專利名稱：一種利用基因工程技術(shù)培育抗褐化甘薯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，涉及一種利用基因工程技術(shù)培育抗褐化甘薯的方法，具體涉及甘薯多酚氧化酶基因cDNA及其反義鏈序列，以及利用構(gòu)建的高效表達(dá)載體和工程菌株在植物中表達(dá)該基因和反義基因、篩選轉(zhuǎn)化子的具體程序。本發(fā)明還提供利用基因工程獲得的轉(zhuǎn)多酚氧化酶及反義多酚氧化酶的細(xì)胞和毛狀根及其培養(yǎng)的子代、再生植株、植物組織或種子。
背景技術(shù)：
多酚氧化酶是一類廣泛分布于植物體內(nèi)，能催化單元酚、二元酚、多元酚到聯(lián)苯酚的羥基化及羥基酚到醌的脫氫反應(yīng)，它特殊的催化功能是引起植物褐變、降低品質(zhì)的根本原因。它與甘薯生產(chǎn)加工和運(yùn)輸密切相關(guān)。甘薯兼有糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物的特點(diǎn)，甘薯塊根中淀粉含量高，其淀粉可作為粉絲、變性淀粉、淀粉糖和檸檬酸等產(chǎn)品的工業(yè)原料。但目前我國(guó)甘薯的利用仍以供人食用或做家畜飼料為主，甘薯的深加工受到限制，其中關(guān)鍵的一個(gè)問(wèn)題就是甘薯淀粉與玉米淀粉、馬鈴薯淀粉相比，甘薯淀粉的品質(zhì)差，白度低。主要原因是甘薯中少量的果膠、單寧、多酚類物質(zhì)在甘薯破碎后，受多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的作用形成黑色素，吸附在淀粉顆粒上，這是造成甘薯淀粉白度低的主要原因；同時(shí)多酚氧化酶的氧化產(chǎn)物還會(huì)產(chǎn)生不良的風(fēng)味，降低甘薯淀粉產(chǎn)品品質(zhì)。
為了防止甘薯的褐化，生產(chǎn)上運(yùn)用多種常規(guī)方法來(lái)降低甘薯中多酚氧化酶活性和含量，例如，以抗壞血酸、硫酸鈉、檸檬酸等為主劑的復(fù)合護(hù)色劑，用沸水燙，套袋等，但這些都不能從根本上解決問(wèn)題。
相比之下，利用基因工程技術(shù)改良甘薯，培育抗褐化的甘薯就具有很大的優(yōu)勢(shì)(1)在生物技術(shù)研究領(lǐng)域中，研究人員對(duì)甘薯離體培養(yǎng)長(zhǎng)期廣泛而深入的研究和甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的屢屢成功，為利用生物技術(shù)培育抗褐化的轉(zhuǎn)基因甘薯奠定了良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)；(2)由于目前基本闡明了甘薯的褐變機(jī)理，克隆了多個(gè)物種多酚氧化酶基因，利用反義RNA技術(shù)已經(jīng)獲得了抗褐化的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，故利用基因工程技術(shù)在基因水平上快速、高效地改良甘薯，獲得遺傳修飾轉(zhuǎn)基因甘薯(包括幼苗、細(xì)胞系等)和其他生命體成為可能，因而利用反義RNA技術(shù)是培育抗褐化轉(zhuǎn)基因甘薯的最佳途徑。
目前，尚未有任何與本專利申請(qǐng)中所提及的應(yīng)用基因工程技術(shù)培育抗褐化的轉(zhuǎn)基因甘薯的相關(guān)報(bào)道，包括專利和文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種利用基因工程技術(shù)培育抗褐化甘薯的方法，該方法將多種轉(zhuǎn)移反義多酚氧化酶基因核心片斷到甘薯中。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種反義表達(dá)載體，它包含上述多酚氧化酶基因核心片斷。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是甘薯。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離出的DNA分子具有編碼甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段。該核心片段來(lái)源于由申請(qǐng)人在GenBank中登錄的甘薯多酚氧化酶基因(AY822711)的核苷酸序列，用引物P15’-cgagctctatgttcagaccgattacccc-3’和P25’-cggatccatggtccacattcggtcgac-3’可以從甘薯中擴(kuò)增出該核心片段，序列見(jiàn)SEQ ID NO1。
一種利用反義RNA技術(shù)降低甘薯多酚氧化酶含量的方法，特征在于利用具有編碼甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列核心片段的反義表達(dá)載體，采用任何轉(zhuǎn)基因方法在甘薯細(xì)胞、組織、器官、植株中反義表達(dá)其步驟如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得甘薯多酚氧化酶基因的核心片斷；(2)把多酚氧化酶基因核心片斷可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成反義表達(dá)載體；(3)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移多酚氧化酶基因核心片斷到甘薯細(xì)胞、組織、器官、植株中；(4)在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；
(5)在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明涉及的載體包含具有編碼甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是可生產(chǎn)多酚氧化酶含量降低甘薯的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生命體”指甘薯的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“任何可能的手段”為獲得甘薯多酚氧化酶基因的方法，具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫(kù)篩選而后人工合成甘薯多酚氧化酶基因及其變異體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、如PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子”是指用在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在適合的條件下培養(yǎng)甘薯多酚氧化酶活性降低的轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測(cè)多酚氧化酶含量與活性，篩選多酚氧化酶活性低的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
