專利名稱：Glyt1轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法
背景技術(shù)：
甘氨酸是脊髓和腦干主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，也是NMDA受體的輔助興奮劑。甘氨酸的細(xì)胞外濃度至少由兩個Na+/Cl+-依賴的甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLYT1和GLYT2)調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過將甘氨酸重吸收進(jìn)突觸前神經(jīng)末端及圍繞的纖細(xì)的神經(jīng)膠質(zhì)突起中，在終止突觸后甘氨酸能的作用以及保持甘氨酸的細(xì)胞外低濃度方面發(fā)揮著重要的作用。GLYT2在嚙齒動物的脊髓、腦干和小腦高水平表達(dá)，在這些部位，其表達(dá)與馬錢子堿敏感的甘氨酸受體的存在緊密相關(guān)(Zafra，F(xiàn).，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt2)p.3952-69；Luque，J.M.，N.Nelson和J.G.Richards，Neuroscience，1995.64(2)p.525-35和Jursky，F(xiàn).和N.Nelson，J Neurochem，1995.64(3)p.1026-33)。免疫組織化學(xué)分析表明在推定的甘氨酸能突觸中主要定位于突觸前(Zafra，F(xiàn).，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Spike，R.C.，等人，Neuroscience，1997.77(2)p.543-51)，這強(qiáng)烈暗示了在甘氨酸能抑制性突觸傳遞的終止中的作用。人的GLYT2已經(jīng)被克隆，并且似乎表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式(Morrow，J.A.，等人，F(xiàn)EBS Lett，1998.439(3)p.334-40)。GLYT2具有一定程度的異質(zhì)性。事實(shí)上已經(jīng)在嚙齒動物的腦中鑒定了兩種GLYT2同種型(2a和2b)。
通過對于肌氨酸和甘氨酸的N-甲基化衍生物阻斷的敏感性，可以從藥理學(xué)上區(qū)分GLYT1和GLYT2(Liu，Q.R.，等人，J Biol Chem，1993.268(30)p.22802-8，Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)。已經(jīng)克隆了人glyt1基因，該基因編碼GLYT1a、1b、1c和1d 4個同種型(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)，而已經(jīng)鑒定的大鼠同種型只有GLYT1a和1b兩種(Guastella，J.，等人，Proc Natl Acad SciUSA，1992.89(15)p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。GLYT1似乎在大鼠CNS的神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元中都有表達(dá)(Zafra，F(xiàn).，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63；Zafra，F(xiàn).，等人，Eur J Neurosci，1995.7(6)p.1342-52)，GLYT1a在灰質(zhì)和一些外周組織有明顯表達(dá)，而GLYT1b只在CNS的白質(zhì)有表達(dá)(Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。在人類中，針對所有GLYT1同種型的通用探針揭示出GLYT1在一些外周組織有表達(dá)，最顯著的是腎，而GLYT1c似乎是大腦特異的(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)。GLYT1的同種型只在它們的氨基端和5’非編碼區(qū)存在差異(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。GLYT1a和GLYT1b來源于從交替的啟動子指導(dǎo)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄，而人GLYT1c則是GLYT1b轉(zhuǎn)錄物的剪接變體(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17；Adams，R.H.，等人，J Neurosci，1995.15(3 Pt 2)p.2524-32；Borowsky，B.和B.J.Hoffman，J Biol Chem，1998.273(44)p.29077-85)。由于在發(fā)表的研究之間明顯存在主要分歧，GLYT1的外周表達(dá)和同種型不同的CNS表達(dá)模式具有一定的爭議。GLYT1在脊髓、腦干和間腦中與GLYT2一同表達(dá)。有趣的是，GLYT1在沒有發(fā)現(xiàn)功能抑制性甘氨酸能神經(jīng)元的前腦區(qū)域(如腦皮層、海馬、嗅球)也有表達(dá)(Zafra，F(xiàn).，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Guastella，J.，等人，ProcNatl Acad Sci USA，1992.89(15)p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993 Eur J Neurosci，1995.7(6)p.1342-52)，由此暗示GLYT1的其它作用，這些作用可能包括調(diào)節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞(Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35)。
NMDA受體的激活需要谷氨酸和甘氨酸的結(jié)合。盡管谷氨酸以活性依賴的方式從突觸前末端釋放，但甘氨酸明顯以更穩(wěn)定的水平存在，表明具有更多的調(diào)節(jié)功能。對細(xì)胞外和腦脊液中甘氨酸濃度的測量表明甘氨酸以較低的微摩爾水平存在(Westergren，I.等人，J Neurochem，1994.62(1)p.159-65)。然而，甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以在NMDA受體的局部微環(huán)境顯著降低甘氨酸濃度。事實(shí)上，GLYT1b在非洲爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)被證明可以在共表達(dá)的NMDA受體位置降低甘氨酸濃度(Supplisson，S.和C.Bergman，J Neurosci，1997.17(12)p.4580-90)。此外，最進(jìn)的研究表明甘氨酸攝取機(jī)制可以調(diào)節(jié)突觸NMDA受體活性(Berger，A.J.，S.Dieudonne，和P.Ascher，J Neurophysiol，1998.80(6)p.3336-40；Bergeron，R.，等人，Proc Natl Acad Sci USA，1998.95(26)p.15730-4)。NMDA受體NR2亞基的性質(zhì)影響受體對甘氨酸的親和力，并且在重組系統(tǒng)中，含有NR2A的受體相對于含有NR2B、C或D的受體表現(xiàn)出明顯降低的甘氨酸親和力(Ikeda，K.，等人，F(xiàn)EBS Lett，1992.313(1)p.34-8；Kutsuwada，T.，等人，Nature，1992.358(6381)p.36-41；Priestley，T.，等人，Mol Pharmacol，1995.48(5)p.841-8)。在成熟過程中產(chǎn)生一組具有明顯較低甘氨酸親和力的NMDA受體，表明在正常生理?xiàng)l件下存在一組不被甘氨酸所飽和的NMDA受體，此組受體的產(chǎn)生與發(fā)育中NR2A表達(dá)的增加相平行(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，1998.18(6)p.1935-43)。
