專(zhuān)利名稱(chēng)：梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
檢測(cè)和鑒定果樹(shù)病毒的傳統(tǒng)方法是指示植物法、血清學(xué)方法。經(jīng)過(guò)幾十年篩選，國(guó)際上已經(jīng)確認(rèn)了成套標(biāo)準(zhǔn)指示植物。該法對(duì)鑒定目前已知的果樹(shù)病毒來(lái)說(shuō)，雖然可靠性高，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，并且費(fèi)工耗地。血清學(xué)方法較指示植物法檢測(cè)果樹(shù)病毒的靈敏性和檢測(cè)速度大大提高，特異性增強(qiáng)，目前已經(jīng)成為常規(guī)的果樹(shù)病毒檢測(cè)和鑒定方法，有關(guān)這方面的研究國(guó)內(nèi)外有很多報(bào)道。但該檢測(cè)方法因?yàn)楣麡?shù)病毒的抗血清制備困難而致使檢測(cè)成本高。并且很多果樹(shù)病毒因未能制備抗血清而無(wú)法使用該方法。
80年代以來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為果樹(shù)病毒的研究提供了一種前所未有的新途徑。比起指示植物法和血清學(xué)方法，分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)果樹(shù)病毒有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)檢測(cè)病毒的靈敏性比上述方法高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，可以檢測(cè)到用上述方法檢測(cè)不到的病毒，而且特異性更強(qiáng)、速度更快。歐美一些國(guó)家率先采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)果樹(shù)病毒。我國(guó)對(duì)果樹(shù)病毒病的研究起步較晚。植物病毒檢測(cè)試劑盒的研制很少，僅有煙草花葉病毒檢測(cè)試劑盒等幾種。國(guó)際馬鈴薯研究中心研制了馬鈴薯病毒檢測(cè)試劑盒，并已實(shí)際應(yīng)用。此試劑盒采用了血清學(xué)檢測(cè)法，可檢測(cè)PVY，PVX，PVS，PLRV等四種病毒。該試劑盒的出現(xiàn)對(duì)我國(guó)馬鈴薯病毒的發(fā)生情況研究起到了巨大的推動(dòng)作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，很多方法已應(yīng)用于果樹(shù)病毒檢測(cè)中，關(guān)于果樹(shù)病毒分子檢測(cè)試劑盒的研究卻沒(méi)有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明的內(nèi)容為；梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，其特征在于包括梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列<210>1所示。
蘋(píng)果莖溝病毒探針序列如序列表中的序列<210>2所示。
梨脈黃病毒探針序列如序列表中的序列<210>3所示。
上述探針的量為0.005-0.03mg/mL DNA；
1#液，預(yù)雜交液，含有50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL，2#液，雜交液，含有50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探針的預(yù)雜交液20mL，3#液；清洗液I#，含有0.1％十二烷基硫酸鈉的2×SSC，40mL，4#液；清洗液II#，含有0.1％十二烷基硫酸鈉的0.1×SSC，40mL，5#液；緩沖液I#，含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，150mmol/L氯化鈉，100mL，6#液；緩沖液II#，含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，150mmol/L氯化鈉，3％(w/v)牛血清白蛋白40mL，7#液；抗體液，含有抗地高辛抗體結(jié)合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液；緩沖液III#，含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，100mmol/L氯化鈉，50mmol/L氯化鎂，40mL，9#液；含有氯化氮藍(lán)四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17.5mg/mL，0.2mL，10#液；顯色液病毒陽(yáng)性對(duì)照(CK+)，0.010mL，11#液；病毒陰性對(duì)照(CK-)，0.010mL，雜交膜(4cm×10cm)1張，雜交管(5mL)10支。
上述的三種病毒的雜交檢測(cè)試劑盒，提供了10次的檢測(cè)量。
梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法及步驟如下A.點(diǎn)樣預(yù)先將膜剪成1cm×4cm小條，用鉛筆在膜上作好標(biāo)記，以便區(qū)分，最多可每0.5cm點(diǎn)一個(gè)樣(共7個(gè)樣)。將提取的樣品RNA及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別取0.001mL點(diǎn)到膜上，B.固定用80℃，60分鐘或120℃，30分鐘固定樣品，C.預(yù)雜交將固定好的膜放入一個(gè)5mL雜交管中，加入2mL1#液，42℃預(yù)雜交20分鐘，D.探針處理2#液于沸水浴中變性10分鐘，迅速移至冰上5分鐘，E.雜交雜交管中加入2mL2#液，42℃輕搖1.5小時(shí)，F(xiàn).洗膜用2mL3#室溫洗膜2次，每次5分鐘；再用2mL4#液42℃下洗膜2次，每次5分鐘，G.封閉用2mL5#液洗膜1分鐘，棄去，加適量2mL6#液輕搖封閉20分鐘。
