專利名稱：檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在血液(包括全血、血漿及血清)中對(duì)幽門螺桿菌(H.pylori)抗原及其抗原片段的發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)于血液中的幽門螺桿菌抗原包括但不限于幽門螺桿菌DNA、RNA或其片段、或者幽門螺桿菌蛋白/肽或其其它抗原組分。幽門螺桿菌DNA或其片段由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、DNA雜交、分支DNA信號(hào)放大檢測(cè)或其它信號(hào)放大方法進(jìn)行檢測(cè)。其幽門螺桿菌RNA由PCR、雜交或其它信號(hào)放大檢測(cè)方法檢測(cè)。幽門螺桿菌蛋白或肽或其其它抗原組分由免疫檢測(cè)或免疫印跡實(shí)驗(yàn)用對(duì)幽門螺桿菌的親和純化抗體來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明還涉及通過(guò)檢測(cè)血液中的幽門螺桿菌抗原來(lái)診斷幽門螺桿菌感染。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(H.pylori)是革蘭氏陰性細(xì)菌，其侵染胃粘膜并且是多數(shù)消化性潰瘍病(PUD)的誘因。至今為止，潰瘍及其它形式的消化不良被認(rèn)為與應(yīng)激反應(yīng)水平或飲食習(xí)慣有關(guān)。最近，醫(yī)學(xué)界已確認(rèn)幽門螺桿菌是某些形式的胃疾病包括潰瘍和胃癌的誘發(fā)劑。根除幽門螺桿菌促進(jìn)了潰瘍的愈合并大大降低了癌癥和PUD的發(fā)病率。
幽門螺桿菌引起大部分胃和十二指腸潰瘍以及消化性潰瘍病(PUD)。幽門螺桿菌和PUD的聯(lián)系最先由澳大利亞醫(yī)生Warren和Marshall于1984年發(fā)現(xiàn)(Lancet I1311-1344)?，F(xiàn)在，幽門螺桿菌感染被看作是胃炎的最常見(jiàn)病因，且從病因?qū)W角度講，其與胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌和原發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤有關(guān)。
現(xiàn)已證實(shí)，PUD是可治愈的，且相當(dāng)容易。多數(shù)PUD的病因是幽門螺桿菌感染。但是，幽門螺桿菌感染不能常規(guī)診斷，這可能是因?yàn)闄z測(cè)幽門螺桿菌的方法(即侵入性活組織檢查)不能使醫(yī)生特別是主治醫(yī)師滿意。因此，主治醫(yī)師傾向于用抗分泌劑來(lái)治療病發(fā)的患者。
醫(yī)生需要一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且廉價(jià)的診斷幽門螺桿菌感染的方法，以便使他們知道何時(shí)治療病人以及何時(shí)將病人引見(jiàn)給胃腸病學(xué)家。但是，目前的幽門螺桿菌檢測(cè)，可以歸類為侵入性檢查和非侵入性檢查，它們都不能令人十分滿意。
侵入性檢查需要先使用內(nèi)窺鏡然后進(jìn)行活組織檢查。對(duì)由活組織檢查方法獲得的組織樣本，再通過(guò)培養(yǎng)、組織學(xué)或快速尿素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。
雖然對(duì)活組織檢查樣本的培養(yǎng)為幽門螺桿菌檢驗(yàn)提供了最可靠的結(jié)果，但是在較好的實(shí)驗(yàn)室中報(bào)告的成功率僅在70％至80％之間(Han，S.W.等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.(1995)，14349-352)。對(duì)特殊染色的活組織檢查樣本的檢查可以為急性或慢性炎性粘膜細(xì)胞和損傷提供直接的證據(jù)。但是，這需要內(nèi)窺鏡醫(yī)生和病理醫(yī)生的合作(Genta，R.M.等，Hum.Pathol.(1994)，25221-226)?？焖匐迕笝z驗(yàn)檢測(cè)由幽門螺桿菌脲酶產(chǎn)生的氨引起的pH升高，該脲酶將脲分解為氨和二氧化碳。但是，其需要高密度的細(xì)菌，且降低該細(xì)菌量的任何事件都會(huì)造成假陰性結(jié)果(Cutler，A.F，Am.J.Med.(1996)，10035S-39S)。
自1990年以來(lái)，已開發(fā)了一些非侵入性檢驗(yàn)方法來(lái)檢查幽門螺桿菌感染的存在。例如，尿素呼吸實(shí)驗(yàn)是基于此生物體的脲酶活性，該脲酶將用13C或14C標(biāo)記的脲分解為非放射性13CO2或放射性14CO2。此脲呼吸實(shí)驗(yàn)被廣泛推薦用來(lái)證實(shí)在治療4周后對(duì)幽門螺桿菌的根除。
美國(guó)專利5,716,791、5,871,942和5,932,430公開了用多克隆抗體檢測(cè)糞便樣本中幽門螺桿菌抗原的免疫檢測(cè)方法，其中多克隆抗體得自用幽門螺桿菌細(xì)胞(即ATCC株43504)致敏的動(dòng)物。此抗體通過(guò)DEAE(二乙基氨基乙基纖維素)柱純化。雖然此糞便抗原檢驗(yàn)據(jù)報(bào)告是令人滿意的，但是發(fā)現(xiàn)糞便樣本的收集和處理是困難且令人不快的。很多患者不愿意給醫(yī)生提供糞便樣本，是由于令人不快的氣味和缺乏方便的收集器具。