谷氨酸神經(jīng)傳遞(特別是NMDA受體活性)在突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶方面具有關(guān)鍵作用，如表現(xiàn)為門控突觸可塑性和記憶形成閾值的分級開關(guān)(graded switch)的NMDA受體(Hebb，D.，The organization of behavior.1949，New YorkWiley；Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)p.31-9)。過表達(dá)NMDA NR2B亞基的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的突觸可塑性和優(yōu)越的學(xué)習(xí)及記憶能力(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)p.63-9)。
NMDA受體的機(jī)能減退與精神分裂癥的病理生理學(xué)有關(guān)(Olney，J.W.和N.B.Farber，Arch Gen Psychiatry，1995.52(12)p.998-1007；Hirsch，S.R.，等人，Pharmacol Biochem Behav，1997.56(4)p.797-802)。非競爭性NMDA受體拮抗劑(如PCP和氯胺酮(ketamine))能夠誘導(dǎo)精神分裂癥-樣精神病(schizophrenia-like psychosis)(Allen，R.M.和S.J.Young，Am JPsychiatry，1978.135(9)p.1081-4；Javitt，D.C.和S.R.Zukin，Am JPsychiatry，1991.148(10)p.1301-8；Krystal，J.H.，等人，Arch GenPsychiatry，1994.51(3)p.199-214)，所述精神病整合了陽性和陰性癥狀以及認(rèn)知功能障礙，因此與患者的精神分裂癥非常相似(Javitt，D.C.，等人，Biol Psychiatry，1999.45(6)p.668-79)。NMDAR1亞基表達(dá)水平有所降低的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出相似于在藥理學(xué)誘導(dǎo)的精神分裂癥模型上觀察到的行為異常，這支持了NMDA受體活性降低導(dǎo)致精神分裂癥-樣行為的模型(Mohn，A.R.，等人，Cell，1999.98(4)p.427-36)。此外，缺乏NMDA受體2A亞基的小鼠在新環(huán)境中表現(xiàn)出自發(fā)運(yùn)動性增強(qiáng)，并且除海馬LTP和空間學(xué)習(xí)方面的缺陷外，在覓水任務(wù)(water-finding task)中還表現(xiàn)出潛在的學(xué)習(xí)受損(Miyamoto Y，Yamada K，Noda Y，Mori H，Mishina M和Nabeshima T，J Neurosci.2001 21(2)750-757)。
過度產(chǎn)生GLYT1的小鼠為評估GLYT1的生理功能提供了一種有用的工具。這些小鼠應(yīng)該在前腦表現(xiàn)出降低的甘氨酸水平，并且可以將它們用于研究NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)占據(jù)的活性調(diào)節(jié)對于NMDA受體的生理功能是否重要這一問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物的遺傳構(gòu)建體和方法，所述轉(zhuǎn)基因動物的基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA。還可以使用這些轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生過表達(dá)活性GLYT1的轉(zhuǎn)基因動物。此外，也提供所述過表達(dá)GLYT1蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物和產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明也涉及這些動物作為模型在分析抑制突觸NMDA受體功能的效果和研究化合物減輕精神病行為癥狀的能力中的用途。
因此，本發(fā)明提供含有編碼GLYT1的DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述DNA序列與啟動子有效連接。glyt1基因的序列可能編碼GLYT1的同種型。優(yōu)選glyt1基因序列編碼GLYT1b。
優(yōu)選glyt1基因序列是cDNA序列。更優(yōu)選此cDNA整合至少一個內(nèi)含子序列。最優(yōu)選的是，所述至少一個內(nèi)含子序列含有聚腺苷酸化位點(diǎn)。
glyt1基因的序列可以來源于任何動物，優(yōu)選glyt1序列來源于哺乳動物，更優(yōu)選glyt1基因序列是人的序列。
啟動子可以是神經(jīng)元啟動子。在一個實(shí)施方案中，啟動子是組織特異的啟動子。組織特異的啟動子可以是任何以組織特異的方式(如在腦組織中、肌肉組織中、肝臟組織中、腎臟組織中等等)控制和指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子。優(yōu)選在前腦中提供特異表達(dá)的啟動子。最優(yōu)選的啟動子是小鼠CamKαII啟動子。
啟動子也可以是可控制的啟動子?？煽刂频膯幼涌梢允侨魏我钥烧{(diào)節(jié)和/或可誘導(dǎo)的方式(如通過添加特異的誘導(dǎo)物或阻遏物物質(zhì))來控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動子。本領(lǐng)域已知若干可誘導(dǎo)的細(xì)菌啟動子(Schultze N，Burki Y，Lang Y，Certa U，Bluethmann H；Nat Biotechnol 1996；14(4)499-503；van der Neut R；Targeted gene disruptionapplications inneurobiology；Neurosci Methods 1997；71(1)19-27；Liu HS，Lee CH，LeeCF，Su IJ，Chang TY；Lac/Tet dual-inducible system functions inmammalian cell lines.Biotechniques.1998；24(4)624-8，630-2)。
優(yōu)選的遺傳構(gòu)建體是如

圖1所描述的遺傳構(gòu)建體。
這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因DNA”描述人工引入并整合進(jìn)生物的DNA。
這里使用的術(shù)語“glyt1基因序列”描述編碼GLYT1的DNA序列。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物的方法，所述轉(zhuǎn)基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA，所述方法包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎干細(xì)胞引入如上描述的遺傳構(gòu)建體，b)從所述受精卵或胚胎干細(xì)胞制備非人類轉(zhuǎn)基因動物，并由此，c)產(chǎn)生基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1的非人類轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括a)向非人類動物來源的非人類受精卵或非人類胚胎干細(xì)胞引入如上描述的遺傳構(gòu)建體，b)從所述受精卵或胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物，并由此，c)產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
優(yōu)選的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6J受精卵。也可用于本發(fā)明方法中的本領(lǐng)域所使用的受精卵包括(但不限于)FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
優(yōu)選的用于如上描述的方法的胚胎干細(xì)胞是C57BL/6J胚胎干細(xì)胞。也可用于本發(fā)明方法中的本領(lǐng)域所使用的干細(xì)胞包括(但不限于)BALB/c胚胎干細(xì)胞、DBA/2J胚胎干細(xì)胞、CBA/J胚胎干細(xì)胞和129系小鼠的胚胎干細(xì)胞系。
