專利名稱：靶向抗肺癌sod的構(gòu)建與表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程制藥領(lǐng)域，特別涉及一種高定位能力及透膜能力的抗肺癌SOD的構(gòu)建及其高效表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
臨床上，SOD作為腫瘤治療藥物有兩個難以同時克服的應(yīng)用缺陷其一SOD對病理組織或細(xì)胞并無特異性識別能力，且對靶部位即腫瘤細(xì)胞的親和力低，藥用趨向性不明顯，對癌癥缺乏特異性作用；其二，它必須進(jìn)入細(xì)胞，才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，天然SOD由于其分子量較大而基本不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。ScFv在保持抗原抗體結(jié)合特異性的同時具有較小的分子量，易于到達(dá)靶組織，是較為理想的靶向分子。LC-1型ScFv，它可以高效作用于所有4種病理類型的肺癌細(xì)胞，包括肺腺癌細(xì)胞，肺鱗狀癌細(xì)胞，肺大癌細(xì)胞和肺小癌細(xì)胞，但不作用于正常細(xì)胞和組織。同時，它可以識別并結(jié)合到肺癌細(xì)胞表面抗原，通過受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞途徑而透膜。SOD-ScFv將利用ScFv對肺癌細(xì)胞的識別能力和結(jié)合能力，靶向定位到腫瘤局部，并透膜發(fā)揮其抗腫瘤藥效。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種具有高定位能力及透膜能力的抗肺癌SOD的構(gòu)建和表達(dá)方法。
其構(gòu)建方法包括以下步驟(1)從含念珠藻CHEN Fe-SOD(Nostoc commune strain CHEN Fe-SOD)的pET-SOD質(zhì)粒中TD-PCR擴(kuò)增獲得Fe-SOD基因；TD-PCR擴(kuò)增所用引物SOD-Nco5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含Nco I位點(diǎn)，SOD-Sal5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含Sal I位點(diǎn)，引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA終止密碼子，并在其末端加上編碼GGGG的密碼子，即GGCGGAGGCGGA；
(2)以含ScFv的T-ScFv質(zhì)粒為模板TD-PCR擴(kuò)增獲得ScFv基因；TD-PCR擴(kuò)增所用引物ScFv-Sal5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG 含Sal I位點(diǎn)，ScFv-Not5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含Not I位點(diǎn)；引物ScFv-Not末端含TAG終止密碼子；(3)以Nco I，Sal I酶切步驟(1)得到的Fe-SOD基因；(4)以Sal I，Not I酶切步驟(2)得到的ScFv基因；(5)將步驟(3)和(4)得到的基因重組得到SOD-ScFv融合基因，并重組進(jìn)經(jīng)Nco I，Not I酶切的pET28a(+)質(zhì)粒載體，控制此融合基因5’端與T7啟動子之間的距離，構(gòu)建得到Pet-SOD-ScFv融合載體；(6)將Pet-SOD-ScFv融合載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，命名為Pet-SOD-ScFv工程菌。
其純化方法依次包括以下步驟(1)離心收集菌體，超聲波破碎菌液，獲得SOD-ScFv包涵體沉淀；(2)將沉淀分別用包涵體裂解液I和包涵體裂解液II洗滌兩次；(3)置于含SLS的變性液中變性，并過Sephadex-G100分子篩柱，純化融合蛋白并加Fe3+復(fù)性。
其中步驟(3)中的Fe3+為FeCl3。
其中步驟(3)中的加Fe3+的量為100umol/ml培養(yǎng)基。
抗肺癌SOD的表達(dá)方法，包括以下步驟加入IPTG和Fe3+誘導(dǎo)表達(dá)，SOD-ScFv獲得表達(dá)。
作為表達(dá)方法的一種改進(jìn)，在菌液OD600為0.4時加IPTG和Fe3+。
作為表達(dá)方法的另一種改進(jìn)，誘導(dǎo)表達(dá)時間為2小時。
作為表達(dá)方法的另一種改進(jìn)，所加入的Fe3+為FeCl3。
作為表達(dá)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所加入的Fe3+的濃度為100～300umol/ml培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供了按照上述構(gòu)建所生產(chǎn)的pET-SOD-ScFv工程菌。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、去除了SOD序列末端的終止密碼子TAA，并以4個Gly與ScFv相連接，甘氨酸是側(cè)鏈最短的氨基酸，這將最大可能減小SOD與ScFv的空間干擾，保證兩者生物學(xué)活性。