用ELISA對(duì)血清幽門螺桿菌抗體進(jìn)行血清檢驗(yàn)是另一種廣泛使用的實(shí)驗(yàn)。最新技術(shù)的實(shí)例見(jiàn)美國(guó)專利5262156和EP0329570。已鑒定了幾種主要的抗原并用于檢查幽門螺桿菌抗體的免疫檢測(cè)方法中。但是，這些檢測(cè)方法不具血清診斷要求的特異性和靈敏性(Newell，D.G.等，Serodian.Immunother.Infec.Dis.，(1989)，31-6)。問(wèn)題之一是由交叉反應(yīng)造成的。這是由于幽門螺桿菌中的顯性抗原(例如，分子量為60Da的假設(shè)的鞭毛蛋白)對(duì)幽門螺桿菌來(lái)說(shuō)不是特異性的。一些這樣的抗原發(fā)現(xiàn)于其它細(xì)菌如C.jeuni和C.coli。在設(shè)計(jì)幽門螺桿菌免疫檢測(cè)中遇到的第二個(gè)問(wèn)題是株變異。在幽門螺桿菌的不同株中已觀察到了抗原的實(shí)質(zhì)不同。這些問(wèn)題妨礙了用單一抗原設(shè)計(jì)檢測(cè)方法。對(duì)幽門螺桿菌抗體檢測(cè)的特異性和靈敏性已進(jìn)行了改進(jìn)，即使用得自不同幽門螺桿菌株的抗原混合物，該混合物富含某些抗原片段。一種檢測(cè)血清中幽門螺桿菌抗體的ELISA試劑已市售。此檢測(cè)使用細(xì)菌的全細(xì)胞裂解物作為抗原。
使用以抗原檢測(cè)血清中幽門螺桿菌抗體存在的ELISA還有其它缺點(diǎn)。具體地講，在感染已經(jīng)治療后的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(一些情況中長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月)人血清中此抗體滴度仍保持高水平。于是，用此ELISA得到的陽(yáng)性結(jié)果并不一定說(shuō)明該患者目前被感染并需要對(duì)幽門螺桿菌感染進(jìn)行治療。當(dāng)面對(duì)陽(yáng)性ELISA時(shí)，在開始抗生素治療前，治療醫(yī)生常要求胃活組織檢查以證實(shí)該細(xì)菌的存在。因此，基于抗原的ELISA不能排除對(duì)侵入性方法的需要。
因此，本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)對(duì)幽門螺桿菌感染的非侵入性的和高準(zhǔn)確度的診斷方法。在研究期間，發(fā)現(xiàn)了血液中的幽門螺桿菌抗原，它們是以DNA或其片段，或蛋白/肽或其其它抗原組分的形式存在于血液(包括全血、血漿和血清)中。因此，設(shè)計(jì)了檢測(cè)這些幽門螺桿菌抗原的特殊方法，以提供幽門螺桿菌抗原片段存在于血液中的證據(jù)。這些方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和DNA雜交，用得自幽門螺桿菌菌株的、對(duì)幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來(lái)檢測(cè)幽門螺桿菌的核酸片段。此外，還開發(fā)了免疫檢測(cè)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，用針對(duì)幽門螺桿菌的親和純化抗體來(lái)檢測(cè)幽門螺桿菌的蛋白/肽或任何抗原組分。
目前，尚沒(méi)有關(guān)于血液中存在幽門螺桿菌抗原的報(bào)道。本發(fā)明第一個(gè)證明了幽門螺桿菌抗原不僅存在于血液中，并且還可以通過(guò)下面部分給出的方法檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了存在于患者血液中的幽門螺桿菌抗原，并可以提供聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、DNA雜交、RNA雜交、分支DNA檢測(cè)、免疫印跡及免疫檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)血液中的幽門螺桿菌抗原來(lái)診斷幽門螺桿菌感染的方法。
根據(jù)本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是用得自幽門螺桿菌菌株的、對(duì)幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來(lái)檢測(cè)幽門螺桿菌的核酸片段。例如，可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)及雜交(優(yōu)選點(diǎn)狀DNA雜交)方法或其它擴(kuò)增方法檢測(cè)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”廣義地包括了在適當(dāng)條件下能直接或間接引起特異性免疫反應(yīng)且與該反應(yīng)的產(chǎn)物反應(yīng)(即與特異性抗體或特異性致敏的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，或二者兼而有之)的任何物質(zhì)。這些物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于蛋白/肽、多糖、脂類和多或寡核苷酸。