受精卵或胚胎干細(xì)胞可以來源于任何非人類動物。優(yōu)選受精卵或胚胎干細(xì)胞來源于嚙齒類。更優(yōu)選受精卵或胚胎干細(xì)胞來源于小鼠。
可以通過DNA的微注射來向受精卵引入遺傳構(gòu)建體?？梢酝ㄟ^病毒感染來向胚胎干細(xì)胞引入遺傳構(gòu)建體。
例如，可以通過微注射后培養(yǎng)受精卵、將培養(yǎng)的受精卵轉(zhuǎn)移到假孕的非人類動物中并生育非人類轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生上文所述方法的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因GLYT1”描述人工引入并整合進(jìn)生物的DNA產(chǎn)生的GLYT1蛋白質(zhì)。
這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”描述基因組中含有轉(zhuǎn)基因DNA的動物。此轉(zhuǎn)基因DNA可能整合在基因組的某處。
本發(fā)明還提供由以上描述的任何方法所產(chǎn)生的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供非人類轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，非人類轉(zhuǎn)基因動物含有如圖1所描述的遺傳構(gòu)建體。
在另一實(shí)施方案中，提供表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1的非人類轉(zhuǎn)基因動物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織特異性(即在大腦中)表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因GLYT1在非人類轉(zhuǎn)基因動物的前腦特異表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因GLYT1的表達(dá)是可控的，如通過加入特異的誘導(dǎo)物或阻遏物物質(zhì)。
在描述的過度產(chǎn)生GLYT1蛋白質(zhì)的非人類轉(zhuǎn)基因動物中，預(yù)期可以通過改變內(nèi)源甘氨酸的水平體內(nèi)調(diào)整NMDA受體活性。由于在海馬和大腦皮層區(qū)缺乏GLYT2受體，這些區(qū)域的GLYT1過表達(dá)導(dǎo)致谷氨酸能突觸中甘氨酸水平的下降，并因此抑制NMDA受體的功能。因此，預(yù)期過表達(dá)GLYT1的突變小鼠會發(fā)展出與精神分裂癥或認(rèn)知缺損有關(guān)的行為改變和異常。
非人類轉(zhuǎn)基因動物可以是任何本領(lǐng)域已知的、可以用于本發(fā)明方法的非人類動物。優(yōu)選的非人類轉(zhuǎn)基因動物是哺乳動物，更優(yōu)選的非人類轉(zhuǎn)基因動物是嚙齒動物。本發(fā)明最優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。
可以對上文描述的非人類轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行遺傳、分子和行為分析。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明提供的非人類轉(zhuǎn)基因動物與相同或其它基因型交配后產(chǎn)生的后代。
本發(fā)明還提供來源于本發(fā)明提供的非人類轉(zhuǎn)基因動物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織及器官型腦片培養(yǎng)物(organotypic brain sliceculture)。
可以通過兩種方法制備基于細(xì)胞培養(yǎng)的模型?？梢詮姆侨祟愞D(zhuǎn)基因動物中分離細(xì)胞培養(yǎng)物，或從使用同樣的構(gòu)建體、經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的細(xì)胞培養(yǎng)物中制備細(xì)胞培養(yǎng)物。
可以通過多種方法檢測含有轉(zhuǎn)基因DNA(編碼GLYT1)的遺傳構(gòu)建體的整合，包括使用從兩到3周齡小鼠尾部活檢組織中分離的DNA進(jìn)行基因組Southern印跡和PCR分析。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然存在許多可以用來檢測轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或通過Northern印跡、原位雜交的mRNA定量)和在蛋白質(zhì)水平的方法(包括組織化學(xué)、免疫印跡分析和體外結(jié)合研究)。此外，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的ELISA技術(shù)來定量目的基因的表達(dá)水平。
可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)分析來完成定量測量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保護(hù)、Northern印跡分析、RNA斑點(diǎn)(RNA dot)分析在內(nèi)的雜交方法測量轉(zhuǎn)錄水平。也可以使用免疫組織化學(xué)染色和Western印跡分析來評估是否存在轉(zhuǎn)基因GLYT1蛋白質(zhì)。
還可通過本領(lǐng)域已知的方法(包括免疫組織化學(xué)、電子顯微鏡、磁共振成像(MRI))和關(guān)于神經(jīng)學(xué)及認(rèn)知功能的行為研究來描述本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的特征。行為測試的例子有自主行為(spontaneons behavior)測試、與認(rèn)知功能有關(guān)的行為測試、藥理學(xué)干擾的行為測試(pharmacologically-disrupted behavior)、握力測試、線操縱測試(wiremanoeuvre)、游泳測試、旋轉(zhuǎn)桿測試(rotarod)、走動測試(locomotoractivity)、Morris水迷宮測試(Morris water maze)、Y-迷宮測試、明暗偏好測試(light-dark preference)、被動和主動回避測試(avoidance test)。
本發(fā)明另一目的是所述非人類轉(zhuǎn)基因動物，或來自其的細(xì)胞系或組織或器官型腦片培養(yǎng)物，作為模型在研究化合物減輕精神病行為的能力中的用途。此外，這些轉(zhuǎn)基因動物，或來自它們的細(xì)胞或組織或器官型腦片培養(yǎng)物可以作為模型用于研究抑制突觸NMDA受體功能的效果。
在另一實(shí)施方案中，提供了用于評估GLYT1功能對NMDA受體活化的體內(nèi)影響的方法，包括確定非人類轉(zhuǎn)基因動物中NMDA受體活性、突觸可塑性和行為(包括學(xué)習(xí)和記憶)，并將此NMDA受體活性、突觸可塑性和行為與對照的相比較，其中所述非人類轉(zhuǎn)基因動物的基因組中含有轉(zhuǎn)基因glyt1基因序列，從而過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)的。
對照可以包括任何非人類動物，其中沒有引入編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA來過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)，或其中動物僅含有天然glyt7基因。評估的行為可以包括自主行為、與認(rèn)知功能有關(guān)的行為(包括空間的短期和長期記憶、物體識別記憶、聯(lián)想情緒記憶、條件性恐懼消退(conditionedfear extinction))和藥理學(xué)干擾的行為(包括藥物誘導(dǎo)的過多走動(hyperlocomotion)、藥物誘導(dǎo)的社交退縮(Social withdrawal)、藥物誘導(dǎo)的前脈沖抑制(prepulse inhibition)缺陷、和藥物誘導(dǎo)的記憶喪失)。
在另一實(shí)施方案中，提供測試GLYT1抑制劑化合物增強(qiáng)NMDA受體功能的能力的方法，所述方法包括向基因組中含有轉(zhuǎn)基因glyt1基因序列從而過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)的非人類轉(zhuǎn)基因動物，或來自它們的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物或器官型腦片培養(yǎng)物施予GLYT1抑制劑化合物，并確定化合物的效果(包括行為、電生理學(xué)和組織學(xué)的評估)，及與對照的行為、電生理學(xué)和組織學(xué)相比較。