在本發(fā)明中，我們從甘薯中克隆多酚氧化酶基因核心片斷，并構(gòu)建了植物高效反義表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化甘薯，以降低甘薯塊根中多酚氧化酶基因的表達(dá)水平，提高了甘薯及其加工產(chǎn)品的品質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1甘薯多酚氧化酶基因核心片斷的合成及雙元表達(dá)載體及規(guī)程菌的構(gòu)建1.反義多酚氧化酶基因核心片段的獲得根據(jù)多酚氧化酶基因的全長(zhǎng)序列，在多酚氧化酶基因的內(nèi)部第1個(gè)堿基至第488個(gè)堿基之間設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增502bp序列作為反義基因片段，并根據(jù)植物雙元載體pCAMBIA1304的多克隆酶切位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)兩條含有SacI及BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以及保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增引物，其引物序列為P15’-cgagctctatgttcagaccgattacccc-3’P25’-cggatccatggtccacattcggtcgac-3’從甘薯的塊莖提總RNA(上海華舜生物工程有限公司的RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50ul，包含去離子水，10xPCR buffer 5ul，dNTP 1ul，MgCl23ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul。PCR條件為94℃3分鐘，隨之以94℃45秒、58℃45秒、和72℃1分鐘進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸8分鐘。1％瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為502bp。
電泳分離后，回收(賽百勝PCR產(chǎn)物回收試劑盒)PCR產(chǎn)物，取適量回收產(chǎn)物與PMD18-T easy Vector載體連接(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)后轉(zhuǎn)入DH5α，LB+氨芐青霉素(100mg/l)固體培養(yǎng)基上抗性篩選陽(yáng)性克隆，PCR鑒定后送測(cè)序(賽百勝公司完成)。
2. CaMV35S組成型啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAMBIA1304+-ppoF的構(gòu)建。
選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構(gòu)建雙元三價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+(p1304+)。構(gòu)建流程如下1)HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表達(dá)盒，回收pCAMBIA1304大片段；連接這兩個(gè)回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α，在卡那霉素LB平板上篩選得到單克隆，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，HindIII和EcoRI雙酶切驗(yàn)證；即構(gòu)建好pCAMBIA1304+。
將經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后的DH5α(已經(jīng)轉(zhuǎn)入多酚氧化酶基因核心片段)搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamHI及sacI雙酶切后，1％瓊脂糖電泳后回收小片段。
將構(gòu)建好pCAMBIA1304+與多酚氧化酶基因核心片段用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Kan(100mg/l)固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得轉(zhuǎn)多酚氧化酶核心片段的重組質(zhì)粒并命名為pCAMBIA1304+-ppoF。
3.pCAMBIA1304+-ppoF轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA 4404將pCAMBIA1304+-ppoF轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株LBA 4404，劃板挑取陽(yáng)性單菌落搖菌，取少量菌液抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。陽(yáng)性克隆定義為L(zhǎng)BA4404-ppoF。
實(shí)施例2獲得PPO活性降低的抗褐化轉(zhuǎn)基因甘薯1、農(nóng)桿菌LBA4404-ppoF。使用前自冰箱取出，接種于50ml YEB液體(Rif+，Str+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次；2、第二次活化OD600達(dá)0.3時(shí)加100μmol/mL乙酰丁香酮，繼續(xù)28度，200rpm振蕩培養(yǎng)，OD600達(dá)0.6時(shí)室溫下4000r離心10min；3、棄上清，菌體用MS(100μmol/mL乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.3左右；稱轉(zhuǎn)化液；4、取無(wú)菌甘薯頂芽、側(cè)芽、葉、莖、根等植物不同部位，將莖切成1cm小段，或?qū)⑷~片切成1cm2左右，用無(wú)菌的解剖刀劃以“+”字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，侵染2-10min后取出，用無(wú)菌衛(wèi)生紙吸干，接入100μmol/mL乙酰丁香酮的MS+1mg/LNAA，培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天且在光照條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，既有效地防止了根癌農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)，又有利于莖段外植體的成活及抗性芽的萌動(dòng)與生長(zhǎng)。