專利名稱：一種人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，特別是有關(guān)卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在日常的體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)臨床工作中，常規(guī)卵巢刺激周期獲取的卵子有15％左右是未成熟卵(immature oocytes，IMOs)[見(jiàn)參考1]，這些IMOs不能直接用于常規(guī)的單精子卵漿內(nèi)穿刺(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)輔助生殖治療，多被曠置，任其自然退化[見(jiàn)參考1-3]。開(kāi)發(fā)和利用這些在常規(guī)IVF/ICSI治療工作中多被丟棄的IMOs，即卵丘冠顆粒細(xì)胞(corona-cumulus，CCs)剝除的IMOs(corona-cumulus-denuded IMOs，ccdIMOs)，不管在輔助生殖臨床工作，抑或基礎(chǔ)科學(xué)研究，皆有許多實(shí)在的意義和應(yīng)用價(jià)值。例如卵巢刺激低反應(yīng)(獲卵數(shù)較少)的不孕患者，可考慮利用這些ccdIMOs，增加受孕機(jī)會(huì)。對(duì)捐贈(zèng)的ccdIMOs，可用于卵子發(fā)育、成熟及以卵子為基礎(chǔ)的科學(xué)研究，如胚胎干細(xì)胞的研究等。
未成熟卵的成熟過(guò)程涉及卵核成熟和卵漿成熟二部分[見(jiàn)參考1]。其中卵核成熟的形態(tài)學(xué)改變/標(biāo)志明顯，即停滯于第一次減數(shù)分裂前期的生發(fā)泡期(germinal vesicle stage，GV期)卵(以卵細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明晰的GV期核為特征)恢復(fù)第一次減數(shù)分裂，歷經(jīng)第一次減數(shù)分裂中期(metaphase of meiosis 1，M-I期卵，以卵細(xì)胞內(nèi)GV期核消失、沒(méi)有極體為特征)，直至第二次減數(shù)分裂中期(metaphase of meiosis 2，成熟卵，以卵周隙內(nèi)出現(xiàn)第一極體為特征)，詳見(jiàn)圖1。圖1是人類卵核成熟的不同階段的特征圖。由圖1可見(jiàn)，GV期卵內(nèi)有明晰的GV期核；M-I期卵內(nèi)GV期核消失，沒(méi)有極體；而成熟卵的卵周隙內(nèi)出現(xiàn)第一極體。
體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)技術(shù)可使IMOs體外成熟，隨后經(jīng)IVF/ICSI-ET處理可獲得25％～35％左右的臨床妊娠率，此治療方案在IVF-ET臨床已推廣應(yīng)用于卵巢過(guò)渡刺激綜合癥高危病例和具有IVF/ICSI-ET處理指征的月經(jīng)周期正常的不孕病例[見(jiàn)參考1，4，5]。但是人ccdIMOs的IVM成功(成熟)率、相應(yīng)成熟卵其后的發(fā)育能力皆明顯低于卵丘冠顆粒細(xì)胞未剝除的IMOs[即以卵丘復(fù)合體(cumulus-oocyte-complex，COC)形式存在的未成熟卵(cocIMOs)]的相應(yīng)指標(biāo)[見(jiàn)參考6，7]。有研究報(bào)告人ccdIMOs與猴單層Vero細(xì)胞(猴腎細(xì)胞)共培養(yǎng)(coculture of IVM，coIVM)可明顯改善人ccdIMOs相應(yīng)的體外成熟率[見(jiàn)參考8]。另有研究報(bào)告一定比例的非自體人成熟卵泡液(mature follicle fluid，MFF)參與人cocIMOs的IVM體系，可明顯改善IVM效果和相應(yīng)成熟卵的受精率[見(jiàn)參考9，10]。但是非自體人MFF和異種動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞coIVM培養(yǎng)可能導(dǎo)致同種異體或異種間的疾病傳播和/或交叉感染[見(jiàn)參考1]，因此影響其在輔助生殖臨床的廣泛應(yīng)用和推廣。
在整個(gè)卵子發(fā)育和成熟過(guò)程中，卵泡細(xì)胞的支持，包括卵巢壁層顆粒細(xì)胞(卵泡周邊的卵巢顆粒細(xì)胞)和卵丘冠顆粒細(xì)胞(最貼近卵子的卵巢顆粒細(xì)胞)的支持，是必需的[見(jiàn)參考11-15]。另一方面，越來(lái)越多的證據(jù)表明人MFF含有多量的營(yíng)養(yǎng)成分、促性腺激素、生長(zhǎng)因子以及其它到目前為止尚未確認(rèn)的有益于卵子成熟和胚胎發(fā)育的組分[見(jiàn)參考15-18]。人MFF可望成為IVM培養(yǎng)系統(tǒng)的合適培養(yǎng)基或有益的添加成分[見(jiàn)參考9，10，19]。
自體來(lái)源的MFF和卵丘顆粒細(xì)胞可在輔助生殖處理過(guò)程中(取卵和剝卵時(shí))一并獲取，用于自體ccdIMOs的coIVM沒(méi)有上述同種異體或異種間疾病傳播和/或交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，是理想的coIVM“佐劑”。