H.結(jié)合抗體棄6#液，重新加入2mL 6#液(其中加入0.0004mL 7#液)，輕搖30分鐘，I.顯色將膜移入新管中，用3mL5#液洗滌兩次，每次10分鐘，再用2mL8#液浸泡2分鐘倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.02mL9#液)后，將容器放入一個(gè)封閉的盒內(nèi)，黑暗中靜置顯色1小時(shí)，J.終止反應(yīng)待顯色適當(dāng)時(shí)，倒出顯色液，加入2mL5#液浸泡5分鐘終止反應(yīng)，(3)結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。
上述方法所用的探針序列如下梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>2)所示。
蘋(píng)果莖溝病毒探針序列如序列表中的序列(<210>3)所示。
上述探針的量為；0.005-0.03mg/mL DNA。
梨樹(shù)病毒的雜交檢測(cè)方法，待測(cè)樣品或?yàn)槔鏄?shù)組織，或?yàn)槔鏄?shù)組織RNA。
梨樹(shù)病毒應(yīng)在點(diǎn)樣位置顯現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。
上述方法所用的試劑，其中去離子甲酰胺、磷酸鈉、鮭精DNA、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、牛血清白蛋白、氯化鎂2、氯化氮藍(lán)四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸由華美生物工程公司提供。抗地高辛抗體結(jié)合蛋白、地高辛-11-脫氧尿苷三磷酸為ROCH公司產(chǎn)品。梨環(huán)紋花葉、蘋(píng)果莖溝、梨脈黃三種病毒的DNA探針根據(jù)石河子大學(xué)提供的引物序列并在石河子大學(xué)標(biāo)記了地高辛-11-脫氧尿苷三磷酸。梨環(huán)紋花葉、蘋(píng)果莖溝、梨脈黃三種病毒的陽(yáng)性對(duì)照(CK+)和陰性對(duì)照(CK-)由石河子大學(xué)提供。
上述方法所用的儀器設(shè)備包括雜交爐、恒溫箱、冰箱、微量進(jìn)樣器等。
本發(fā)明利用cDNA雜交檢測(cè)試劑盒檢測(cè)梨樹(shù)上3種潛隱病毒梨環(huán)紋花葉、蘋(píng)果莖溝、梨脈黃。相對(duì)于指示植物法和血清學(xué)檢測(cè)法，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。可高效地應(yīng)用于梨病毒種類(lèi)及分布情況的調(diào)查研究及無(wú)病毒規(guī)范化生產(chǎn)。


附圖1為本發(fā)明梨脈黃病毒樣品檢測(cè)結(jié)果影像。
附圖2為本發(fā)明梨環(huán)紋花葉病毒樣品檢測(cè)結(jié)果影像。
附圖3為本發(fā)明蘋(píng)果莖溝病毒樣品檢測(cè)結(jié)果影像。
圖示中1-10內(nèi)檢測(cè)樣品，CK-為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1梨樹(shù)上的梨環(huán)紋花葉病毒的雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體包括如下；梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
上述探針的量為；0.005-0.03mg/mL DNA。
1#液；預(yù)雜交液，含有50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL。
2#液；雜交液，含有，50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探針的預(yù)雜交液20mL，3#液；清洗液I#，含有0.1％十二烷基硫酸鈉的2×SSC，40mL，4#液；清洗液II#，含有0.1％十二烷基硫酸鈉的0.1×SSC，40mL5#液；緩沖液I#，含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，150mmol/L氯化鈉，100mL，6#液；緩沖液II#，含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，150mmol/L氯化鈉，3％(w/v)牛血清白蛋白，40mL，7#液；抗體液，含有抗地高辛抗體結(jié)合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液；含有緩沖液III#，100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，100mmol/L氯化鈉，50mmol/L氯化鎂，40mL，9#液；含有氯化氮藍(lán)四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17.5mg/mL，0.2mL，10#液；顯色液病毒陽(yáng)性對(duì)照(CK+)，0.010mL，11#液；病毒陰性對(duì)照(CK-)，0.010mL，雜交膜(4cm×10cm)1張，雜交管(5mL)10支。
梨樹(shù)的梨環(huán)紋花葉病毒病毒的雜交檢測(cè)方法及步驟如下A.點(diǎn)樣預(yù)先將膜剪成1cm×4cm小條，用鉛筆在膜上作好標(biāo)記，以便區(qū)分，最多可每0.5cm點(diǎn)一個(gè)樣(共7個(gè)樣)。將提取的樣品RNA及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別取0.001mL點(diǎn)到膜上，B.固定用80℃，60分鐘或120℃，30分鐘固定樣品。
C.預(yù)雜交將固定好的膜放入一個(gè)5mL雜交管中，加入2mL1#液，420℃預(yù)雜交20分鐘，D.探針處理2#液于沸水浴中變性10分鐘，迅速移至冰上5分鐘，E.雜交雜交管中加入2mL2#液，42℃輕搖1.5小時(shí)，F(xiàn).洗膜用2mL3#室溫洗膜2次，每次5分鐘；再用2mL4#液42℃下洗膜2次，每次5分鐘，G.封閉用2mL5#液洗膜1分鐘，棄去，加適量2mL6#液輕搖封閉20分鐘，H.結(jié)合抗體棄6#液，重新加入2mL 6#液(其中加入0.0004mL 7#液)，輕搖30分鐘，I.顯色將膜移入新管中，用3mL5#液洗滌兩次，每次10分鐘，再用2mL8#液浸泡2分鐘倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.020mL9#液)后，將容器放入一個(gè)封閉的盒內(nèi)，黑暗中靜置顯色1小，J.終止反應(yīng)待顯色適當(dāng)時(shí)，倒出顯色液，加入2mL5#液浸泡5分鐘終止反應(yīng)。