在血液中可以檢測(cè)的幽門螺桿菌抗原具有特定的兩種類型。第一類涉及多核苷酸或寡核苷酸，它們是幽門螺桿菌的染色體DNA、RNA或其片段。此類幽門螺桿菌可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)及雜交(優(yōu)選點(diǎn)狀DNA雜交)方法或其它擴(kuò)增方法檢測(cè)。
本發(fā)明的PCR方法需要使用特異性檢測(cè)幽門螺桿菌的一對(duì)引物。本文中術(shù)語(yǔ)“引物”指寡核苷酸，不論是天然的還是合成的，當(dāng)置于引起與核苷酸鏈互補(bǔ)的引物產(chǎn)物合成的條件下，即適當(dāng)溫度下在四個(gè)不同核苷酸三磷酸鹽和適當(dāng)?shù)拿复嬖谙拢淠茏鳛楹怂岷铣傻囊l(fā)點(diǎn)。本文中術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”定義為由兩個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選三個(gè)以上)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸組成的分子。其實(shí)際大小將依賴于多種因素，其依次依賴于該寡核苷酸的最終功能或用途。該寡核苷酸可以得自合成或克隆。
該引物的制備是根據(jù)在幽門螺桿菌菌株如ATCC株43504、43571、43629和49053的共有序列片段中發(fā)現(xiàn)的保守序列。優(yōu)選的引物范圍是長(zhǎng)15至25堿基對(duì)(bps)，最優(yōu)選的是約20bps。當(dāng)兩種引物(正向引物和反向引物)長(zhǎng)度相同并且同樣的核苷酸組分基本相同時(shí)，可以獲得較好的擴(kuò)增。優(yōu)選的用于PCR的血液樣本是血漿。
本發(fā)明提供的LCR方法需要使用一種DNA連接酶和對(duì)幽門螺桿菌特異性的兩套寡核苷酸。優(yōu)選的DNA連接酶是Pfu DNA連接酶，其是從Pyrococcus furiosus中分離的熱穩(wěn)定DNA連接酶，并可以商購(gòu)。LCR用的兩套寡核苷酸優(yōu)選比PCR的引物長(zhǎng)。如象PCR引物一樣，LCR寡核苷酸得自幽門螺桿菌菌株，如ATCC株43504、43571、43629和49053的共有序列片段中的保守序列。
LCR的完成，是通過(guò)含靶序列的DNA模板的熱變性的重復(fù)循環(huán)，以獨(dú)特的方式將第一套針對(duì)靶DNA序列的兩個(gè)相鄰的寡核苷酸探針退火，而第二套互補(bǔ)寡核苷酸探針和與靶DNA序列相反的序列進(jìn)行雜交。本文中術(shù)語(yǔ)“靶序列”指發(fā)現(xiàn)于血樣中的“染色體DNA或其片段”。此后，DNA連接酶可以共價(jià)連接每對(duì)相鄰的探針，只要這兩個(gè)相鄰探針在連接上完全互補(bǔ)。
雜交方法需要制備幽門螺桿菌DNA探針。此幽門螺桿菌DNA探針通過(guò)從幽門螺桿菌核酸瓊脂糖凝膠電泳后萃取物中切割并萃取DNA片段來(lái)制備。此探針一般具有至少約25個(gè)堿基，通常至少有約30個(gè)堿基，并可以多達(dá)約10000個(gè)堿基或更多，通常不超過(guò)約5000個(gè)堿基。然后，將此DNA片段用限制酶消化，并與宿主連接以形成重組質(zhì)粒構(gòu)建，其可以轉(zhuǎn)染真核和原核宿主細(xì)胞。在這些宿主細(xì)胞中此DNA片段可以增殖并再分離。然后，可以將增殖后的DNA片段用放射性同位素(如32P、3H、14C等等)標(biāo)記或熒光物質(zhì)標(biāo)記(如用地高辛配基及生物素標(biāo)記DNA探針與熒光檢測(cè)方法結(jié)合)并用作DNA探針。
此雜交方法通過(guò)用變性試劑處理血液，優(yōu)選是血清，的核酸樣本，以使存在于固相載體如硝酸纖維素濾膜的DNA變性而進(jìn)行。優(yōu)選的變性試劑包括但不限于堿性溶液、有機(jī)試劑(例如，醇、酰胺、胺、脲、苯酚及亞砜)或某些無(wú)機(jī)離子(例如，硫氰酸根和高氯酸根)或通過(guò)升溫來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后，將標(biāo)記的DNA探針加入到變性的DNA點(diǎn)狀膜中。然后，檢測(cè)該膜中存在的DNA雜交體的標(biāo)記特性。如果該標(biāo)記是放射性的，該膜可以用于X-射線膠片，如果標(biāo)記是熒光性的，該膜可以用熒光顯微鏡直接觀察。
第二類抗原涉及血液中的幽門螺桿菌蛋白和/或肽，或含抗原表位的任何物質(zhì)，其可以通過(guò)免疫印跡或免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)，優(yōu)選使用抗幽門螺桿菌抗原的親和純化的抗體。一級(jí)或二級(jí)抗體都可能是檢測(cè)或測(cè)定血液中幽門螺桿菌抗原所需要的，這依賴于檢測(cè)中所用方法的種類。一級(jí)抗體是針對(duì)抗原(在該情況下是幽門螺桿菌抗原)產(chǎn)生的抗體。二級(jí)抗體是針對(duì)一級(jí)抗體的免疫球蛋白產(chǎn)生的種屬抗體(如羊抗-兔IgG)。優(yōu)選用于檢測(cè)的血樣是血清。
