專利名稱：鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構(gòu)建技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用雙鏈RNA干涉等現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，改造野生核型多角體病毒(NPV)，構(gòu)建鱗翅目害蟲的高毒力NPV的技術(shù)。
背景技術(shù)：
鱗翅目昆蟲，如尺蠖、毛蟲等，是為害農(nóng)作物的重要害蟲種類之一。這些害蟲大量發(fā)生時，造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)劣化。因此，尺蠖等鱗翅目昆蟲是農(nóng)作物生產(chǎn)上的重要防治對象之一。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的農(nóng)藥主要有兩類一類是化學(xué)合成農(nóng)藥，如菊酯類農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥和殺蟲脲等；另一類是生物農(nóng)藥，如核型多角體病毒(NPV)制劑、蘇云金桿菌(Bt)制劑以及一些捕食性昆蟲等。化學(xué)合成農(nóng)藥，防治速度快、效果好，但容易引起農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及害蟲的抗藥性問題。生物農(nóng)藥NPV屬于昆蟲桿狀病毒，其外被為多角體蛋白，其內(nèi)為雙鏈環(huán)狀DNA分子。游離NPV病毒粒子可通過昆蟲進(jìn)食和體壁創(chuàng)傷感染；而具有包含體的NPV病毒只能由昆蟲進(jìn)食感染，進(jìn)入害蟲中腸的NPV粒子在消化液的作用下，多角體蛋白被破壞并釋放出游離病毒粒子，之后通過附著、融合、去殼等過程進(jìn)入害蟲細(xì)胞，并在核中大量復(fù)制并利用宿主細(xì)胞核糖體合成多角體包裝成完整的NPV。受NPV侵染的害蟲逐漸出現(xiàn)拒食等癥狀，最終死亡。但是，野生型的NPV病毒株侵染率低，潛伏期長，殺蟲速度慢，防治效果不理想。因此，NPV生物農(nóng)藥在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用還比較有限。
幾丁質(zhì)是尺蠖等鱗翅目害蟲的卵膜、蛹?xì)ぁ⒂紫x表皮和中腸圍食膜以及成蟲體壁等組織的重要組分。而幾丁質(zhì)是由尿嘧啶二磷酸-N-乙酰-葡糖胺通過β-1，4方式連接形成的聚合物，該反應(yīng)由幾丁質(zhì)合成酶(CS)催化完成。CS為大分子量的細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，主要由位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的催化活性中心和多個親脂跨膜區(qū)域組成。
雙鏈RNA介導(dǎo)的基因干涉(dsRNAi)是近年來分子生物學(xué)最突出的科研成果之一。它是一段由21-25nt組成的RNA分子，通過對靶RNA進(jìn)行特異性降解而“敲除”目的基因，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后沉默。dsRNAi技術(shù)比反義基因技術(shù)更加高效、更加特異，因此已廣泛應(yīng)用于生物基因表達(dá)調(diào)控研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在克隆尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)基因保守序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)dsRNAi可有效“敲除”目標(biāo)基因的原理，構(gòu)建包含鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi序列的載體，并通過酶切和連接反應(yīng)將該序列成功導(dǎo)入野生型NPV基因組，利用NPV原有的侵染和表達(dá)系統(tǒng)，使CS dsRNAi序列在尺蠖等鱗翅目害蟲細(xì)胞中表達(dá)，抑制害蟲細(xì)胞內(nèi)源的CS基因活性，破壞幾丁質(zhì)合成，缺乏幾丁質(zhì)合成的茶尺蠖將無法形成正常的細(xì)胞壁，不能進(jìn)行有效的細(xì)胞分裂和生長，而且害蟲重要的消化器官“中腸圍食膜”因為缺乏幾丁質(zhì)而喪失正常消化功能，最終導(dǎo)致害蟲死亡。改造后的新型NPV具有更快的擴(kuò)散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
本發(fā)明鱗翅目害蟲高毒力核型多角體病毒的構(gòu)建技術(shù)包括以下步驟1、鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)基因保守序列經(jīng)克隆純化后連接到pUcm-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗性篩選獲包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)；2、通過酶切和連接將CS插入雙鏈干涉序列(dsRNAi)中間載體，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr，經(jīng)驗證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增；3、將pFGC5941-CS-intron-CSr中間載體雙酶切后獲得的CS-intron-CSr序列插入包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質(zhì)粒，構(gòu)建pFASTBacI-ph-CS-intronCSr；4、將pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA(Bacmid)和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌(DH10Bac)，獲包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV；5、將上述重組NPV侵染草地葉蛾細(xì)胞株sf9擴(kuò)增，經(jīng)篩選獲高毒力重組NPV。
按本技術(shù)方案所獲高毒力重組NPV應(yīng)用于植物鱗翅目害蟲的防治。