可以被用于本發(fā)明方法的GLYT1抑制劑化合物有本領(lǐng)域已知的任何GLYT1抑制劑化合物，包括(但不限于)ALX-5407(NPS Pharmaceuticals)和ORG-24598(Organon)。
對照可以包括任何動物、細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物或器官型腦片培養(yǎng)物或組織，其中沒有引入編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA來過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)，或其中動物、細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物或器官型腦片培養(yǎng)物僅含有天然glyt1基因。評估的行為可以包括自主行為、與認(rèn)知功能有關(guān)的行為(包括空間的短期和長期記憶、物體識別記憶、聯(lián)想情緒記憶、條件性恐懼消退)和藥理學(xué)干擾的行為(包括藥物誘導(dǎo)的過多走動、藥物誘導(dǎo)的社交退縮、藥物誘導(dǎo)的前脈沖抑制缺陷、和藥物誘導(dǎo)的記憶喪失)。
本發(fā)明還涉及測試化合物增強(qiáng)NMDA受體活性的能力的試劑盒，所述試劑盒包括基因組中含有轉(zhuǎn)基因glyt1基因序列從而過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)的非人類轉(zhuǎn)基因動物，或來自它們的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物或組織或器官型腦片培養(yǎng)物或組織，以及確定化合物是否表現(xiàn)出增強(qiáng)NMDA受體活性的能力的手段。
此外，本發(fā)明提供基因組中含有轉(zhuǎn)基因glyt1基因序列以致過表達(dá)活性GLYT1蛋白質(zhì)的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或來自它們的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物或組織或器官型腦片培養(yǎng)物或組織作為模型在研究化合物對精神病行為的作用和測試化合物的GLYT1特異性抑制效果中的用途。
本發(fā)明還提供基本如這里所描述的，在特別是在參考前述實(shí)施例之前所述的轉(zhuǎn)基因動物、方法、組合物、試劑盒和用途。
對本發(fā)明進(jìn)行一般性的描述之后，結(jié)合以下附圖，參考具體的實(shí)施例，將會更好的理解本發(fā)明，這里包含實(shí)施例只是為了舉例說明，而無限制的意圖(除非另有說明)。
附圖簡述圖1顯示遺傳構(gòu)建體的示意圖，所述遺傳構(gòu)建體含有小鼠CamKαII啟動子、整合內(nèi)含子(I)的編碼人GLYT1b(hGlyt1b)的cDNA，其中有一個內(nèi)含子含有多聚腺苷酸化位點(diǎn)(pA)。圖中給出了限制性位點(diǎn)。
圖2用于克隆glyt1b-cDNA的引物對(SEQ.ID NOs3至8)和用于驗(yàn)證重組事件的引物對(SEQ.ID NOs9和10)的示意圖。
圖3轉(zhuǎn)基因盒CamKaII啟動子3’到glyt1b基因5’的PCR結(jié)果(SEQ.ID NOs9和10)。來自遺傳構(gòu)建體的擴(kuò)增子大小為1600bp。內(nèi)源基因不產(chǎn)生擴(kuò)增子。17-22F1小鼠，M標(biāo)記。
實(shí)施例除非另有說明，實(shí)施例中涉及的商業(yè)獲得的試劑按照制造商的說明書使用。
實(shí)施例1小鼠的產(chǎn)生A)人GLYT1b cDNA的克隆基于發(fā)表的人glyt1b-cDNA序列信息(注GLYT1b序列作為1c序列被發(fā)表；SEQ.ID NOs1)設(shè)計(jì)引物(SEQ.ID NOs3至6)，通過嵌套PCR從全人腦的pACT2-cDNA文庫(Clontech)中克隆glyt1b-cDNA。將擴(kuò)增的cDNA亞克隆進(jìn)克隆載體pCI的NheI和EcoRI限制性位點(diǎn)(Promega；SEQ.ID NOs10)。
B)hGlyt1b轉(zhuǎn)基因的克隆使用引物huGlyt1b-2147FLAG-PvuII-rev(SEQ.ID NOs7)和huGlyt1b-234c(SEQ.ID NOs8)，從上述載體中再擴(kuò)增人glyt1b cDNA。用PvuII切割擴(kuò)增子，純化擴(kuò)增子后將其克隆進(jìn)pNN265載體(M.Mayford，E.Kandel，Columbia Universlty，New York，USA；Choi，T.，等人，Mol CellBiol，1991.11(6)p.3070-4)的EcoRV位點(diǎn)，以便加入內(nèi)含子和pdyA序列，產(chǎn)生pNN265-hGlyt1b-FLAG載體。對cDNA部分進(jìn)行測序并與發(fā)表的序列相比較，以確證使用Pwo-聚合酶擴(kuò)增的正確性。沒有發(fā)現(xiàn)突變。
為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的前腦特異性神經(jīng)元表達(dá)模式，將hGlyt1b-cDNA隨后克隆進(jìn)含有小鼠CamKαII啟動子的載體(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)p.1678-83)。為此，用僅含有KpnI、HindIII和NotI限制性位點(diǎn)的最小克隆位點(diǎn)取代pBluescript II SK+質(zhì)粒(Stratagene)的多克隆位點(diǎn)。此后，通過NotI和HindIII從pNN279載體(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)p.1678-83)移出啟動子-盒(SEQ ID NO2)，并克隆進(jìn)修飾的pBluescript II SK+載體。通過NotI消化，從pNN265-hGlyt1b-FLAG中將hGlyt1b-cDNA連同周圍的內(nèi)含子一同取走，并克隆進(jìn)mCamKαII啟動子后唯一的NotI位點(diǎn)(圖1)。
C)轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生通過BssHII消化，從載體骨架上切下轉(zhuǎn)基因盒，并純化。以3ng/μl的濃度將DNA注入C57BL/6J受精卵(獲得自Jackson實(shí)驗(yàn)室，600MainStreet，Bar Harbor，Maine 04609 USA)從而根據(jù)已確立的方法(Hogan，B.C.，F(xiàn)；Lacy，E，1986，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。通過使用引物對pNN279-7431c(SEQ.ID NOs9)和huGlyt1b-786nc(SEQ.ID NOs10)，以PCR篩選后代的基因組DNA，所述PCR會因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的存在而擴(kuò)增出1600bp的轉(zhuǎn)基因盒片段(圖2和圖3)。將這一篩選鑒定的建立者(founders)與C57BL/6J小鼠交配，以建立品系。
實(shí)施例2GLYT1b轉(zhuǎn)基因小鼠的分子分析
A)GLYT1b突變小鼠的組織學(xué)分析使用在兔和豚鼠體內(nèi)激起的GLYT1特異的抗體，通過免疫組織化學(xué)和Western印跡分析確證GLYT1b在突變小鼠腦中的過表達(dá)。
B)GLYT1b突變小鼠的電生理分析誘導(dǎo)一定形式的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)需要NMDA受體的激活(Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)p.31-9)。如先前所描述的(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，2000.20(11)p.4037-49)，在整個強(qiáng)直后時(shí)期，比較GLYT1b轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型對照的海馬切片中θ強(qiáng)直刺激(Burst Stimulation)誘導(dǎo)的增強(qiáng)。確定是否GLYT1b轉(zhuǎn)基因小鼠相比于野生型對照表現(xiàn)出不同水平的LTP增強(qiáng)。