2、將融合蛋白基因序列克隆于pET28a(+)質(zhì)粒載體的Nco I和Not I位點(diǎn)之間，且融合蛋白前端不帶任何信號肽序列，末端不帶任何標(biāo)簽，這消除了多余氨基酸殘基對融合蛋白活性可能造成地潛在影響。
3、融合蛋白SOD-ScFv誘導(dǎo)表達(dá)過程中加入300μM FeCl3，最終SOD-ScFv獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物占全菌蛋白79％，為國內(nèi)罕見。
4、SOD-ScFv融合蛋白將兩者功能合而為一。既可以提高SOD對腫瘤細(xì)胞的識別和定位能力，即靶向性，又可以克服SOD不能透膜的局限性，因此，它將具有比SOD更高抗腫瘤能力。
本人已申請專利“pET-SOD工程菌的構(gòu)建及其高效表達(dá)”，在該申請中已詳述pET-SOD工程菌的構(gòu)建及其高效表達(dá)。


圖1是SOD-ScFv融合基因序列圖譜；圖1中斜體部分代表SOD，黑體部分代表ScFv；圖2是SOD-ScFv融合蛋白表達(dá)圖譜；圖2中1-Marker；2-單獨(dú)表達(dá)的SOD蛋白；3、4、5-[Fe3+]＝300uM、200uM、100uM時表達(dá)的SOD-ScFv融合蛋白；6-未誘導(dǎo)時的全菌蛋白；7-空白；8-SOD-ScFv包涵體；9-純化后SOD-ScFv；圖3是不同濃度SOD-ScFv對SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞的抑制試驗(yàn)示意圖；圖4是SOD-ScFv對SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞、AGS胃癌細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞的抑制試驗(yàn)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述實(shí)施例1、念珠藻基因組SDS-CATB制備方法(1)取1ml念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)培養(yǎng)物，用TE緩沖液洗滌兩次，充分碾磨備用；其中TE緩沖液Tris 50mM，EDTA 20mM，pH8。
念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)購自中科院武漢水生所FACHB。
(2)加入567μl的TE緩沖液，拌勻，于液氮中反復(fù)凍融3次。
(3)加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml的蛋白酶K，混勻，37℃保溫1h。
(4)加入100μl的5mol/L NaCL，充分混勻，再加入80μl的CATB/NaCL混勻，在65℃下保溫10min。
CATB/NaCL2％CTAB、100mmoI/L Tris.HCI(pH 8.0)、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl。
(5)加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻，離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一新管中。
(6)加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新管中。
(7)加入0.6體積的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀下來(30min)，離心5min，棄上清，用70％乙醇洗滌一下沉淀。離心5min。
(8)將其溶于100μl的TE中，加入RNA酶，直至終濃度50μg/ml，置于37℃水浴30min。
(9)加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻。離心5min。轉(zhuǎn)移上清液至新管中。
(10)加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新管中。
(11)加入0.6體積的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀下來(30min)，離心5min，棄上清，用70％乙醇洗滌一下沉淀，離心5min。
(12)棄去上清，沉淀風(fēng)干，用20μl的TE緩沖溶液溶解DNA，然后加入兩倍體積無水乙醇，放入4℃冰箱沉淀30min.最終溶于20μl TE。
實(shí)施例2、構(gòu)建pET-SOD工程菌(1)在無菌條件下，將念珠藻CHEN藻種2ml接入1000mlBG11培養(yǎng)基中，于25℃，2000XL光照強(qiáng)度每天光照10小時，并搖瓶一次。培養(yǎng)45天后，取下層培養(yǎng)物，采用Kim的SDS-CATB法抽提念珠藻基因組。