(3)結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)籃紫色斑點(diǎn)。
梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。
實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于用于梨樹(shù)蘋(píng)果莖溝病毒探針序列如序列表中的序列(<210>2)所示。
上述探針的量為；0.005-0.03mg/mL DNA。
結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)籃紫色斑點(diǎn)。
實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于用于梨脈黃病毒探針序列如序列表中的序列(<210>3)所示。
上述探針的量為；0.005-0.03mg/mL DNA。
結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。
序列表<110>石河子大學(xué)<120>梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<160>9<210>1<211>629<212>DNA<213>梨環(huán)紋花葉病毒(pear ring pattern mosaic virus)<400>1tggaacagac actggatgcc atcttcgcga acatagcgat acaagggacg tcggagcaga 60cggaattcct ggatctagtg gtggaggtga aatcaatgga ggaccagaag gtaatcgggt 120cctacaattt gaaggaggtg gtcaacatga tcaaagcttt caaaactacc tcttcggatc 180cgaacatcag caacatgact ttccgccagg tgtgtgaggc tttcgcaccg gaggcaagaa 240acgggttggt caagctgaag tataaagggg ttttcactaa cctctttacg accatgccgg 300aagtaggtag caaatacccg gagctgatgt ttgatttcaa taagggtctt aacatgttta 360tcatgaataa ggcccagcaa aaagtcataa ctaatatgaa ccggcgtctt ttacaaactg 420aatttgcaaa aagtgagaat gaggcaaagc tctcatctgt tacgactgat ctttgcattt 480agtttgttta agaagtttgg tttaataaat aaaataaata gatagtgtgt tgtgtgttta 540atatttgcgt gaatatatgt ttgcatttaa tggacgaact cttgaaccca tgaaagagta 600taaagagtca tggtatttaa ttggagtgt 629<210>2<211>256<212>DNA<213>蘋(píng)果莖溝病毒(apple stem grooving virus)<400>2taggcagaac tctttgaacg aatgtacgtt cagaaagctt tgtgagcctt ttgctgactt 60ggctcgcgaa tttcttcatg agaggtggtc cagaggattg gccaccaaca tttataagaa 120atggcccaaa gcttttgaaa aaagcccatg ggtggcgttt gactttgcca ccggtctgaa 180aatgaatcgt ttaacacctg atgaaaaaca ggtgattgat agaatgacaa aaaggctttt 240tcgtactgaa ggacaa 256<210>3<211>346
<212>DNA<213>梨脈黃病毒(pear vein yellows virus)<400>3tggaacctca tgctgcaaac tcagagtcct cccgccaact gggttggaaa ggaattcaaa 60ttcgaaacca ggtatgccgc ctttgacttc ttctttggag ttgagagctc tgcatcgctg 120gaaccagctg atggcctcat tcgattgcca acccaggctg aacgagttgc caacgcaacg 180agcaaagaaa tccaaatgta ccggattcga tccatggagg gaactcaggc cgttaatttt 240ggtgaggtta cggggggcaa agtgggccct aagccagtgc tgtccattag gaagtaattg 300atcttaaatc ccataaacca acaagtattt atgcttttta gtaaag346<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4acactccaat taaataccat gactct26<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tggaacagac actggatgcc20<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ttgtccttca gtacgaaaaa gcctt 25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7taggcagaac tctttgaacg aatgt 25<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctttactaaa aagcataaat acttgttggt 30<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9tggaacctca tgctgcaaac tc 2權(quán)利要求