C)前腦和腦干突觸小體的制備處死小鼠，并在冰上解剖腦組織，在4℃進(jìn)行隨后的操作。使用玻璃/特氟隆勻漿器(800rpm 10次)，在10vol(w/v)的10mM Tris-HCl(pH7.4，含有0.32M蔗糖)和1mM Pefabloc(蛋白酶抑制劑的混合物)(緩沖液A)中勻漿組織。將勻漿物在1300xg離心5分鐘。小心的傾析出上清液，并置于冰上，然后用5vol(依據(jù)原始重量)的緩沖液A懸浮沉淀，如描述的進(jìn)行勻漿和離心。將第二次的上清液加入第一次的上清液，并在17000xg離心20分鐘。用5vol(依據(jù)原始重量)的Krebs-Ringer溶液(pH7.4，含有10mM葡萄糖)(KRB)懸浮產(chǎn)生的沉淀(突觸小體粗組分)。
D)甘氨酸攝取在96孔平板中進(jìn)行分析。將小鼠前腦(0.1mg)和腦干(0.05mg)突觸小體制備品的等分試樣在含有120nM[3H]甘氨酸、總體積為250μl的KRB中于22℃孵育30分鐘。通過迅速過濾到96孔Packard GF/B unifilter板上而終止孵育，隨后用冰冷卻的KRB洗滌3次。加入閃爍液后測量孔的放射性含量。
E)MK801的飽和結(jié)合在96孔深平板(deep plates)中進(jìn)行分析。將小鼠前腦和腦干突觸前小體制備品的等分試樣(0.07mg)在含有遞增濃度(0.03nM-300nM)的[3HMK801、總體積為0.5ml的20mM Hepes-KOH(pH7.4，含有100μM谷氨酸和30μM甘氨酸)中于22℃孵育1小時(shí)。用10μM MK801確定非特異性結(jié)合。通過迅速過濾到96孔Packard GF/C unifilter平板上而終止孵育，隨后用冰冷卻的20mM Hepes-KOH(pH7.4)洗滌3次。加入閃爍液后測量孔的放射性含量。
F)體內(nèi)的胞外甘氨酸水平為了評估GLYT1b表達(dá)的增加對細(xì)胞外甘氨酸水平的影響，進(jìn)行了微量透析研究。使用異氟烷(isoflurane)麻醉成年野生型和突變小鼠，并在它們的紋狀體(Cpu，前囟點(diǎn)A+0.9；L-1.8；V-4.6)插入微量透析垂直探針(CMA7 4/2，銅紡-膜定制)。在實(shí)驗(yàn)之前允許動物恢復(fù)3到4天。根據(jù)Smith和Sharp的方法(經(jīng)較小的改動)定量透析液的甘氨酸水平。
實(shí)施例3GLYT1突變小鼠的行為分析A)神經(jīng)學(xué)評估(neurological assessment)神經(jīng)學(xué)評估包括若干神經(jīng)學(xué)測試，如屈反射、握力(g)和花在16和32rpm的旋轉(zhuǎn)桿上的時(shí)間(sec)以及體重。
B)自主行為觀察GLYT1b轉(zhuǎn)基因小鼠自然探究行為的跡象，包括身體姿勢、步態(tài)、感覺反應(yīng)(Irwin，S.，Psychopharmacologia，1968.13(3)p.222-57)。此外，還分析了它們的自發(fā)走動活動(spontaneous locomotor activity)(活動箱activity box)。另外，通過將動物暴露于天然的厭惡刺激(高架十字迷宮測試和明/暗選擇測試)，評估了它們的焦慮狀態(tài)。
C)聽覺驚跳和聽覺驚跳反射的前脈沖抑制(prepulse inhibition)(精神分裂癥相關(guān)行為)在8個驚跳裝置中進(jìn)行測試，每個裝置由裝在有機(jī)玻璃平臺上的有機(jī)玻璃圓柱組成(直徑5cm)，所述有機(jī)玻璃平臺被置于通風(fēng)、弱音的小室中，以高頻的擴(kuò)音器產(chǎn)生所有聽覺刺激。每個小室的背景噪音為68dB。檢測圓柱內(nèi)的運(yùn)動，并通過附在樹脂有機(jī)玻璃底部的壓電式加速計(jì)轉(zhuǎn)換，并使用計(jì)算機(jī)數(shù)字化和存儲。在刺激開始時(shí)，記錄65×1msec的讀數(shù)，以獲得動物的驚跳幅度。
每一部分起始于5分鐘的適應(yīng)期，之后是不包括在分析中的5個連續(xù)的110dB試驗(yàn)。然后進(jìn)行10個不同類型的試驗(yàn)單獨(dú)的驚跳脈沖(ST110、110dB/40msec)；8個不同的前脈沖試驗(yàn)，其中20msec長的，72、78、84和90dB的刺激(P72、P78、P84、P90)或者是單獨(dú)給予或在110dB脈沖之前100msec給予(PP72、PP78、PP84、PP90)；及最后一個只給予背景噪音的試驗(yàn)(NST)，以測量圓柱中的基線運(yùn)動。所有的實(shí)驗(yàn)以偽隨機(jī)的順序給出，平均試驗(yàn)間隔期(ITI)為15msec。使用雙因素ANOVA分析驚跳數(shù)據(jù)和前脈沖抑制(PPI)百分?jǐn)?shù)。
D)筑巢為了量化突變小鼠將綿紙撕碎來筑巢的能力，在每個籠中放入幾張折疊的綿紙，24小時(shí)后對巢進(jìn)行評定。
E)腦室內(nèi)NMDA誘導(dǎo)的驚厥。
通過向有知覺小鼠的側(cè)腦室注射NMDA(含5nM的1μl)來誘導(dǎo)抽搐。注射后立即將動物置于樹脂玻璃盒內(nèi)，并觀察5分鐘。記錄每只小鼠表現(xiàn)出狂跑期和陣攣性驚厥的潛伏期(以秒計(jì))，以便將突變小鼠和野生型小鼠進(jìn)行比較。
F)認(rèn)知功能相關(guān)的行為短期和長期的空間記憶如Durkin(Durkin，T.P.，等人，Behav Brain Res，2000.116(1)p.39-53)的描述進(jìn)行延遲匹配空間工作記憶任務(wù)(delayed matching spatial workingmemory task)?；谠?臂迷宮中獲得的延遲匹配規(guī)則評估工作記憶?；緦W(xué)習(xí)任務(wù)包括兩個階段。每個試驗(yàn)開始于呈現(xiàn)階段(presentation phase)，在這一階段，動物被強(qiáng)迫光顧準(zhǔn)隨機(jī)選擇的一個臂，并得到獎勵，其余4個臂被關(guān)閉。一旦被獎勵后，將動物放置于等待的籠子中。經(jīng)歷持續(xù)時(shí)間不同的保留間隔期(對于工作記憶為延遲2-sec、20-sec和40-sec；對于短期和長期記憶為延遲5-min、1-hr、4-hr、24-hr)之后，進(jìn)入尋回測試階段(retrieval test phase)，在此階段，將動物暴露于對5個開放的臂進(jìn)行選擇的位置。獎勵正確的選擇(選擇之前光顧過的臂)。以保留間隔期的函數(shù)，通過在試驗(yàn)間隔固定為10秒的連續(xù)試驗(yàn)中正確命中選擇的平均百分?jǐn)?shù)來表示工作記憶保留能力。通過自動視頻跟蹤系統(tǒng)監(jiān)控記憶任務(wù)。
可替代的是，在Morris描述的水迷宮范例(Morris，R.G.，等人，Nature，1982.297(5868)p.681-3；Morris，R.G.，等人，Nature，1986.319(6056)p.774-6)中評估空間學(xué)習(xí)和記憶。將小鼠置于圓形水池(直徑120cm，高30cm)，在水池中它們通過尋找隱藏的平臺而學(xué)習(xí)躲避乳白色的水(20cm深，20±1℃)。此目標(biāo)平臺(直徑7cm，處于水面以下1cm)被置于水池特定四分之一區(qū)的中心，并沿水池安置了外部的視覺提示物，以便利于導(dǎo)航動物。在4天的測試期中，于隨機(jī)選擇的4個固定起始位點(diǎn)之一面向水池壁將小鼠置于水中(每天3個回合，每回合3次試驗(yàn))。使用自動視頻運(yùn)動系統(tǒng)測量小鼠尋找目標(biāo)所需的時(shí)間(逃跑潛伏期)以及游泳路徑和速度。如果動物在60秒內(nèi)未能找到目標(biāo)，用手將其置于平臺并允許其停留在那一個試驗(yàn)間隔期(10到20秒)。每一回合的間隔為1.5到兩小時(shí)。在第4天的最終試驗(yàn)之后，將平臺移走，并允許小鼠自由游泳60秒。記錄小鼠在每一個四分之一區(qū)所花的時(shí)間以及它們的游泳路徑。
聯(lián)想情緒記憶在兩種行為任務(wù)(behavioral task)中評估依賴NMDA受體的聯(lián)想情緒記憶i.恐懼加強(qiáng)的驚跳反射使小鼠條件性對與足擊(footshock)(aversive US)配對的光(CS)產(chǎn)生反應(yīng)。在延遲24小時(shí)之后，通過在具有或不具有條件性光刺激情況下由不同聽覺刺激(90-110dB)所引起的驚跳反射的幅度來評估情緒記憶。條件性光刺激的給予導(dǎo)致聽覺驚跳反射增強(qiáng)(Davis，M.，Psychopharmacology(Berl)，1979.62(1)p.1-7)。