迄今為止使用自體卵巢顆粒細(xì)胞輔助ccdIMOs CoIVM專項(xiàng)研究報(bào)告只有兩篇，在IVM促進(jìn)方面皆未顯示優(yōu)勢(shì)[見(jiàn)參考2，20]。沒(méi)有自體MFF(autologousMFF，autoMFF)參與ccdIMOs IVM專項(xiàng)研究報(bào)告。更沒(méi)有人自體卵丘顆粒細(xì)胞(autologous CCs，autoCCs)和autoMFF協(xié)同用于ccdIMOs共IVM培養(yǎng)的研究報(bào)告。
目前現(xiàn)有的ccdIMOs IVM存在的主要問(wèn)題和缺陷是1)、單純的IVM培養(yǎng)成功(成熟)率及相應(yīng)成熟卵其后的發(fā)育能力不及cocIMOs的相應(yīng)指標(biāo)[見(jiàn)參考6，7]。
2)、用于coIVM的MFF和飼養(yǎng)層細(xì)胞多為同種異體或異種來(lái)源，有相應(yīng)同種異體或異種間疾病傳播和/或交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[見(jiàn)參考1]。
3)、僅有的兩篇自體卵巢顆粒細(xì)胞輔助人ccdIMOs CoIVM專項(xiàng)研究報(bào)告，在IVM促進(jìn)方面皆未顯示優(yōu)勢(shì)[見(jiàn)參考2，20]。我們分析相關(guān)原因主要是自體卵巢顆粒細(xì)胞未能及時(shí)(充分)發(fā)揮其作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的飼養(yǎng)作用；或表述為與ccdIMOs同步培養(yǎng)的autoCCs，其飼養(yǎng)作用相對(duì)滯后，尤其在IVM培養(yǎng)初期是如此。
4)、沒(méi)有人autoMFF參與ccdIMOs IVM專項(xiàng)技術(shù)或研究報(bào)告。
5)、更沒(méi)有人autoCCs和autoMFF協(xié)同用于ccdIMOs coIVM的專項(xiàng)技術(shù)或研究報(bào)告。
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發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能提高卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵體外培養(yǎng)成熟率、且能提高成熟卵其后發(fā)育能力的人體未成熟卵體外培養(yǎng)成熟方法。
本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，此未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵。該方法包括配置和預(yù)溫標(biāo)準(zhǔn)的人類體外成熟培養(yǎng)液(即IVM培養(yǎng)液)，將第一次減數(shù)分裂前期(GV期)、第一次減數(shù)分裂中期(M-I期)的未成熟卵均置于上述人類體外成熟培養(yǎng)液的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)；其特征是在所述人類體外成熟培養(yǎng)液中按照9∶1的體積比加入自體成熟卵泡液(AutoMFF)制成培養(yǎng)液A(M-I期未成熟卵專用培養(yǎng)液)，將M-I期未成熟卵置于所述培養(yǎng)液A的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)；在所述培養(yǎng)液A中加入分離、純化的自體卵丘冠顆粒細(xì)胞(AutoCCs)沉淀，懸浮成AutoCCs密度在1～5×105/ml的培養(yǎng)液B(GV期未成熟卵專用培養(yǎng)液)，將GV期未成熟卵置于所述培養(yǎng)液B的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
作為本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法的一種改進(jìn)該人類體外成熟培養(yǎng)液由基礎(chǔ)培養(yǎng)液、體積濃度為10％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素(FSH)和0.1IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HCG)組成；然后在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫平衡至少4小時(shí)。
作為本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法的進(jìn)一步改進(jìn)將培養(yǎng)液A制成相應(yīng)培養(yǎng)微滴后，覆蓋礦物油，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至少0.5小時(shí)；再將M-I期未成熟卵置于上述孵育后的培養(yǎng)液A微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