上述步驟進(jìn)一步敘述如下①.尺蠖等鱗翅目害蟲CS保守序列克隆根據(jù)鱗翅目害蟲CS基因保守序列設(shè)計2-4對特異引物，提取害蟲mRNA，并進(jìn)行RT-PCR，獲得CS基因保守序列，并進(jìn)行序列分析驗證。CS基因RT-PCR產(chǎn)物純化后連到pUCm-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過抗性篩選和PCR驗證，獲得包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)。
②.鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi中間載體構(gòu)建重新合成兩對包含酶切位點的引物[其中1對包含Asc I(BssH I)/Swa I位點；另1對包含Xba I/BamH I]，以pUCm-T-CS為摸板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含酶切位點的產(chǎn)物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同樣酶切的pFGC5941中，構(gòu)建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同樣酶切的pFGC5941-CS中，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr。將獲得的CS基因dsRNAi載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌、PCR驗證和擴(kuò)增。
③.包含CS雙鏈干涉序列的NPV轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建將提取的pFGC5941-CS-intron-CSr，以Asc I/Xba I雙酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(與Asc I是同尾酶)/Xba I酶切的包含多角體基因(ph)的pFASTBac I-ph質(zhì)粒，構(gòu)建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
④.包含CS雙鏈干涉序列的重組NPVpFASTBac I-ph-CS-intron-CSr轉(zhuǎn)化DH10Bac(包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌)，獲得包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV。并將重組NPV侵染草地葉蛾細(xì)胞株sf9，獲完整重組NPV。
⑤.新型重組NPV病毒分子生物學(xué)驗證和殺蟲能力評價通過PCR等方法對重組NPV進(jìn)行驗證；以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進(jìn)行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV。


圖1為本發(fā)明技術(shù)方案流程框圖。
具體實施例方式
實施例含茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶(CS)雙鏈干涉基因序列的NPV構(gòu)建方法1)取3齡茶尺蠖幼蟲1條約100mg，以Trizol(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，電泳檢測RNA質(zhì)量，并以GENQUENT分析RNA濃度。具體操作參照試劑和儀器說明。
2)以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工)合成茶尺蠖幼蟲cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒說明。
3)以特異引物對L-CS0/R-CS0(委托上海生工合成)進(jìn)行RT-PCR。PCR條件如表1。
L-CS0 5’TTCGAATACGCCATCGGCCATTGGR-CS0 5’CCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG
表1

4)上述PCR后獲192bp左右CS目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)純化后與pUCm-T于16℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物pUCm-T-CS轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α(上海生工)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，以菌落PCR方法進(jìn)行連接結(jié)果驗證，同時進(jìn)行序列分析(序列分析委托上海聯(lián)合基因公司進(jìn)行)，所獲得的CS基因序列為TTCGAATACG CCATCGGCCATTGGCTGCAA AAGGCCACGG AGCACATGATTGGCTGCGTG CTCTGTTCACCTGGATGCTT CTCCCTGTTC AGGGGCAAGGCCCTCATGGA TGACAATGTGATGAAGAAAT ACACGACACG GTCGGATGAGGCTCGTCACT ACGTGCAGTACGATCAGGGC GAGGATCGTT GG5)陽性菌落經(jīng)擴(kuò)繁后，抽提質(zhì)粒。
6)重新合成以下兩對包含酶切位點的引物L(fēng)-CS01/L-CS01和L-CS02/R-CS02(上海生工)，以包含CS序列的T載體(pUCm-T-CS)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含酶切位點的產(chǎn)物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同樣酶切的pFGC5941，構(gòu)建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同樣酶切的pFGC5941-CS，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr。將包含CS基因dsRNAi載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌、PCR驗證和擴(kuò)增。
