在處理后的1至4天，分別收集人臍靜脈內(nèi)皮細胞和H460肺癌細胞，并隨后采用血細胞計數(shù)器來進行活細胞計數(shù)。所有的細胞計數(shù)均取3份樣本計數(shù)的平均值。
結(jié)果顯示，雖然由于培養(yǎng)基中的病毒蛋白的一般毒性的作用，與感染了任何一種病毒的H460細胞共培養(yǎng)的HUVEC細胞的生長速率均發(fā)生下降，但是從結(jié)果中可觀察到，在處理后第3至4天，采用AE618處理的組的HUVEC細胞的活細胞計數(shù)要顯著低于采用G207處理的組(p＝0.004和p＜0.001；圖3)。該結(jié)果表明重組病毒AE618中克隆的內(nèi)皮抑素和血管抑素融合基因的確得到了表達，且其表達的融合蛋白的確具有抑制血管生成的作用。
實施例5動物實驗將0.05mL的含有百萬H460細胞(1×106)的無菌Hanks緩沖鹽溶液經(jīng)皮下分別注射至SCID鼠(Charles River)的背部兩側(cè)。在植入腫瘤16至18天后開始采用重組病毒來治療腫瘤。將重組病毒AE618、G207和等體積的PBS溶液(每只小鼠分別注射50ul的含有107pfu病毒的溶液)注入右側(cè)的腫瘤中。每個治療組中包括6只小鼠。在治療前(第0天)和治療后(第1至13天)，通過公式V＝L*W*W/2000分別計算腫瘤的大小。數(shù)據(jù)表示的為相對于原始腫瘤大小的倍數(shù)變化，例如治療后的某天的V/第0天的V。
與PBS處理的對照組相比，從治療后的第2天(其P值分別為p＝0.013和p＝0.009)至第13天(其P值分別為p＝0.008和p＝0.006)，G207和重組病毒AE618均顯著的抑制了異種皮移植的H460腫瘤的生長(圖4)。從治療后的第6天開始，采用AE618治療的組中的腫瘤大小持續(xù)的顯著小于采用G207治療的組(p＜0.03)。該結(jié)果表明，重組病毒AE618比其親本病毒G207具有顯著的意料不到的良好的治療效果。
統(tǒng)計方法在無特別說明的情況下，所有的實驗均重復3次。采用平均值±標準誤來表示實驗結(jié)果。采用單尾t-測驗來進行統(tǒng)計比較。P值小于0.05表示存在顯著差異。
實施例6重組病毒AE618的溫度敏感性由于AE618的母本HSV-1F株的極早基因ICP4中存在點突變(Preston 1981；DeLuca andSchaffer 1985)，同時其ICP6基因的缺失可進一步增加其溫度敏感性(Goldstein and Weller1988)，從而可以預測重組病毒AE618也應保留該特征，為一溫度敏感突變型。如下將通過實驗來證實重組病毒AE618的溫度敏感性。
如上文所述采用重組的AE618病毒感染Vero細胞后，分別在37℃和39.5℃下培養(yǎng)細胞48小時。在感染后不同時間收獲細胞并繼而進行毒斑滴定。
結(jié)果如圖13所示，在37℃條件下，在48小時內(nèi)，AE618的病毒滴度增加了三個Log(即三個數(shù)量級，一千倍)；而在39.5℃條件下，AE618在細胞內(nèi)停止繁殖，48小時后，其滴度反而降低了1.5個數(shù)量級(150倍)。該項結(jié)果說明，AE618保留了其野生母株F病毒在ICP4基因上的點突變。這一特性對于AE618的安全性非常重要。這表明，在治療時一旦病人產(chǎn)生由炎癥引起的發(fā)燒癥狀時，由于AE618的該項溫度敏感性特定，其在體內(nèi)生長繁殖可以自動的受到抑制，從而減低了產(chǎn)生并發(fā)癥的危險性，大大提高了重組病毒AE618作為應用于人體的基因治療重組病毒的安全性。
實施例7AE618對常規(guī)抗病毒藥物GCV(Ganciclovir)的敏感性由于AE618保留有了HSV-1自身的TK基因，因而與其他攜帶有HSV-1 TK基因的病毒一樣，重組病毒AE618對抗皰疹病毒藥物GCV或ACV有一定的敏感性。先前的研究表明，ICP6的缺失可進一步增加病毒對這類藥物的敏感性(Yamada，Yamamoto et al.1991；Mineta，Rabkin et al.1994)。如下將通過具體實驗來驗證重組病毒AE618的對常規(guī)抗病毒藥物GCV的敏感性。
如上文所述，將重組病毒AE618和G207以及F株病毒感染Vero細胞后，分別在不加或添加有不同濃度的GCV的培養(yǎng)液中生長。在感染后48小時收獲細胞并繼而進行毒斑滴定。
圖14的結(jié)果表明，AE618與G207對GCV的敏感性完全一樣(曲線幾乎完全重合)，其對抗病毒藥物GCV的敏感性均比野生型的HSV-1(F)病毒株高大約10倍。圖中數(shù)據(jù)以與同樣條件、但不含GCV時的病毒的生成滴度為比較來表示(即不含GCV時生成的病毒滴度為100％)。由圖可見，GCV濃度在每毫升100微克時可完全抑制VAE在體外的生長。該結(jié)果進一步表明，當采用重組病毒AE618進行基因治療時，一旦病毒增殖失控，可采用常規(guī)的抗皰疹病毒治療劑GCV來抑制AE618的增殖，從而進一步增加重組病毒AE618的基因治療安全性。