作為本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法的進(jìn)一步改進(jìn)將培養(yǎng)液B制成相應(yīng)培養(yǎng)微滴后，覆蓋礦物油，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至少0.5小時(shí)；再將GV期未成熟卵置于上述孵育后的培養(yǎng)液B微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
作為本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法的進(jìn)一步改進(jìn)所述培養(yǎng)均是指在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以第一極體(PB1)排出為卵細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的標(biāo)志。
本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，解決了如下幾個(gè)技術(shù)問(wèn)題1)、人ccdIMOs IVM較差的成熟率。2)、人非自體MFF和飼養(yǎng)層細(xì)胞在IVM方面使用可能發(fā)生的同種異體或異種間疾病傳播和/或交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。3)、AutoCCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，其飼養(yǎng)作用在ccdIMOs IVM方面發(fā)揮不及時(shí)(不充分)或相對(duì)滯后問(wèn)題。4)、AutoMFF在ccdIMOs IVM方面，其有益作用未很好利用問(wèn)題。5)、人autoCCs和autoMFF在ccdIMOs IVM方面，其整體、協(xié)同的有益作用未很好利用問(wèn)題。
圖2顯示在自體卵丘冠顆粒細(xì)胞(autoCCs)輔助的體外成熟培養(yǎng)(IVM)系統(tǒng)中追加(下面三幅圖)或不追加(上面三幅圖)自體成熟卵泡液(autoMFF)相應(yīng)autoCCs在不同的培養(yǎng)時(shí)段(由左至右分別是20小時(shí)，44小時(shí)和72小時(shí))的生長(zhǎng)和增殖情況。由圖2可見(jiàn)，追加AutoMFF可刺激AutoCCs生長(zhǎng)。與同一來(lái)源、同期培養(yǎng)、沒(méi)有追加AutoMFF的AutoCCs比較，追加AutoMFF的AutoCCs在顯微鏡下表現(xiàn)為可輕易辨別的明顯增大的細(xì)胞體積、明顯增多的細(xì)胞足突外延生長(zhǎng)和明顯增加的細(xì)胞匯合和培養(yǎng)液滴面積的被覆。其中左面4幅圖的放大倍數(shù)是200，最右面2幅圖的放大倍數(shù)是100。
由此，不難理解，在既往autoCCs輔助的coIVM系統(tǒng)內(nèi)同時(shí)追加autoMFF，既可及時(shí)發(fā)揮autoMFF對(duì)ccdIMOs IVM的直接有益作用，彌補(bǔ)autoCCs在coIVM初期(24小時(shí)內(nèi))--飼養(yǎng)層形成階段相對(duì)有限的飼養(yǎng)作用，又可通過(guò)刺激autoCCs生長(zhǎng)(具體見(jiàn)圖2)，間接發(fā)揮其對(duì)ccdIMOs IVM的有益作用。
我們的研究發(fā)現(xiàn)AutoMFF和AutoCCs參與的coIVM液滴培養(yǎng)多能在確認(rèn)需要時(shí)2小時(shí)內(nèi)(相當(dāng)于取卵后6～8小時(shí)內(nèi))建立。AutoCCs的生長(zhǎng)多能在培養(yǎng)20小時(shí)內(nèi)(相當(dāng)于取卵后24～28小時(shí)內(nèi))達(dá)到滋養(yǎng)層的程度，即貼壁生長(zhǎng)、相互匯合(confluence)被覆60～70％的液滴底表面積。培養(yǎng)液不置換的AutoCCs生長(zhǎng)多在培養(yǎng)36～60小時(shí)達(dá)到鼎盛時(shí)期，其后AutoCCs生長(zhǎng)趨緩，出現(xiàn)萎陷、退化征象。追加AutoMFF可促進(jìn)AutoCCs液滴培養(yǎng)和生長(zhǎng)。與同一來(lái)源、同期培養(yǎng)、沒(méi)有追加AutoMFF的AutoCCs比較，追加AutoMFF的AutoCCs在顯微鏡下表現(xiàn)為可輕易辨別的明顯增大的細(xì)胞體積、明顯增多的細(xì)胞足突外延生長(zhǎng)和明顯增加的細(xì)胞匯合和培養(yǎng)液滴面積的被覆。(具體見(jiàn)圖2)受到AutoMFF刺激的AutoCCs，作為ccdIMOs coIVM系統(tǒng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，可在coIVM24小時(shí)內(nèi)達(dá)到滋養(yǎng)層的程度，與GV期卵的ccdIMOs IVM需求基本同步，及時(shí)并充分地發(fā)揮其相應(yīng)的飼養(yǎng)作用。