免疫印跡法通過(guò)先用SDS-PAGE分析血樣。電泳后，將蛋白質(zhì)/肽帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后將其與足量的幽門螺桿菌抗體孵育。產(chǎn)生抗幽門螺桿菌的、針對(duì)動(dòng)物種屬的免疫球蛋白的一種酶標(biāo)二級(jí)抗體可以加入到硝酸纖維素膜上。此方法優(yōu)選的酶是堿性磷酸酶，其中該反應(yīng)可以通過(guò)加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯檢測(cè)。用于此方法中的另一個(gè)優(yōu)選的酶標(biāo)記物是辣根過(guò)氧化物酶，其可以通過(guò)加入4-氯-1-萘酚或3，3′-二氨基聯(lián)苯胺以產(chǎn)生有色的、不溶的產(chǎn)物以便于觀察檢測(cè)。
免疫檢定方法包括但不限于基礎(chǔ)夾心檢定(basic sandwich assay)、三聯(lián)夾心檢定(triple sandwich assay)和免疫色譜檢定。
在基礎(chǔ)夾心檢定中，需要兩個(gè)一級(jí)抗體，其中一個(gè)與固體載體結(jié)合而另一個(gè)用檢測(cè)試劑標(biāo)記。該三聯(lián)夾心檢定需要聯(lián)合使用兩個(gè)抗幽門螺桿菌的一級(jí)抗體(即，第一抗體和第二抗體)和一個(gè)抗動(dòng)物種屬IgG的二級(jí)抗體，此二級(jí)抗體用檢測(cè)試劑標(biāo)記。所述一級(jí)抗體中只有一個(gè)需要結(jié)合至固體載體上，該動(dòng)物種屬產(chǎn)生未結(jié)合的一級(jí)抗體，最終形成抗抗體-抗原-抗體復(fù)合物的復(fù)合物。
夾心檢定的固體載體可以是塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等。檢測(cè)試劑可以是酶標(biāo)記物(如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)、熒光或發(fā)光試劑(如熒光黃，羅明丹，或銪，魯米諾或吖啶顏料(acridium))、放射性同位素標(biāo)記(如I125)，或者有色顆粒(如金、銀、藍(lán)色乳液或硒)。
基礎(chǔ)夾心和三聯(lián)夾心免疫檢定都需要第一個(gè)一級(jí)抗體與幽門螺桿菌的相互作用以形成抗原-抗體復(fù)合物，然后用第二個(gè)抗幽門螺桿菌的抗體與此抗原-抗體復(fù)合物接觸。
此免疫色譜實(shí)驗(yàn)也需要聯(lián)合使用兩個(gè)抗幽門螺桿菌的一級(jí)抗體。與基礎(chǔ)和三聯(lián)夾心檢定相比，第一個(gè)抗體(即第一個(gè)與生物樣本接觸的抗體)用有色顆粒標(biāo)記，第二個(gè)抗體結(jié)合固體載體如硝酸纖維素(硝酸纖維素衍生物)膜、尼龍膜、聚酯膜、過(guò)濾紙、瓊脂糖或交聯(lián)葡萄糖凝膠。用于此免疫色譜檢定的優(yōu)選的固體載體是硝酸纖維素膜。選擇性地，在樣本加入點(diǎn)反方向的色譜帶的末端附近，可將產(chǎn)生第一抗體的抗動(dòng)物種屬的二級(jí)抗體加入和/或結(jié)合至此固體載體上。此二級(jí)抗體用作在色譜進(jìn)行的末端捕獲未結(jié)合的有色顆粒作為對(duì)照。因此，如果此樣本不含有幽門螺桿菌抗原，有色顆粒標(biāo)記的第一種抗體將走過(guò)第二種抗體而不結(jié)合，因?yàn)闆](méi)有抗體-抗原-抗體復(fù)合物形成。但是，因?yàn)槎?jí)抗體是抗產(chǎn)生第一種抗體的動(dòng)物的IgG的，當(dāng)?shù)谝豢贵w走過(guò)時(shí)其將結(jié)合該第一種抗體，不論此第一種抗體是否已與樣本形成復(fù)合物。第一種抗體和二級(jí)抗體的結(jié)合表明色譜進(jìn)行到了終點(diǎn)。
與血清樣本有關(guān)的問(wèn)題之一是感染幽門螺桿菌的患者經(jīng)常在血清中帶有其自身的幽門螺桿菌抗體。這些血清幽門螺桿菌抗體可以與血清幽門螺桿菌抗原形成免疫復(fù)合物，這會(huì)對(duì)本發(fā)明的免疫檢定的準(zhǔn)確性造成影響。解離此幽門螺桿菌免疫復(fù)合物的方法，包括但不限于，用解離試劑解離此復(fù)合物，或在樣本解離條件下進(jìn)行檢定。
該解離試劑的實(shí)例，包括但不限于，高濃度鹽(例如，至少1M的氯化鈉或氯化鉀)、洗滌劑(如，至少1％的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、吐溫20、辛基葡糖苷、脫氧膽酸鹽或Triton X-100)、離液劑(例如，鹽酸胍、脲或KSCN)、有機(jī)溶劑(例如，二惡烷或乙二醇)、酶(例如，蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶，V8蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶)或脂酶(例如，得自牛奶的脂蛋白脂酶，及得自皺摺假絲酵母的脂酶)。樣本解離條件的實(shí)例包括但不限于高pH(例如，pH≥9)或低pH(例如，pH≤3)，以及/或升高溫度(例如，至少50℃)。
雖然已報(bào)告了一些嘗試，它們?yōu)楦腥居拈T螺桿菌的患者提供了定量及定性的檢測(cè)，但是沒(méi)有一個(gè)是直接檢測(cè)血樣中的幽門螺桿菌。其主要原因是還沒(méi)有研究人員假定幽門螺桿菌抗原可以發(fā)現(xiàn)于血流中。