結(jié)果討論抗血管生成是一條治療人類腫瘤有希望的途徑。血管抑素和內(nèi)皮抑素顯示出能有效的抑制原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中的新血管形成。在臨床應用中，這種治療途徑的主要局限在于如何在腫瘤部位獲得達到治療水平的蛋白根據(jù)血管抑素和內(nèi)皮抑素在動物實驗中的劑量推算，血管抑素的有效劑量應為沒人每天0.1至1.0g以上，內(nèi)皮抑素的劑量應約為20mg/kg.d；因此如何獲得大量、高純度、高活性的血管抑素和內(nèi)皮抑素是目前急需解決的問題。在本發(fā)明中，我們將血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白基因整合至一有效復制的腫瘤裂解性HSV-1載體G207，從而構(gòu)建得到了一種新的重組病毒，將其命名為AE618。當重組病毒AE618在感染的腫瘤細胞內(nèi)復制時，宿主腫瘤細胞同樣能分泌抗血管生產(chǎn)蛋白來防止給實體瘤提供養(yǎng)分的血管的生長。同時，由于AE618是一種裂解性病毒，一旦其感染的腫瘤細胞由于病毒復制而發(fā)生裂解時，釋放的病毒粒子將可能感染更多的鄰近的細胞從而能產(chǎn)生更多的抗血管生成蛋白。我們的實驗數(shù)據(jù)證實，由AE618感染的腫瘤細胞可分泌足夠的抗血管生成蛋白。由感染了AE618的細胞分泌的蛋白可顯著抑制人內(nèi)皮細胞的生長。同時，AE618仍然保持了其親本病毒G207的裂解腫瘤的特性。這兩種治療途徑的組合將有利于其臨床上應用于癌癥基因治療。由于重組病毒AE618的高腫瘤特異性選擇復制和較低的組織毒性，AE618可成為一種用于肺癌治療的潛在的安全性藥物。
在本發(fā)明的雙層培養(yǎng)系統(tǒng)中，與感染了G207的H460肺癌細胞共培養(yǎng)的存活的HUVEC細胞的數(shù)目顯著低于空白對照，這表面人γIgG不能完全的保護HUVEC使其免受G207或AE618引起的細胞毒性。但是計數(shù)結(jié)果同樣表明，盡管采用相同的滴度來處理，重組病毒AE618仍然顯示出顯著高于G207的對HUVEC生長的抑制，這表明由H460細胞分泌的endo:angio融合蛋白的確具有抑制血管生成的作用。然而，由于病毒對HUVEC造成的的至細胞病變可能，分泌的融合蛋白的效果可能被低估了。我們的體內(nèi)實驗結(jié)果證實，與G207相比，AE618對于SCID鼠中的人類腫瘤生長具有顯著的抑制作用。
綜上所述，本發(fā)明中的AE618能有效的在臨床上用于肺癌的治療。
附表1Endo:Angio融合基因DNA序列斜體氨基端信號肽帶下劃線部分抗內(nèi)皮細胞因子基因 連接肽正常字體部分抗血管生成因子基因ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGGCCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAG GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGTGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTGTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTATGA
權(quán)利要求
1.一種可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒，其特征在于所述的單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因均被部分缺失，并在其非復制所必須的基因內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使該基因失活。
2.如權(quán)利要求1所述的重組單皰疹病毒，其中所述的非復制所必須的基因為ICP6基因。
3.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其能選擇性的在肺癌腫瘤細胞內(nèi)復制。
4.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其能通過病毒復制的方式選擇性的在肺癌腫瘤內(nèi)擴散，能感染至靶細胞以外的腫瘤細胞。
5.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其能通過病毒復制的方式裂解性的殺死分裂旺盛的肺癌腫瘤細胞。
6.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其合成的血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白能有效的分泌并抑制血管生成，從而抑制肺癌腫瘤的生長。