共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至含250mg/L頭孢霉素(Cef)、50mg/L潮霉素(Hygromycin)的MS+1mg/LNAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移4～5次直至無(wú)細(xì)菌為止，獲得抗性芽；5、長(zhǎng)度在1cm以上的抗性芽插入至成苗培養(yǎng)基(MS+50mg/L Hygormycin+250mg/LCef)上培養(yǎng)。獲得完整的潮霉素抗性植株；6、用PCR和Southern blotting檢測(cè)潮霉素抗性植株，用Northern blotting檢測(cè)多酚氧化酶基因的表達(dá)水平；7、對(duì)轉(zhuǎn)基因甘薯進(jìn)行田間試驗(yàn)，用薯塊檢測(cè)多酚氧化酶的活性。進(jìn)一步篩選多酚氧化酶活性低的轉(zhuǎn)基因甘薯；8、多酚氧化酶活性的測(cè)定。甘薯(包括幼苗、毛狀根、細(xì)胞系等)中的多酚氧化酶采用比色發(fā)測(cè)定活性(姜紹通，羅志剛，等，2001)。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因甘薯和非轉(zhuǎn)基因甘薯多酚氧化酶活性比較和抗褐化性能比較1、比較轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因甘薯薯塊多酚氧化酶的活性，采用姜紹通等人建立的方法(2001)；2、轉(zhuǎn)基因甘薯塊根中多酚氧化酶的活性0.09，非轉(zhuǎn)基因甘薯塊根中多酚氧化酶活性為0.89；3、按照V.Sciancale和V.Zongne發(fā)明的方法(1984)測(cè)定甘薯褐化的強(qiáng)度，轉(zhuǎn)基因甘薯塊根褐化強(qiáng)度為0.11，非轉(zhuǎn)基因甘薯塊根中多酚氧化酶活性為0.58。
SEQ ID NO1<110>西南師范大學(xué)<120>一種利用基因工程技術(shù)培育抗褐化甘薯的方法<160>1<210>1<211>569<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(569)<223>甘薯多酚氧化酶基因核心片斷<400>1tatgttcaga ccgattaccc cgacaaggaa atccaagtcc acaattcatg gctgtttttc 60cctttccaca gatggtactt atatttctac gagagaatct tggggaagct aatcaacgac 120cccaccttcg ggcttccgtt ctggaactgg gatacccccg cgggaatgct gattcctcag 180tatttccgaa accaaaactc gccgttgtac gatgagaatc gtttgcaatc ccatctccca 240ctcgttatgg acctcggcta cgccgggacc gacactgacg tcacggatga tgagagaatc 300tctaacaacc tggccttgat gtacaagagt atggtgacta acgccggaac cgccgagctt 360ttcctcggga aaccgtacaa agccggcgac gacccggtca acaaaggcgg cgggtcgatc 420gagaatatcc cgcatacccc ggtccaccgc tgggtcggcg acgttcaacc gagaacacaa 480aatggggagg atatggggaa cttttactcg gccgggcggg atattttgtt ttactgtcac 540cattccaacg tcgaccgaat gtggaccat 569
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段，序列見(jiàn)SEQ ID NO1。
2.一種利用反義RNA技術(shù)降低甘薯多酚氧化酶含量的方法，特征在于利用具有編碼甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列核心片段的反義表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在甘薯細(xì)胞、組織、器官、植株中反義表達(dá)權(quán)利1中的DNA分子；其步驟如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法獲得甘薯多酚氧化酶基因的核心片斷；(2)把多酚氧化酶基因核心片斷連于表達(dá)調(diào)控序列，形成反義表達(dá)載體；(3)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移多酚氧化酶基因核心片斷到甘薯細(xì)胞、組織、器官、植株中；(4)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(5)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
3.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
4.用權(quán)利要求2所述方法獲得的生命體，其特征在于它是可生產(chǎn)多酚氧化酶含量降低甘薯的細(xì)胞、組織、器官、植株。
5.用權(quán)利要求4所述方法獲得多酚氧化酶含量降低甘薯的細(xì)胞、組織、器官、植株等轉(zhuǎn)基因生命體的后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)培育抗褐化甘薯的方法。涉及包含甘薯多酚氧化酶基因核心片段的獲得及利用反義RNA技術(shù)培育抗褐化的轉(zhuǎn)基因甘薯的方法。其過(guò)程是從甘薯中克隆多酚氧化酶基因核心片斷，并構(gòu)建了植物高效反義表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化甘薯。本方法可以降低甘薯塊根中多酚氧化酶基因的表達(dá)水平，提高了甘薯及其加工產(chǎn)品的品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1699574SQ200510057070
公開(kāi)日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者廖志華, 陳敏, 楊春賢, 諶容, 付玉凡, 張啟堂 申請(qǐng)人:西南師范大學(xué)