但是，在表(即，表1-3)中，如后面的實(shí)施例9(表1)及11(表2和3)所示的種種證據(jù)將表明在幽門螺桿菌感染患者的血清樣本中可以并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌抗原。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的是利用血液中可檢測(cè)的幽門螺桿菌抗原作為診斷幽門螺桿菌感染的工具。該診斷方法可以用來(lái)檢測(cè)不同類型的幽門螺桿菌抗原，其包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、分支DNA擴(kuò)增檢定、雜交檢定、免疫印跡、免疫沉淀、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、免疫電泳及免疫檢定(例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)及免疫色譜)。
PCR是高效率擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。用聚合酶，例如熱穩(wěn)定酶Taq聚合酶變性的重復(fù)、引物退火和延伸，導(dǎo)致所需DNA序列的指數(shù)級(jí)增加。每種DNA序列可以用瓊脂糖凝膠電泳分離，并接著進(jìn)行核苷酸測(cè)序。PCR用血樣優(yōu)選的類型是血漿，這是因?yàn)槿绻l(fā)生溶血，得自紅細(xì)胞血紅蛋白的血紅素分子可能干擾PCR擴(kuò)增。
連接酶鏈反應(yīng)(LCR)是一種DNA擴(kuò)增技術(shù)，其可以用于檢測(cè)已知核苷酸序列的痕量水平。LCR包括循環(huán)的兩步反應(yīng)(1)高溫解鏈步驟，其中雙鏈靶DNA解鏈變?yōu)閱捂?，?2)冷卻步驟，其中兩套相鄰的、互補(bǔ)寡核苷酸退火為單鏈靶分子并與DNA連接酶連接在一起。從第一個(gè)循環(huán)中連接的產(chǎn)物作為下一循環(huán)的連接反應(yīng)的模板，LCR導(dǎo)致連接產(chǎn)物的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，其方式類似于PCR反應(yīng)中模板的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。
PCR和LCR都需要發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌特異性引物或寡核苷酸以引發(fā)此核苷酸鏈反應(yīng)。因?yàn)樵诨蛩接拈T螺桿菌菌株是高度多樣性的(Fujimoto等，J.Clin.Microbiol.，(1994)，32331-334)，而個(gè)體可以被一種以上菌株感染，因此，根據(jù)在多種幽門螺桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)的共有序列片段的保守序列設(shè)計(jì)引物或寡核苷酸，這是一種解決問(wèn)題的手段。
已發(fā)現(xiàn)得自ATCC菌株43504的幽門螺桿菌細(xì)胞特別有利于制備抗糞便中幽門螺桿菌的一級(jí)抗體(見(jiàn)美國(guó)專利5716791)。這是因?yàn)橛玫米跃?3504的細(xì)胞致敏產(chǎn)生的抗體可以跨地域和跨飲食組檢測(cè)此生物體。其它幽門螺桿菌菌株，如ATCC43571、43629、49053已顯示了相似的抗原性。因此，在這些菌株中尋找共有序列的片段是有價(jià)值的。這可以如下進(jìn)行通過(guò)用相同的限制酶(一種或多種)將得自上述幽門螺桿菌菌株的提取核酸消化，接著將消化了的幽門螺桿菌核酸片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。此共有序列片段可以切除并提取。可以分析共有序列片段的核苷酸序列。然后，可將此共有序列片段的保守序列用于設(shè)計(jì)PCR或LCR用引物或寡核苷酸。
除了PCR或LCR，可以用核酸雜交探針檢測(cè)血樣中幽門螺桿菌抗原的存在。優(yōu)選核酸雜交探針不超過(guò)約5000個(gè)堿基。此探針序列優(yōu)選至少基本上與幽門螺桿菌菌株間的共有序列片段的核苷酸序列互補(bǔ)。除了在多種幽門螺桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)的共有序列片段外，該探針可以得自信使RNA、cDNA，后者通過(guò)用逆轉(zhuǎn)錄酶將信使RNA逆轉(zhuǎn)錄或通過(guò)基因組裂解獲得。對(duì)所需探針進(jìn)行分離和定性后，探針的DNA片段可以在宿主細(xì)胞中克隆或增殖。然后，此增殖的探針可以用原子或無(wú)機(jī)基團(tuán)標(biāo)記，此標(biāo)記最常用放射性核素，但是也可以用重金屬或熒光物質(zhì)。使用可以特異性結(jié)合與幽門螺桿菌抗原的單鏈DNA雜交的探針的抗體，是可行的。在此實(shí)例中，該抗體被標(biāo)記以便檢測(cè)。用于探針的同樣類型的標(biāo)記物也可以按照已知技術(shù)與此抗體結(jié)合。