上述人autoCCs和autoMFF在ccdIMOs coIVM系統(tǒng)的組合和協(xié)同作用，較充分地展示(利用)了兩者在ccdIMOs IVM方面整體、協(xié)同的有益作用。
圖3顯示本發(fā)明的兩種卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵(ccdIMOs)體外培養(yǎng)成熟技術(shù)(IVM)。由圖3可見(jiàn)，單純自體成熟卵泡液(autoMFF)輔助的IVM(AutoMFF-coIVM)，沒(méi)有自體卵丘冠顆粒細(xì)胞(autoCC)的參與，適合時(shí)程較短的M-I期ccdIMOs的IVM。而autoMFF和autoCCs共同輔助的coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)(AutoMFF&CCs-coIVM)，有autoCCs的參與，用于GV期ccdIMOs的IVM。
由于M-I期ccdIMOs的IVM時(shí)程較短，我們的研究觀察顯示68.8％M-I期ccdIMOs可在IVM 12小時(shí)內(nèi)成熟，所以對(duì)時(shí)程較短的M-I期ccdIMOs的IVM，我們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)僅追加10.0(v/v)％autoMFF，構(gòu)建所謂的autoMFF輔助的coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)(AutoMFF-coIVM)，用于M-I期ccdIMOs的IVM。(具體見(jiàn)圖3。)由于GV期ccdIMOs的IVM時(shí)程相對(duì)較長(zhǎng)，我們的研究觀察顯示只有25.5％GV期ccdIMOs在IVM 24小時(shí)內(nèi)成熟，多數(shù)需36-48小時(shí)的IVM方能成熟。所以對(duì)時(shí)程較長(zhǎng)的GV期ccdIMOs的IVM，我們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)不僅追加10.0(v/v)％autoMFF，而且追加1～5×105/ml autoCCs，構(gòu)建所謂的autoMFF和autoCC共同輔助的coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)(AutoMFF&CCs-coIVM)，用于GV期ccdIMOs的IVM。(具體見(jiàn)圖3。)GV期ccdIMOs的常規(guī)IVM培養(yǎng)系統(tǒng)追加autoCCs共培養(yǎng)有其實(shí)際的需求和autoCCs發(fā)揮飼養(yǎng)作用的時(shí)限跨度。如前所述的AutoMFF的直接參與以及對(duì)autoCCs生長(zhǎng)的刺激，使該GV期ccdIMOs的coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)趨于完善，相應(yīng)IVM效果更為保證。
本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)、較好的利用了autoCCs和autoMFF在ccdIMOs IVM方面整體、協(xié)同的有益作用，又沒(méi)有同種異體或異種間疾病傳播和/或交叉感染的憂慮或風(fēng)險(xiǎn)，體現(xiàn)發(fā)明方法明顯的處理個(gè)體化、揚(yáng)長(zhǎng)避短、醫(yī)療安全更有保障的特點(diǎn)。
2)、autoCCs和autoMFF取材在取卵和剝卵時(shí)一并進(jìn)行，對(duì)病者沒(méi)有額外的身心負(fù)荷。因此本發(fā)明方法技術(shù)簡(jiǎn)便、快捷，沒(méi)有額外的設(shè)備要求，沒(méi)有明顯的物品損耗或費(fèi)用增加，體現(xiàn)本發(fā)明方法明顯的可行性、可接受性和實(shí)用性特點(diǎn)。
3)、AutoMFF&CCs-coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)追加autoMFF可促進(jìn)autoCCs體外培養(yǎng)和生長(zhǎng)，相應(yīng)培養(yǎng)系統(tǒng)的autoCCs體外培養(yǎng)和生長(zhǎng)可在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到飼養(yǎng)層的程度(參見(jiàn)圖2)，解決了既往autoCCs輔助IVM或飼養(yǎng)作用相對(duì)滯后、與相應(yīng)IVM的實(shí)際需求不同步、相應(yīng)IVM輔助效用不顯著的問(wèn)題。體現(xiàn)本發(fā)明方法相應(yīng)同步需求明顯改善、IVM輔助效用顯著的特點(diǎn)。