1.一種梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>1)所示。蘋(píng)果莖溝病毒探針序列如序列表中的序列(<210>2)所示。梨脈黃病毒探針序列如序列表中的序列(<210>3)所示。上述探針的用量為；0.005-0.03mg/mL DNA，1#液，預(yù)雜交液；含有50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL，2#液，雜交液；含有，50％去離子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸鈉，5×SSC，20mmol/L磷酸鈉，0.5mg/mL鮭精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探針的預(yù)雜交液20mL，3#液，清洗液I#；；含有0.1％十二烷基硫酸鈉的2× SSC，40mL，4#液，清洗液II；含有0.1％十二烷基硫酸鈉的0.1×SSC，40mL，5#液，緩沖液I#；含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，150mmol/L氯化鈉，100mL，6#液，緩沖液II#；含有100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，150mmol/L氯化鈉，3％(w/v)牛血清白蛋白，40mL，7#液，抗體液；含有抗地高辛抗體結(jié)合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液，含有緩沖液III#；100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，100mmol/L氯化鈉，50mmol/L氯化鎂，40mL，9#液，含有氯化氮藍(lán)四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17 5mg/mL，02mL，10#液，顯色液病毒陽(yáng)性對(duì)照(CK+)，0.010mL，11#液，病毒陰性對(duì)照(CK-)，0.010mL，雜交膜(4cm×10cm)1張，雜交管(5mL)10支。
2.梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)方法，其特征在于雜交檢測(cè)方法及步驟如下A.點(diǎn)樣預(yù)先將膜剪成1cm×4cm小條，用鉛筆在膜上作好標(biāo)記，以便區(qū)分，最多可每0.5cm點(diǎn)一個(gè)樣(共7個(gè)樣)。將提取的樣品RNA及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別取0.001mL點(diǎn)到膜上，B.固定用80℃，60分鐘或120℃，30分鐘固定樣品，C.預(yù)雜交將固定好的膜放入一個(gè)5mL雜交管中，加入2mL1#液，42℃預(yù)雜交20分鐘，D.探針處理2#液于沸水浴中變性10分鐘，迅速移至冰上5分鐘，E.雜交雜交管中加入2mL2#液，42℃輕搖1.5小時(shí)，F(xiàn).洗膜用2mL3#室溫洗膜2次，每次5分鐘；再用2mLA#液42℃下洗膜2次，每次5分鐘，G.封閉用2mL5#液洗膜1分鐘，棄去，加適量2mL6#液輕搖封閉20分鐘，H.結(jié)合抗體棄6#液，重新加入2mL6#液(其中加入0.0004mL7#液)，輕搖30分鐘，I.顯色將膜移入新管中，用3mL5#液洗滌兩次，每次10分鐘，再用2mL8#液浸泡2分鐘倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.020mL9#液)后，將容器放入一個(gè)封閉的盒內(nèi)，黑暗中靜置顯色1小時(shí)，J.終止反應(yīng)待顯色適當(dāng)時(shí)，倒出顯色液，加入2mL5#液浸泡5分鐘終止反應(yīng)。(3)結(jié)果觀察與記錄病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)藍(lán)紫色班點(diǎn)。所用的探針序列如下梨環(huán)紋花葉病毒探針序列如序列表中的序列(<210>1)所示。蘋(píng)果莖溝病毒探針序列如序列表中的序列(<210>2)所示。梨脈黃病毒探針序列如序列表中的序列(<210>3)所示。上述探針的量為；0.005-0.03mg/mL DNA。
3.如權(quán)利要求2所說(shuō)的梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)樣品或?yàn)槔鏄?shù)組織總核酸，或?yàn)槔鏄?shù)組織RNA。
4.如權(quán)利要求2或3所說(shuō)的梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)方法，其特征在于梨樹(shù)病毒在點(diǎn)樣部位顯現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種梨樹(shù)病毒雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。用于檢測(cè)梨樹(shù)上梨環(huán)紋花葉、蘋(píng)果莖溝、梨脈黃的三種病毒，該試劑盒包括預(yù)雜交液、雜交液、洗滌溶液Ⅰ、洗滌溶液Ⅱ、緩沖溶液Ⅰ、緩沖溶液Ⅱ、抗體液、緩沖溶液Ⅲ、引物序列、探針序列。該試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，針對(duì)該試劑盒所提供的雜交檢測(cè)方法，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷、成本較低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)?？筛咝У貞?yīng)用于梨病毒種類(lèi)及分布情況的調(diào)查研究及無(wú)病毒規(guī)范化。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1841067SQ20051006530
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日
發(fā)明者牛建新, 馬兵鋼 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)