放射性標(biāo)記物如32P、3H、14C等可以用于標(biāo)記探針，雖然其它放射性標(biāo)記物也可以使用，只要它們能提供具有足夠半衰期的適宜的信號(hào)。其它標(biāo)記物包括配體，其可以作為標(biāo)記抗體熒光劑的特異結(jié)合單元、化學(xué)發(fā)光劑、酶、可以作為標(biāo)記配體特異結(jié)合對(duì)的抗體等。在免疫檢定中也可以使用多種標(biāo)記物。標(biāo)記物的選擇是由標(biāo)記物對(duì)雜交的速率及探針結(jié)合樣本DNA的影響決定的。需要該探針為檢測(cè)DNA雜交用量提供足夠的靈敏性。其它考慮包括探針的易于合成、易于機(jī)械操作、能自動(dòng)化、方便等。
該標(biāo)記物結(jié)合探針的方式隨該標(biāo)記物的本質(zhì)而變化。對(duì)于放射性標(biāo)記物，可以使用多種技術(shù)。常用的是用α-32P-dNTP進(jìn)行切口平移，或用堿性磷酸酶進(jìn)行末端磷酸水解，接著使用γ-32P-NTP和T4多核苷酸激酶進(jìn)行放射性32P標(biāo)記。或者，可以合成核苷酸，其中存在的一個(gè)或多個(gè)元素被放射性同位素替換，例如，用氚代替氫。
作為標(biāo)記物的有利的酶包括水解酶，特別是酯酶和糖苷酶或氧化還原酶，特別是過(guò)氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹胺及其衍生物、丹酰、7-羥基香豆素等。化學(xué)發(fā)光劑包括螢蟲素及2，3-二氫酞嗪二酮類，例如，魯米諾。
該雜交一般使用附于水不溶性多孔載體的針對(duì)DNA樣本的探針進(jìn)行。此DNA樣本被變性以使單鏈核酸被固定。對(duì)于裂解來(lái)說(shuō)，化學(xué)裂解是便于使用的，通常用稀堿溶液，例如，0.1至1M的氫氧化鈉。該堿還可以用來(lái)使DNA變性。其它變性試劑包括但不限于有機(jī)溶劑如醇、酰胺、胺、脲酶、苯酚和亞砜，或某些無(wú)機(jī)離子如硫氰酸根及高氯酸根，還可以通過(guò)升高溫度實(shí)現(xiàn)。
也可以通過(guò)免疫方法用抗幽門螺桿菌的親和純化抗體檢測(cè)血液幽門螺桿菌，該方法包括但不限于免疫印跡法及免疫檢定(如基礎(chǔ)夾心免疫檢定、三聯(lián)夾心免疫檢定及免疫色譜)。
免疫印跡法需經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將血樣分級(jí)分離，然后將分離后的蛋白/肽帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再將分離的蛋白/肽帶與抗幽門螺桿菌一級(jí)抗體作用以形成抗原-抗體復(fù)合物。然后，加入用檢測(cè)試劑標(biāo)記的抗一級(jí)抗體的二級(jí)抗體以顯示該檢測(cè)反應(yīng)。
基礎(chǔ)和三聯(lián)夾心免疫檢定都需要至少三個(gè)要素抗幽門螺桿菌抗原的第一種抗體，抗幽門螺桿菌抗原的第二種抗體及檢測(cè)樣品(即，血樣)。
第一和第二種抗體(即抗幽門螺桿菌抗原的)優(yōu)選是多克隆抗體。此抗體可以通過(guò)給兔或其它動(dòng)物如山羊或母牛注射幽門螺桿菌細(xì)胞獲得，優(yōu)選這些細(xì)胞通過(guò)超聲處理破裂，或通過(guò)其它細(xì)胞破裂手段破裂，以便暴露多個(gè)抗原位點(diǎn)。
總之，通過(guò)先注射，接著加強(qiáng)注射以使該反應(yīng)最大化來(lái)制備抗體。為了制備這些抗體，將抗原與輔劑例如弗氏佐劑混合以免疫動(dòng)物從而加強(qiáng)此免疫反應(yīng)。所注射抗原的量必須適于產(chǎn)生足量的可檢測(cè)抗體。多次注射可以以規(guī)律的周期進(jìn)行以使抗體的產(chǎn)生最佳。注射方案取決于所用動(dòng)物。給動(dòng)物放血，先通過(guò)檢測(cè)該血液抗體的產(chǎn)生量。用試驗(yàn)性放血和酶免疫測(cè)定(EIA)檢測(cè)抗體的產(chǎn)生。通過(guò)色譜，優(yōu)選親和柱色譜將抗體純化。
在基礎(chǔ)夾心檢定中，如果第一種抗體結(jié)合固體載體，第二種抗體必須用檢測(cè)試劑標(biāo)記，其可以是已知的免疫檢測(cè)法中的任何標(biāo)記物。例如，酶標(biāo)記物(如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶等)、熒光劑、發(fā)光試劑或放射性標(biāo)記物(如熒光黃，羅明丹，銪，魯米諾或吖啶顏料和放射性同位素如I125等)，或者膠體顆粒(如金和硒等)是可以用于此免疫檢定的標(biāo)記物。在這些標(biāo)記物中，最常用的是酶標(biāo)記物如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶。具體地講，通過(guò)HRP與二氨基聯(lián)苯胺、四甲基聯(lián)苯胺、4-氯-1-萘酚反應(yīng)，或通過(guò)其它類似的化學(xué)反應(yīng)，在比色測(cè)定中可以檢測(cè)HRP標(biāo)記物。此比色測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物可以在板式讀數(shù)器、掃描儀、光密度計(jì)中檢測(cè)或目測(cè)。通過(guò)比較樣本讀數(shù)和含已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)物的讀數(shù)，可以測(cè)定幽門螺桿菌的量。優(yōu)選幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物用于“含蓋”被測(cè)樣本中的標(biāo)記物的濃度。