4)、AutoMFF-coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)和AutoMFF&CCs-coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)分別用于M-I期和GV期ccdIMOs的IVM，可以明顯促進(jìn)和改善相應(yīng)期別未成熟卵的IVM，提高單位時(shí)程的成熟(成功)率，加速未成熟卵的IVM進(jìn)程。(參見(jiàn)表1、圖4和圖5。)-AutoMFF-coIVM培養(yǎng)系統(tǒng)適合時(shí)程較短的M-I期ccdIMOs的IVM；-AutoMFF&CCs-coIVM適合時(shí)程較長(zhǎng)的GV期ccdIMOs的IVM。
表1不同IVM方案不同時(shí)段GV期和M-I期ccdIMOs成熟率及比較

a與GV期ccdIMOs相應(yīng)IVM時(shí)段比較，x2檢驗(yàn)，x2＞6.635，P＜0.01b與同類別ccdIMOs使用IVM標(biāo)準(zhǔn)方案比較，x2檢驗(yàn)，x2＞3.381，P＜0.05IVMin vitro maturation(體外成熟培養(yǎng))M1-stagemetaphase of meiosis 1(第一次減數(shù)分裂中期)GV-stagegerminal vesicle stage of meiosis(第一次減數(shù)分裂前期/生發(fā)泡期)ccdIMOscorona-cumuIus denuded immature oocytes(卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成孰卵)
AutoMFF IVMautologous matured follicular fluid-assisted IVM protocol(自體成熟卵泡液輔助的體外成熟培養(yǎng))AutoMFF&CCs colVMautologous matured follicular fluid and autologous corona-cumulus-assisted IVMcoculture protocol(自體成熟卵泡液和自體卵丘冠顆粒細(xì)胞共同輔助的體外成熟培養(yǎng))圖4顯示卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的M-I期未成熟卵(M1期ccdIMOs)不同IVM方案不同時(shí)段相應(yīng)IVM效果及比較。由圖4可見(jiàn)，M-I期ccdIMOs使用本發(fā)明的自體成熟卵泡液輔助的IVM方案(AutoMFF-coIVM)，其各個(gè)IVM時(shí)段的成熟率皆高于IVM標(biāo)準(zhǔn)方案相應(yīng)時(shí)段的成熟率，在IVM 24小時(shí)和IVM36小時(shí)的相應(yīng)成熟率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＜0.05)。
圖5顯示卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的GV期未成熟卵(GV期ccdIMOs)不同IVM方案不同時(shí)段相應(yīng)IVM效果及比較。由圖5可見(jiàn)，GV期ccdIMOs諸IVM方案的相應(yīng)IVM成熟率差異在IVM 36小時(shí)時(shí)開(kāi)始顯現(xiàn)。本發(fā)明的自體成熟卵泡液和自體卵丘冠顆粒細(xì)胞共同輔助的IVM方案(AutoMFF&CCs-coIVM)，相應(yīng)IVM成熟率明顯高于IVM標(biāo)準(zhǔn)方案，coIVM48小時(shí)的成熟率達(dá)到85.7％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＜0.05)。
綜上所述，本發(fā)明的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，即用于卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵的IVM，是用一定比例的人自體成熟卵泡液(AutoMFF)和自體卵丘冠顆粒細(xì)胞(AutoCCs)輔助標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)系統(tǒng)，建立同步和個(gè)體化的IVM共培養(yǎng)系統(tǒng)(coIVM)，提供autoMFF和autoCCs對(duì)卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵IVM的有益支持，同時(shí)避免非自體成熟卵泡液和飼養(yǎng)層細(xì)胞在IVM方面的使用可能導(dǎo)致的同種異體或異種間疾病傳播和/或交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。