ii.情景恐懼條件反射(contextual fear conditioning)情景恐懼條件反射是一種暗示性厭惡相關(guān)的學(xué)習(xí)過程，通過這一過程，原本中性的情景在與非條件性厭惡刺激(US)反復(fù)聯(lián)系后獲得了引起厭惡的特性。將動物暴露于新的小室，幾分鐘后在此小室內(nèi)用連續(xù)的足電擊(US)處理小鼠，以引起非條件的恐懼反應(yīng)(木僵行為)(Phillips，R.G.和J.E.LeDoux，BehavNeurosci，1992.106(2)p.274-85)。通過對再次暴露于此情景而反應(yīng)產(chǎn)生的木僵數(shù)量來衡量情景恐懼條件反射。在訓(xùn)練后的不同時(shí)期測試條件性木僵反應(yīng)，以評估短期(1到3小時(shí))和長期(1到10天)的情景記憶。
條件性恐懼消退學(xué)會的恐懼反應(yīng)的消失代表行為可塑性的一種形式，行為可塑性被認(rèn)為依賴于新記憶形式的形成，而不是抹掉原來學(xué)會的聯(lián)系(Falls，W.A.，M.J.Miserendino，和M.Davis，J Neurosci，1992.12(3)p.854-63)。最近已證明條件性恐懼消退與NMDA受體依賴的過程有關(guān)(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)p.63-9)。訓(xùn)練后延遲24小時(shí)之后，可通過連續(xù)5天內(nèi)重復(fù)暴露于情景出現(xiàn)的木僵反應(yīng)數(shù)量隨時(shí)間的減少來評估條件性木僵的消失。
G)藥理學(xué)干擾的行為可以通過施用脫水嗎啡、D-苯異丙胺或非競爭性NMDA受體拮抗劑PCP來誘導(dǎo)一系列明顯的精神分裂癥-型癥狀，包括過多走動、前脈沖抑制(PPI)缺陷和記憶缺陷。使用了在野生型小鼠中干擾行為的最低有效劑量。然后測試了是否GLYT1b轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出對于行為的藥理學(xué)干擾具有不同的敏感性。
藥物誘導(dǎo)的過多走動通過記錄水平走動、垂直活動、刻板動作(stereotypic movement)以及花在開放場所中心的時(shí)間，在開放場所(活動盒)中評估D-苯異丙胺對走動和刻板行為的影響。
藥物誘導(dǎo)的社交退縮為了評估GLYT1b過表達(dá)對D-苯異丙胺或PCP在社會行為方面造成的行為反應(yīng)的影響，使用了社會探究測試(social exploration test)(Crestani，F(xiàn).，F(xiàn).Seguy，和R.Dantzer，Brain Res，1991.542(2)p.330-5)。將單室飼養(yǎng)的雄性小鼠暴露于年青雌性小鼠5分鐘。在施用藥物前后經(jīng)由視頻跟蹤系統(tǒng)記錄社會性互動，包括肛殖和嗅聞頸、給對方梳毛(heterogrooming)和追趕。施用藥物后，在不同的時(shí)間間隔(30分鐘、兩小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí))檢查藥物誘導(dǎo)的社會探究衰退(social exploration deterioration)。
藥物誘導(dǎo)的前脈沖抑制缺陷脫水嗎啡或PCP對前脈沖抑制(PPI)的干擾是常用的感覺運(yùn)動門控缺陷(sensorimotor gating deficits)模型(Kretschmer，B.D.，等人，Eur JPharmacol，1997.331(2-3)p.109-16；Bakshi，V.P.和M.A.Geyer，JNeurosci，1998.18(20)p.8394-401；Bakshi，V.P.，等人，J Pharmacol ExpTher，1999.288(2)p.643-52)，通過這種模型可以評估注意力和感覺運(yùn)動門控。PPI是在呈遞非誘導(dǎo)驚跳的前脈沖刺激后聽覺或觸覺驚跳反應(yīng)的減弱。對聽覺刺激之后動物的驚跳反應(yīng)進(jìn)行了評估。
藥物誘導(dǎo)的記憶喪失在上文描述的延遲匹配空間記憶任務(wù)中評估PCP或脫水嗎啡誘導(dǎo)的記憶功能損傷。
H)GLYT1b突變小鼠中特異的GLYT1抑制劑逆轉(zhuǎn)體外和體內(nèi)缺陷/損傷。
研究人員測定了是否特異的GLYT1抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)體外(見實(shí)施例2的B、D和E段落)和體內(nèi)(見實(shí)施例2的F段落、實(shí)施例3的A到F段落)觀察到的損傷/缺陷。
I)藥理學(xué)攻擊的GLYT1b突變小鼠中特異的GLYT1抑制劑逆轉(zhuǎn)體外和體內(nèi)缺陷/損傷。
研究人員測定了是否特異的GLYT1抑制劑能夠在GLYT1b突變小鼠中逆轉(zhuǎn)它們發(fā)生改變的對行為的藥理學(xué)干擾的敏感性(見實(shí)施例3段落G)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffman-La Roche)<120>Glyt1轉(zhuǎn)基因小鼠<130>22511<160>11<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2202<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>1c型甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(可變剪接)<222>(1)..(2202)<223>UniGene ID Hs.442590下的基因的代表性cDNA(s70612，自2004年2月18日起)，<400>1gcccacacac cccactccag ctccggagca cccgtgctgg gctgcatggg gactggccgg60aggggcaggg ccaggggagc gggtaggcag agcttcggga ggagatgagg tgaaagtaat120tgacgctgcc cagcccggca gtgggagagg caggggatgc gtcagtgtcg cgctggagct180ggcagaggtg atgagcggcg gagacacgcg gggctgcgat cgctcgcccc aggatggccg240cggctcatgg acctgtggcc ccctcttccc cagaacagaa tggtgctgtg cccagcgagg300ccaccaagag ggaccagaac ctcaaacggg gcaactgggg caaccagatc gagtttgtac360tgacgagcgt gggctatgcc gtgggcctgg gcaatgtctg gcgcttccca tacctctgct420atcgcaacgg gggaggcgcc ttcatgttcc cctacttcat catgctcatc ttctgcggga480tccccctctt cttcatggag ctctccttcg gccagtttgc aagccagggg tgcctggggg540tctggaggat cagccccatg ttcaaaggag tgggctatgg tatgatggtg gtgtccacct600acatcggcat ctactacaat gtggtcatct gcatcgcctt ctactacttc ttctcgtcca660tgacgcacgt gctgccctgg gcctactgca ataacccctg gaacacgcat gactgcgccg720gtgtactgga cgcctccaac ctcaccaatg gctctcggcc agccgccttg cccagcaacc780tctcccacct gctcaaccac agcctccaga ggaccagccc cagcgaggag tactggaggc840tgtacgtgct gaagctgtca gatgacattg ggaactttgg ggaggtgcgg ctgcccctcc900ttggctgcct cggtgtctcc tggttggtcg tcttcctctg cctcatccga ggggtcaagt960cttcagggaa agtggtgtac ttcacggcca cgttccccta cgtggtgctg accattctgt1020ttgtccgcgg agtgaccctg gagggagcct ttgacggcat catgtactac ctaaccccgc1080