7.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其為溫度敏感突變株，在高于39.5℃的條件下所述的重組病毒增殖失活。
8.如權(quán)利要求2所述的重組單皰疹病毒，其對常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC敏感，常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC可抑制所述重組單皰疹病毒的生長。
9.一種構(gòu)建可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒的方法，其步驟是1)部分缺失單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因；2)在HSV-1的ICP6基因的內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使ICP6基因失活。
10.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-8中任意一項所述的重組單皰疹病毒作為活性成分。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述的藥物組合物可以是注射劑、噴射劑及其他常規(guī)的藥物劑型形式。
12.一種可分泌血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，其特征在于所述的單皰疹病毒HSV-1的兩個ICP34.5基因均被部分缺失，并在其ICP6基因的內(nèi)部插入血管抑素和內(nèi)皮抑素融合基因使ICP6基因失活。
13.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療和預防肺癌復發(fā)的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能選擇性的在肺癌腫瘤細胞內(nèi)復制。
14.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能通過病毒復制的方式選擇性的在肺癌腫瘤內(nèi)擴散，能感染至靶細胞以外的腫瘤細胞。
15.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒能通過病毒復制的方式裂解性的殺死分裂旺盛的肺癌腫瘤細胞。
16.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒分泌的血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，從而抑制肺癌腫瘤的生長。
17.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒為溫度敏感突變株，在高于39.5℃的條件下所述的重組病毒增殖失活，從而提高基因治療的安全性。
18.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒對常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC敏感，可通過常規(guī)抗病毒藥物AVC、GVC來抑制所述重組單皰疹病毒的生長，從而提高基因治療的安全性。
19.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒可與各種常規(guī)的其他抗癌藥物或手術(shù)、放療、化療藥物聯(lián)合應用。
20.如權(quán)利要求12所述的重組單皰疹病毒在制備治療肺癌的藥物中的應用，所述的重組單皰疹病毒通過局部或全身注射的方式給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組單皰疹病毒和采用該重組病毒進行人類腫瘤的基因治療方法。特別是涉及帶有血管抑素和內(nèi)皮抑素蛋白的重組單皰疹病毒，及其在治療或預防肺癌中的應用。還涉及含有該重組病毒的藥物組合物。本發(fā)明的重組單皰疹病毒能在腫瘤細胞中表達具有抑制血管生成作用的血管抑素和內(nèi)皮抑素融合蛋白，并且該病毒在腫瘤內(nèi)裂解性增殖，從而實現(xiàn)了從抑制血管生成和裂解腫瘤細胞這兩個途徑來治療肺癌的目的。
文檔編號C12N7/01GK1702171SQ20051005347
公開日2005年11月30日 申請日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者瞿伯榮, 賈韋國, 強東, 楊振達 申請人:無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司