圖1是人類卵核成熟的不同階段的特征圖；圖2是IVM培養(yǎng)基內(nèi)追加(下圖)或不追加(上圖)自體成熟卵泡液、自體卵丘冠顆粒細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)段的飼養(yǎng)層樣生長(zhǎng)圖；圖3是卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵體外成熟共培養(yǎng)圖；圖4是M-I期ccdIMOs不同IVM方案在不同IVM時(shí)段的成熟率對(duì)比圖；圖5是GV期ccdIMOs不同IVM方案在不同IVM時(shí)段的成熟率對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
1、配制標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)液由基礎(chǔ)培養(yǎng)液、10(v/v)％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素(FSH)和0.1IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HCG)組成。培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃，5％CO2，飽和濕度)預(yù)溫平衡至少4小時(shí)待用。
基礎(chǔ)培養(yǎng)液可選用MediCult IVM系統(tǒng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Cat#82214010，MediCult公司，丹麥)或Irvine Scientific公司的HTF培養(yǎng)液(Cat#90125，IrvineScientific公司，美國(guó))。
10(v/v)％人血清替代品可選用Irvine Scientific公司的Serum substitutesupplement(Cat#99113，IrvineScientific公司，美國(guó))。
FSH可選用Serono公司的Gonal-F(Cat#S20030041/L1938801B，Serono公司，瑞士)。
HCG可選用Serono公司的Profasi(Cat#H20030198/L4778801C，Serono公司，瑞士)。
2、配制自體成熟卵泡液(autoMFF)輔助的培養(yǎng)液A(M-I期未成熟卵專用培養(yǎng)液)先行制備上述標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫至少4小時(shí)待用。
取卵當(dāng)日取卵同時(shí)抽吸自體主導(dǎo)卵泡液2～10ml，經(jīng)離心(1200rpm×10分鐘)、吸取上清、再經(jīng)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾獲得AutoMFF。4C冷藏待用。
在上述標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)液內(nèi)追加10(v/v)％的AutoMFF(即IVM培養(yǎng)液與AutoMFF的體積投料比為9∶1)，制備成相應(yīng)的培養(yǎng)液A(M-I期末成熟卵專用培養(yǎng)液)微滴，覆蓋礦物油，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(37℃，5％CO2，飽和濕度)至少0.5小時(shí)待用。
礦物油可選用Irvine Scientific公司產(chǎn)品(Cat#9305，IrvineScientific公司，美國(guó))。
3、配制autoMFF和autoCCs共同輔助的培養(yǎng)液B(GV期未成熟卵專用培養(yǎng)液)先行制備上述標(biāo)準(zhǔn)的IVM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫至少4小時(shí)待用。
再同上述實(shí)施方式第2點(diǎn)表述的方法配制autoMFF輔助的培養(yǎng)液A(即M-I期未成熟卵專用培養(yǎng)液)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(37℃，5％CO2，飽和濕度)至少0.5小時(shí)待用。
AutoCC取自自體卵細(xì)胞ICSI處理前透明質(zhì)酸酶消化(30秒左右)、再細(xì)管機(jī)械吹打獲取的游離AutoCCs。該初始的AutoCC懸液(1ml)經(jīng)預(yù)溫的淋巴細(xì)胞分離液(2ml)離心(2000rpm×20分鐘)分離、磷酸緩沖液(PBS)(3倍容量)懸浮、再離心(1200rpm×5分鐘)。如此獲取的AutoCCs沉淀，先用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再經(jīng)上述事先配制/預(yù)溫的autoMFF輔助的培養(yǎng)液A懸浮成細(xì)胞密度在1～5×105/ml的AutoMFF和AutoCCs共同輔助的培養(yǎng)液B(GV期未成熟卵專用培養(yǎng)液)，制備相應(yīng)的培養(yǎng)液微滴，覆蓋礦物油，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(37℃，5％CO2，飽和濕度)至少0.5小時(shí)待用。
透明質(zhì)酸酶可選用SAGE Biopharma公司產(chǎn)品(Hyaluronidase，Cat No.4007，SAGE Biopharma公司，美國(guó))。