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<221>小鼠鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶IIα亞基基因5’側(cè)翼序列<222>(1)..(7988)<223>代表性cDNA(AJ222796，自2004年2月18日起)<400>2cgatcttttt tccgtaaact caataccagg ctgatgtccc accggatctg atggcttagg60gtggcaggga atctcagttc ccctcagaca ctctcccttt gctggttctc agggaggagg120caaggtcaag tcttcatctg taggcacgtg gagggagggc acagaagccc tcagctgaat180agggtgggac ttggggaagg gcagcaacca ggctgggttg cctgggtcac aatcctgcct240ctttcctgat gagtttcctt tttgccctca ggttacctat agcagcattc tgcctcaatc300
tcacccctaa gatgagctct ggtgacttta ggactccagt gtacacatgt gtctggggcc360atggcagggt ttcttgctga ccttgtcacc ttccagacaa cttgagtcca tgaccctctt420tccagctctc tgtggtgctc ttggatatca gctggagtat ggccagctgg ctgctgctct480gttgaacaac tcaatgagag aacggacagg gtaggctctg agaaatcttt acgttcctgg540agcctcatga cttgggagcc tagtggaatt cttctctttt ggtccccaac atctgggggg600agggggaact ggctgagcct gagccactgt atagtgaggg tgggggaaac agctgtgaaa660ggagcctttg atttggtctt gaacacagtt cttccccaca gggccttgat ttccctactt720gcaaaggagt agggaaatat gagccttggc tctgcctacc tcacgttgct ggtgctgtag780aaaactggcc aggctgatgg ttgtggagga gcctgtgaac ttgattaaag tgccattatc840cagaggcaag agatgctggt ctgtgtgtgt gtgagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt900gtgtgtgtgt cttggagacc tgtgtgagct cgatgctagc agaggggaca gaaggtaggt960gggaaggaat gaaggaatga aggaaggaaa gaaggaaggt tgaaaggaag aaaggaagga1020aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gtcctgccac1080aggcttacca tgtagctgca ggcaaacccc tgaccctctc tgggcctaag tgtttctcta1140cacacaatgg atgattcaag agtccttact tttggtggtt acaggcaccc ctgtgcacat1200ttgcatctgg ggtggggggg acacaggctt ggtagtgttg aggagggggg tggttgtaga1260gcctgctagc tgcacactgc gttctgcata tctcccttca ggtcccagtc ggcgcagtgt1320gtgtaggcga aggccctgct gtgaattttg aaaatagtta tttttgtcac tggcaaagga1380ggccctgtta ggactcgtca gcttgtggat gagcgggatg ggtggagtgg ggtgggtgcg1440gtgccgccgt ggggggttac cgctgcttgc agggctgcat cgcccaggca gtgactgaat1500cctgcatgag ggcctggcct aggctgtggg gaggagatga ccactgcgtc ctagatcttt1560ccttagccct gtgcttcctt tcttcctttt ttccttaaga tttatttcta atgatgcgta1620ggttgtgtat ttgtgtgtgg gtatgtgcac ttgaataaag gacccacaga ggctatagac1680atcagatcct cctagagctg gggttacaga gggcgtgagt tgtccaacat gggcaccgga1740aaataaactt atgtgctcta cacgaccgag ctgtctctcc aacaccagcc ctcttctttt1800gacttttctc atctccctca cttgtatgtt ttcccttcct cgataatgct gatacccaga1860tggtaggcac ggcccaggat aggcaggggt ctctgcgctc cagtggctgt agtggttttc1920ctgcctgctc tgaagaagac actggctaag gtggtgtctt agcctactgt atcctagagg1980tgggttattc atagtctgcc cactgcccaa cacactctag gcctgctggg gcctattcta2040actctgcttg ctggcttgcc accctggcac acagtgtagg cttccctgta gagccaggct2100
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<221>引物<222>(1)..(21)<400>3agagcttcgg gaggagatga g21<210>4<211>21<212>DNA<213>智人<220>
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<221>引物<222>(1)..(39)<400>5
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<221>引物<222>(1)..(72)<400>7gatccagctg gctagatatc ctacttgtca tcgtcgtcct tgtaatcgat atctatccgg 60gagtcctgga gg 72<210>8<211>38<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物<222>(1)..(38)<400>8gatccagctg caccatggcc gcggctcatg gacctgtc 38<210>9<211>20<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>引物<222>(1)..(20)<400>9cagctgttgc cagggcaacg 20
<210>10<211>21<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物<222>(1)..(21)<400>10gaggctgtgg ttgagcaggt g21<210>11<211>4006<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述哺乳動物表達(dá)載體<220>
<221>克隆載體pCI<222>(1)..(4006)<223>DNA序列(U47119，自2004年2月18日起)<400>11tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta60ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc120aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg180gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc240gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat300agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc360ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga420cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg480gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac540caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt600caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc660cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc720tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat780tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc840