放射性同位素如125I碘或β-發(fā)射體如14C碳是另一類常用標(biāo)記物，其可以通過(guò)γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)。熒光標(biāo)記物也可以用于標(biāo)記抗體，以便通過(guò)熒光分析測(cè)定。
固體載體可以是已知用于免疫檢定的任何固體載體。其可以是如ELISA中用的多孔板，其可以在板式讀數(shù)器中讀取數(shù)據(jù)?；蛘?，它可以是能對(duì)液體或溶解于固定相中的樣本進(jìn)行色譜分析的一種載體。這種載體的實(shí)例包括膜如硝酸纖維素或柱色譜的介質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
下列非限制性實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明對(duì)血液中幽門螺桿菌抗原的檢測(cè)。
實(shí)施例1制備幽門螺桿菌抗原和核酸室溫下將ATCC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌種保存物分別解凍并在5ml布魯氏桿菌肉湯中稀釋。立即將該稀釋后的細(xì)菌懸浮液0.2ml涂布于trypticase大豆血液瓊脂盤上，其中加有5％羊血。這些瓊脂盤在微需氧條件下培養(yǎng)讓細(xì)菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)后，將菌落從盤上刮下并用PBS洗滌兩次。然后，將洗滌后的沉淀懸浮于PBS中。
為了從每個(gè)幽門螺桿菌菌株中收集抗原，將幽門螺桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰冷的容器中并用Microson XL200超聲波細(xì)胞破裂機(jī)進(jìn)行10分鐘的超聲波處理。然后，在2-8℃將經(jīng)超聲波處理的細(xì)菌懸浮液以25000×g離心30分鐘，保留上清液作為制備幽門螺桿菌抗體的免疫原。
為了從幽門螺桿菌菌株中收集核酸，可以用存在于100mMTris-HCl(pH8.8)的1％SDS將幽門螺桿菌細(xì)胞裂解。然后，可以用等體積的苯酚/氯仿將此裂解液提取一次，隨后用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取兩次。用氯仿-苯酚提取后，可以用0.6體積的異丙醇室溫下沉淀染色體DNA。以13000×g離心15分鐘，用70％乙醇洗滌此核酸沉淀，并將其溶解于10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0中。
實(shí)施例2用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血液中的幽門螺桿菌用限制酶可將得自幽門螺桿菌菌株的DNA消化。適宜的限制酶包括但不限于HindIII，EcoRI，BamHI，ClaI和XbaI。在瓊脂糖凝膠上所得片段可在Tris-乙酸-EDTA緩沖液中走電泳。用一種購(gòu)自BoehringerMannheim(德國(guó))的瓊脂糖凝膠提取試劑盒從該瓊脂糖凝膠中提取DNA片段。因?yàn)橛拈T螺桿菌菌株在基因水平是高度多樣性的，故比較每個(gè)幽門螺桿菌菌株的DNA片段以找到共有序列片段是有利的。
用雙鏈DNA模板和二脫氧鏈終止方法(如Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)，711342-1346所述)可以在兩個(gè)鏈上確定共有序列片段的DNA序列?；诖斯灿行蛄衅蔚谋Ｊ匦蛄校梢酝ㄟ^(guò)下列制造商提供的方案用DNA合成儀合成寡核苷酸引物。用于PCR的引物通常長(zhǎng)度為約20bp并優(yōu)選15-25bp。當(dāng)兩個(gè)引物長(zhǎng)度相同并具有基本相同的核苷酸組成時(shí)，可以獲得較好的擴(kuò)增。優(yōu)選只與此抗原的核酸特異性雜交的PCR引物，因?yàn)閿U(kuò)增的存在指示了幽門螺桿菌特異性核苷酸序列的存在。
用常規(guī)方法和實(shí)驗(yàn)的常規(guī)用量，依據(jù)獲得典型核酸的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得DNA編碼的抗原片段。
PCR擴(kuò)增在含血漿DNA提取物為模板、幽門螺桿菌引物、Dynazyme緩沖液(可購(gòu)自Finnzymes，Espoo，F(xiàn)inland)、所有四種脫氧核苷酸的混合物及Dynazyme的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。血漿DNA的提取與提取幽門螺桿菌核酸的方式相同，不同的是在最后增加了讓該提取物通過(guò)Microcon 100過(guò)濾器的步驟。此最后步驟是為了除去殘留的非生物抑制性物質(zhì)及多糖復(fù)合物，已發(fā)現(xiàn)它們是有力的PCR抑制劑，并使DNA無(wú)法沉淀。