L-CS01 5’AAGGCGCGCCTTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Asc I(BssH I)位點)R-CS01 5’AAATTTAAATCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含Swa I位點)L-CS02 5’AATCTAGATTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Xba I位點)
R-CS02 5’AAGGATCCCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含BamH I位點)7)獲得的質(zhì)粒pFGC5941-CS-intron-CSr經(jīng)Asc I/Xba I雙酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(與Asc I是同尾酶)/Xba I雙酶切的包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質(zhì)粒(Invitrogen公司)，構(gòu)建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
7)將pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr轉(zhuǎn)化DH10Bac(包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌，Invitrogen公司)，獲得包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV DNA，具體操作參照有關(guān)試劑說明。
8)并將重組NPV侵染草地葉蛾細(xì)胞株sf9(Invitrogen公司)，獲完整重組NPV。
9)以不包含外源CS雙鏈干涉序列的野生NPV為對照，比較重組病毒對尺蠖幼蟲的侵染和毒殺能力的差異。具體做法為將上述培養(yǎng)獲得的重組NPV以及野生NPV病毒配制成3×104PIB/ml溶液，將茶樹葉片在病毒溶液中浸潤后，自然風(fēng)干后分別飼喂3齡尺蠖幼蟲(每個處理30頭尺蠖，重復(fù)3次)，定時進(jìn)行觀察并統(tǒng)計尺蠖死亡情況。結(jié)果顯示，含CS雙鏈干涉序列的重組病毒侵染尺蠖后，潛伏期縮短1倍以上，茶尺蠖感染前期死亡率超過對照50％以上。
說明上述方法構(gòu)建的包含鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶雙鏈干涉基因序列的重組NPV是成功的。
權(quán)利要求
1.鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構(gòu)建技術(shù)，其特征在于如下步驟(1)鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)基因保守序列經(jīng)克隆純化后連接到pUcm-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗性篩選獲包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)；(2)通過酶切和連接將CS插入雙鏈干涉序列(dsRNAi)中間載體，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr，經(jīng)驗證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增；(3)將pFGC5941-CS-intron-CSr中間載體雙酶切后獲得的CS-intron-CSr序列插入包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質(zhì)粒，構(gòu)建pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr；(4)將pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA(Bacmid)和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌(DH10Bac)，獲包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV；(5)將上述重組NPV侵染草地葉蛾細(xì)胞株sf9擴(kuò)增，經(jīng)篩選獲高毒力重組NPV。
2.按權(quán)利要求1所述鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構(gòu)建技術(shù)，其特征在于按本技術(shù)所獲高毒力重組NPV應(yīng)用于植物鱗翅目害蟲的防治。
全文摘要
鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構(gòu)建技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用雙鏈RNA干涉等現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，改造野生核型多角體病毒(NPV)，構(gòu)建鱗翅目害蟲的高毒力NPV的技術(shù)。本發(fā)明的高毒力核型多角體病毒的構(gòu)建技術(shù)包括以下步驟①尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)基因保守序列的克??；②鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi中間載體構(gòu)建；③包含CS雙鏈干涉序列的NPV轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建；④包含CS雙鏈干涉序列的NPV重組，并通過PCR等方法對重組NPV進(jìn)行驗證。以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進(jìn)行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV。改造后的新型NPV對鱗翅目害蟲具有更快的擴(kuò)散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
文檔編號C12N15/63GK1804030SQ20051006213
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者陸建良, 梁月榮, 張廣輝, 林晨, 杜穎穎, 潘順順 申請人:浙江大學(xué)