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1.含有編碼GLYT1的DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述DNA序列與啟動子有效連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的遺傳構(gòu)建體，其中DNA序列編碼GLYT1的同種型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的遺傳構(gòu)建體，其中DNA序列編碼GLYT1b。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中編碼序列是人的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中啟動子是組織特異的啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中啟動子是前腦特異的啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中啟動子是可控制的啟動子。
8.產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物的方法，所述轉(zhuǎn)基因動物的基因組含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA，所述方法包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎干細(xì)胞引入根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，b)從所述受精卵或胚胎干細(xì)胞制備非人類轉(zhuǎn)基因動物，并由此，c)產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA。
9.產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1的非人類轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎干細(xì)胞引入根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，b)從所述受精卵或胚胎干細(xì)胞制備非人類轉(zhuǎn)基因動物，并由此，c)產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因GLYT1的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
10.由權(quán)利要求8到9中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的非人類轉(zhuǎn)基因動物。
11.非人類轉(zhuǎn)基因動物，其基因組中含有權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中轉(zhuǎn)基因動物是嚙齒動物。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物過表達(dá)GLYT1蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物組織特異性地過表達(dá)GLYT1蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求10到15中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物的后代。
17.來源于根據(jù)權(quán)利要求10到16中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。
18.來源于根據(jù)權(quán)利要求10到16中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物或其后代的組織或器官型腦片培養(yǎng)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求10到16的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官型腦片培養(yǎng)物作為模型在研究化合物對精神病行為的作用中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求10到16的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官型腦片培養(yǎng)物在測試化合物的GLYT1特異性抑制作用中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求10到16的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官型腦片培養(yǎng)物作為模型在研究抑制突觸NMDA受體功能的效果中的用途。
22.評估GLYT1功能對NMDA受體活化的體內(nèi)影響的方法，所述方法包括在權(quán)利要求10到16中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物中測定NMDA受體活性、突觸可塑性和行為——包括學(xué)習(xí)和記憶，并將此NMDA受體活性、突觸可塑性和行為與對照的相比較。
23.測試GLYT1抑制劑化合物增強(qiáng)NMDA受體活性的能力的方法，所述方法包括向權(quán)利要求10到16的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官型腦片培養(yǎng)物施予GLYT1抑制劑化合物，確定化合物的效果——包括評價(jià)行為、電生理學(xué)和組織學(xué)，和與對照的行為、電生理學(xué)和組織學(xué)相比較。
24.測試GLYT1抑制劑化合物增強(qiáng)NMDA受體活性的能力的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求10到16中任一項(xiàng)的非人類轉(zhuǎn)基因動物、或根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官型腦片培養(yǎng)物或組織，以及用于確定化合物是否表現(xiàn)出增強(qiáng)NMDA受體活性的能力的手段。
全文摘要
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物的遺傳構(gòu)建體和方法，所述非人類轉(zhuǎn)基因動物的基因組中含有編碼GLYT1的轉(zhuǎn)基因DNA。這些轉(zhuǎn)基因動物還能被用于產(chǎn)生能夠生成更多活性GLYT1的轉(zhuǎn)基因動物。此外，還提供所述產(chǎn)生更多GLYT1蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物，以及產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明也涉及這些動物作為模型在分析抑制突觸NMDA受體功能的效果以及研究化合物減輕精神病行為癥狀的能力中的用途。
文檔編號C12N5/10GK1670213SQ20051005547
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者D·阿爾貝拉蒂-賈尼, M·保利-埃費(fèi)斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司