(2)查詢Genbank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有物種Fe-SOD基因序列，blastn比對分析它們的同源性，預(yù)測其進(jìn)化趨勢，并根據(jù)同源性最高物種(Spirulinaplatensis，Nostoc linckia等)的Fe-SOD基因序列設(shè)計(jì)出引物SODn(5’-CTAGCCATGGCATTTG TACAGC-3’，含Nco I酶切位點(diǎn))和SODx5’-CCGCTCGAGAGCTTTGGCCAAGTTTTC-3’，含Xhol I酶切位點(diǎn))。以念珠藻基因組為模板，以SODn和SODx為引物，擴(kuò)增Fe-SOD基因，PCR程序?yàn)榈谝浑A段94℃ 5min，第二階段94℃ 50s50℃ 60s72℃ 60s第二階段循環(huán)40次，最后一個循環(huán)最后一步保持72℃ 10min；回收PCR產(chǎn)物，以Nco I和Xhol I酶切，并重組至經(jīng)相同酶切的pET22b(+)質(zhì)粒，SOD基因末端與6×His標(biāo)簽的基因序列相連，重組質(zhì)粒命名為pET-SOD，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli.BL21，通過PCR和酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測序確定正確的陽性克隆。
pET22b(+)質(zhì)粒購自Invitrogen公司。
實(shí)施例3、構(gòu)建T-ScFv工程菌(1)以雜交瘤細(xì)胞株LC-1總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA(Liang CHEN，Gang LI，LeiTANG，Jue WANG，Xi Rui GE.The inhibition of lung cancer cell growth byintracellular immunization with LC-1ScFv.Cell Research(2002)，12(1)47-54)為模板，以Vl-1(5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3)和Vl-2(5’-CTATTTGATCTCGAGCTTGGTC-3’)為輕鏈引物PCR擴(kuò)增LC-1抗體輕鏈基因Vl，以Vh-1(5’-CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3)和Vh-2(5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCAG-3)為重鏈引物PCR擴(kuò)增LC-1抗體重鏈基因Vh。PCR程序同實(shí)施例2。
(2)以Vl與Vh為引物，不用模板，用SOE-PCR將Vl與Vh相連，構(gòu)建ScFv，SOE-PCR程序?yàn)榈谝浑A段94℃ 5min，第二階段94℃ 50s
50℃ 60s72℃ 60s第二階段循環(huán)5次，最后一個循環(huán)最后一步保持72℃ 10min；以上PCR產(chǎn)物為模板，Vh-2和Vl-1為引物，擴(kuò)增ScFv基因，PCR程序同實(shí)施例2。
回收PCR產(chǎn)物，克隆至pUCm-T載體(美國，Novagen公司)，構(gòu)建成T-ScFv載體，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli.DH5α，通過PCR和酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測序確定正確的陽性克隆。
實(shí)施例4、Pet-SOD-ScFv工程菌的構(gòu)建(1)合成引物SOD-Nco，5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG，含Nco I位點(diǎn)和SOD-Sal，5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC，含Sal I位點(diǎn)和GGGG密碼子，從含念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)Fe-SOD的pET-SOD質(zhì)粒中TD-PCR擴(kuò)增獲得Fe-SOD基因，擴(kuò)增條件為第一階段94℃ 5min，第二階段94℃ 30s60℃ 60s72℃ 60s第二階段循環(huán)10次，每個循環(huán)的第二步降低1℃，至50℃；第三階段94℃ 30s50℃ 60s72℃ 60s第三階段循環(huán)21次，最后一個循環(huán)最后一步保持72℃ 10min；引物SOD-Sal不含F(xiàn)e-SOD基因序列3’端的TAA終止密碼子，并在其末端加上編碼GGGG的密碼子(GGCGGAGGCGGA)，并克隆至ScFv基因的5’端。
(2)合成引物ScFv-Sal，5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAG G，含SalI位點(diǎn)和ScFv-Not，5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC，含Not I和TAG中止密碼子，以含ScFv的T-ScFv質(zhì)粒為模板TD-PCR擴(kuò)增獲得ScFv基因。
擴(kuò)增條件為第一階段94℃ 5min，第二階段94℃ 30s65℃ 55s
72℃ 60s第二階段循環(huán)10次，每個循環(huán)的第二步降低1℃，至55℃；第三階段94℃ 30s55℃ 60s72℃ 60s第三階段循環(huán)21次，最后一個循環(huán)最后一步保持72℃ 10min；引物ScFv-Not末端貼加了TAG終止密碼子，保證表達(dá)出來的融合蛋白C端不帶任何多余潛在影響蛋白活性的氨基酸殘基。