淋巴細(xì)胞分離液可選用Bio Basic，Inc.公司產(chǎn)品(Cat No.Q/GHSB85-2001，Bio Basic，Inc.公司，上海，中國(guó))。
4、IVM方法高倍鏡下核實(shí)未成熟卵(IMOs)類別(GV期或M-I期)后，分類別搬移IMOs至相應(yīng)的IVM培養(yǎng)工作液微滴中將M-I期ccdIMOs搬移至autoMFF輔助的培養(yǎng)液A(即M-I期未成熟卵專用培養(yǎng)液)的微滴中，將GV期ccdIMOs搬移至autoMFF和autoCC共同輔助的培養(yǎng)液B(即GV期未成熟卵專用培養(yǎng)液)的微滴中；分別培養(yǎng)48-72小時(shí)(37℃，5％CO2，飽和濕度)。每6～12小時(shí)觀察卵母細(xì)胞成熟情況，以第一極體(PB1)排出為卵細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的標(biāo)志。一旦核實(shí)卵子成熟，接續(xù)ICSI處理和其后常規(guī)的植入前胚胎培養(yǎng)和發(fā)育觀察。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，所述未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵，該方法包括配置和預(yù)溫標(biāo)準(zhǔn)的人類體外成熟培養(yǎng)液，將第一次減數(shù)分裂前期、第一次減數(shù)分裂中期的未成熟卵均置于上述人類體外成熟培養(yǎng)液的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)；其特征是在所述人類體外成熟培養(yǎng)液中按照9∶1的體積比加入自體成熟卵泡液制成培養(yǎng)液A，將第一次減數(shù)分裂中期的未成熟卵置于所述培養(yǎng)液A的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)；在所述培養(yǎng)液A中加入分離、純化的自體卵丘冠顆粒細(xì)胞沉淀，懸浮成自體卵丘冠顆粒細(xì)胞密度在1～5×105/ml的培養(yǎng)液B，將第一次減數(shù)分裂前期的未成熟卵置于所述培養(yǎng)液B的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，其特征是所述人類體外成熟培養(yǎng)液由基礎(chǔ)培養(yǎng)液、體積濃度為10％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素和0.1IU/ml人絨毛膜促性腺激素組成；然后在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫平衡至少4小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，其特征是將所述培養(yǎng)液A制成相應(yīng)培養(yǎng)微滴后，覆蓋礦物油，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至少0.5小時(shí)；再將第一次減數(shù)分裂中期的未成熟卵置于上述孵育后的培養(yǎng)液A微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，其特征是將所述培養(yǎng)液B制成相應(yīng)培養(yǎng)微滴后，覆蓋礦物油，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至少0.5小時(shí)；再將第一次減數(shù)分裂前期的未成熟卵置于上述孵育后的培養(yǎng)液B微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，其特征是所述培養(yǎng)均是指在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以第一極體排出為卵細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人體未成熟卵體外成熟培養(yǎng)方法，未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的未成熟卵，該方法包括配置和預(yù)溫標(biāo)準(zhǔn)的人類體外成熟培養(yǎng)液，在所述人類體外成熟培養(yǎng)液中按照9∶1的體積比加入自體成熟卵泡液制成培養(yǎng)液A，將第一次減數(shù)分裂中期的未成熟卵置于所述培養(yǎng)液A的微滴中進(jìn)行培養(yǎng)；在所述培養(yǎng)液A中加入分離、純化的自體卵丘冠顆粒細(xì)胞沉淀，懸浮成自體卵丘冠顆粒細(xì)胞密度在1～5×10
文檔編號(hào)C12N5/08GK1800371SQ20051006211
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者朱小明, 黃荷鳳, 朱依敏, 徐晨明, 錢羽力, 金帆 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)