(3)以Nco I，Sal I酶切以上Fe-SOD基因，以Sal I，Not I酶切以上ScFv基因，重組得到SOD-ScFv融合基因，并重組至經(jīng)Nco I，Not I酶切的pET28a(+)載體(美國，Novagen公司)，控制此融合基因5’端與T7啟動子之間的距離，保證融合蛋白N端不帶任何潛在影響蛋白活性的氨基酸殘基，并獲得非常高效地表達(dá)。構(gòu)建得到Pet-SOD-ScFv融合載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，通過PCR和酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測序確定正確的陽性克隆。
實(shí)施例5、表達(dá)(1)培養(yǎng)pET-SOD-ScFv工程菌在1L LB培養(yǎng)基中，控制Kam＝50PM/L，30℃培養(yǎng)至OD600＝0.4時，0.5mM IPTG，300μM FeCl3條件下誘導(dǎo)表達(dá)2小時。
(2)5000g離心10min收集以上菌體，溶于50ml TE，于800w，超聲波破碎菌液10min，12000g離心30min收集上清和沉淀，沉淀為SOD-ScFv包涵體，分別進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳。
電泳結(jié)果表明在最佳條件Kam＝50μM/L，30℃，0.5mM IPTG，300μM FeCl3條件下誘導(dǎo)表達(dá)2小時工程菌獲得高效表達(dá)，其分子量約49KD，約占全菌蛋白的79％(圖2，泳道3)實(shí)施例6如同實(shí)施例4步驟，其中FeCl3的量為200uM。
電泳結(jié)果表明目標(biāo)蛋白占全菌蛋白的75％，(圖2，泳道4)實(shí)施例7如同實(shí)施例4步驟，其中FeCl3的量為100uM。
電泳結(jié)果表明目標(biāo)蛋白占全菌蛋白的69％，(圖2，泳道5)實(shí)施例8如同實(shí)施例4步驟，其中不加IPTG和FeCl3。
電泳結(jié)果表明工程菌不表達(dá)(圖2，泳道6)。
實(shí)施例9、純化、復(fù)性及保存(1)將實(shí)施例4獲得的SOD-ScFv全部包涵體沉淀分別用50ml包涵體裂解液I和50ml包涵體裂解液II洗滌兩次，再用50ml 50mmol/L Tris-Hcl，0.3％SLS，0.1mmol/L二硫蘇糖醇的緩沖液溶解過夜。
包涵體裂解液I1mM EDTA，5％甘油，0.5％Triton X-100；包涵體裂解液II包涵體裂解液I加2mol/L尿素。
(2)取10ml變性液過200ml Sephadex-G100分子篩柱，流速控制在0.2ml/min，以2倍柱體積的TE洗脫，每份4ml分管收集，監(jiān)測A280。對含蛋白洗脫液收集管進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳。
電泳結(jié)果表明純化后的目標(biāo)蛋白比較單一，不含其它雜蛋白(圖2，泳道9)。
(3)4℃下，將以上純化獲得的全部SOD-ScFv變性蛋白置于含100μM FeCl3，不含SLS的變性緩沖液透析復(fù)性72h。獲得蛋白純品以ddH2O于4℃下透析24h，于-80℃凍干，液氮保存；其中步驟(2)中TE為20mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0。
實(shí)施例10、SOD活性測定將純化后的SOD-ScFv融合蛋白用Marklund[15]的鄰苯三酚自氧化法測定融合蛋白在325nm處的自氧化抑制率?？刂凄彵饺幼匝趸俾始s0.07OD/min，抑制率約50％，計(jì)算蛋白比活力。純化后SOD-ScFv比活力為650U/mg。
實(shí)施例10、SOD-ScFv靶向殺傷能力測定將SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞接種90μl(5×105個細(xì)胞/毫升)于96孔板，同時以AGS胃癌細(xì)胞，HepG2肝癌細(xì)胞做對照，37℃，二氧化碳(5％)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按設(shè)定的濃度梯度(0.2μM，0.5μM，1μM，2μM)加融合蛋白10μl，對照組加PBS，相同梯度濃度下表達(dá)獲得的SOD，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48h。按CCK-8試劑盒所示，每孔加入CCK-8試劑10μl，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)1h，450nm下測定吸收吸光度，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
結(jié)果如圖3所示48小時后，0.2μM SOD對SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞的抑制率為5.3％，0.2uM SOD-ScFv對SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞的抑制率為48.4％，IC50為0.21μM。
而0.2uM SOD-ScFv對AGS胃癌，HepG2肝癌細(xì)胞，抑制率分別為4.6％，2.7％(圖4)。這表明了融合蛋白具有對SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞的專一作用能力，且具有較SOD更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長抑制能力。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗肺癌SOD的構(gòu)建的方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)從含念珠藻CHEN Fe-SOD(Nostoc commune strain CHEN Fe-SOD)的pET-SOD質(zhì)粒中TD-PCR擴(kuò)增獲得Fe-SOD基因；TD-PCR擴(kuò)增所用引物SOD-Nco5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含Nco I位點(diǎn)，SOD-Sal5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含Sal I位點(diǎn)，引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA終止密碼子，并在其末端加上編碼GGGG的密碼子，即GGCGGAGGCGGA；(2)以含ScFv的T-ScFv質(zhì)粒為模板TD-PCR擴(kuò)增獲得ScFv基因；TD-PCR擴(kuò)增所用引物ScFv-Sal5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG含Sal I位點(diǎn)，ScFv-Not5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含Not I位點(diǎn)；引物ScFv-Not末端含TAG終止密碼子；(3)以Nco I，Sal I酶切步驟(1)得到的Fe-SOD基因；(4)以Sal I，Not I酶切步驟(2)得到的ScFv基因；(5)將步驟(3)和(4)得到的基因重組得到SOD-ScFv融合基因，并重組進(jìn)經(jīng)Nco I，Not I酶切的pET28a(+)質(zhì)粒載體，控制此融合基因5’端與T7啟動子之間的距離，構(gòu)建得到Pet-SOD-ScFv融合載體；(6)將Pet-SOD-ScFv融合載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，命名為Pet-SOD-ScFv工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗肺癌SOD的構(gòu)建的方法，其特征在于其純化方法依次包括以下步驟(1)離心收集菌體，超聲波破碎菌液，獲得SOD-ScFv包涵體沉淀；(2)將沉淀分別用包涵體裂解液I和包涵體裂解液II洗滌兩次；(3)置于含SLS的變性液中變性，并過Sephadex-G100分子篩柱，純化融合蛋白并加Fe3+復(fù)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗肺癌SOD的構(gòu)建的方法，其特征在于其中步驟(3)中的Fe3+為FeCl3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗肺癌SOD的構(gòu)建的方法，其特征在于其中步驟(3)中的加Fe3+的量為100umol/ml培養(yǎng)基。
5.一種如權(quán)利要求1所述的抗肺癌SOD的表達(dá)方法，其特征包括以下步驟加入IPTG和Fe3+誘導(dǎo)表達(dá)，SOD-ScFv獲得表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗肺癌SOD的表達(dá)方法，其特征在于在菌液OD600為0.4時加IPTG和Fe3+。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗肺癌SOD的表達(dá)方法，其特征在于誘導(dǎo)表達(dá)時間為2小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗肺癌SOD的表達(dá)方法，其特征在于所加入的Fe3+為FeCl3。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗肺癌SOD的表達(dá)方法，其特征在于所加入的Fe3+的濃度為100～300umol/ml培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種pET－SOD工程菌的構(gòu)建及其表達(dá)純化方法，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)引物從含念珠藻CHEN Fe－SOD的pET－SOD質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得Fe－SOD基因；設(shè)計(jì)引物從含ScFv的T－ScFv質(zhì)粒擴(kuò)增獲得ScFv基因；酶切Fe－SOD基因和ScFv基因后重組得到SOD－ScFv融合基因，并重組進(jìn)pET28a(+)質(zhì)粒載體，構(gòu)建得到Pet－SOD－ScFv融合載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，得到Pet－SOD－ScFv工程菌；加入IPTG和Fe
文檔編號C12N15/62GK1807638SQ20051006238
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者龔興國 申請人:浙江大學(xué)