可以用礦物油將此反應(yīng)覆蓋并在開始PCR循環(huán)前在Perkin-Elmer DNA熱循環(huán)儀(Norwalk，CT，USA)中加熱至94℃并保持10分鐘。開始的5個(gè)循環(huán)參數(shù)可以為在94℃變性2分鐘，在42℃退火1分鐘并在72℃延伸1分鐘。隨后可以用下列參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR在94℃變性2分鐘，在59℃退火1分鐘并在72℃延伸1分鐘。在最后一個(gè)循環(huán)，延伸可以進(jìn)行10分鐘。可以在4℃下停止PCR反應(yīng)，并在瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。可以估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小并與在幽門螺桿菌中發(fā)現(xiàn)的共有序列片段比較。
其大小等于共有序列片段的大小被視為陽(yáng)性結(jié)果?？梢酝ㄟ^(guò)Southern印跡雜交法用32P CTP標(biāo)記的DNA探針(已由此共有序列片段擴(kuò)增)證實(shí)該P(yáng)CR產(chǎn)物是幽門螺桿菌序列。
或者，可以用限制酶如AluI，HinFI和HaeIII消化此PCR產(chǎn)物及共有序列片段，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析此消化物的消化圖譜。相同的圖譜指示該P(yáng)CR產(chǎn)物得自幽門螺桿菌序列。
實(shí)施例3用LCR擴(kuò)增檢測(cè)血液中的幽門螺桿菌DNA連接酶鏈反應(yīng)(LCR)檢定需要兩套的兩個(gè)寡核苷酸和一個(gè)DNA連接酶。第一套寡核苷酸(即Oligo A和Oligo B)是彼此連續(xù)的并與靶DNA雙螺旋的一個(gè)鏈互補(bǔ)。第二套寡核苷酸(即Oligo C和Oligo D)與第一套是互補(bǔ)的，并因此占據(jù)了靶DNA的第二個(gè)鏈上的鄰近位點(diǎn)。所有四個(gè)寡核苷酸探針可以按照幽門螺桿菌菌株的保守序列設(shè)計(jì)并在AppliedBiosystems(Foster City，CA)寡核苷酸合成儀中合成并通過(guò)PAGE純化。Oligo A和Oligo D可以通過(guò)在37℃下在腺苷5′(γ-32P)三磷酸和多核苷酸激酶的存在下，在50mM Tris-HCl(pH 7.5)、7mM氯化鎂和1mM二硫蘇糖醇中孵育30分鐘，在其5′末端進(jìn)行放射標(biāo)記。然后，通過(guò)在70℃下加熱使該多核苷酸激酶失活。等量的放射標(biāo)記的寡核苷酸探針A和D，以及寡核苷酸探針B和C可以加入到一個(gè)Eppendorf管中，同時(shí)加入從血清樣本中提取的DNA模板。每個(gè)管含有一種反應(yīng)緩沖液，該緩沖液由50mM 雙-TrispH 6.5，10mM氯化鎂，10mM氯化銨，10mM氯化鉀，1mM二硫蘇糖醇和1mM NAD組成。然后，可以向每個(gè)管中加入適量的礦物油，并將這些管加熱至100℃并保持3分鐘，隨后冷卻至85℃并保持1分鐘，并在55℃下放置，同時(shí)加入DNA連接酶。優(yōu)選的DNA連接酶是Pfu DNA連接酶，其得自Pyrococcus furiosus。然后可以將這些反應(yīng)管置于DNA熱循環(huán)儀(RoboCycler，Stratagene)中并在85℃和50℃循環(huán)20、30或40次，每個(gè)溫度1分鐘。然后，用95％甲酰胺終止染料將每個(gè)反應(yīng)的一個(gè)等分進(jìn)行1∶1的稀釋。此稀釋后的樣本可以在丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。
實(shí)施例4制備幽門螺桿菌DNA探針可以切掉幽門螺桿菌菌株DNA片段(一般至少25個(gè)堿基，通常至少約30個(gè)堿基，并可以多達(dá)約10000個(gè)堿基或以上，但是常常不超過(guò)約5000個(gè)堿基)，并在電泳后從瓊脂糖凝膠中提取?？梢杂孟拗泼笇⒋薉NA片段消化并與宿主連接以形成重組質(zhì)粒構(gòu)建。例如，可以用ClaI將此DNA片段消化并連接進(jìn)入ClaI消化的Pev-Vrf表達(dá)宿主(Crowl等，Gene(1985)，3831-38)。然后，可以將此重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，其可以是原核細(xì)胞如E.coli RRI，或真核細(xì)胞如NIH 3T3細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。此重組的質(zhì)粒可以通過(guò)在此宿主細(xì)胞中復(fù)制而增殖。可以按照So等，Infect.Immun.(1978)，21405-411的方法分離此重組質(zhì)粒。通過(guò)用相同的限制酶消化可以從此質(zhì)粒中釋放幽門螺桿菌的DNA片段?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺電泳證實(shí)此釋放的幽門螺桿菌DNA片段。然后，可以用放射性同位素(如32P、3H、14C等)或熒光物質(zhì)(如使用地高辛基和生物素標(biāo)記的DNA探針并結(jié)合熒光檢測(cè)方法)標(biāo)記此增殖后的DNA片段并用作DNA探針。
實(shí)施例5用幽門螺桿菌DNA探針的點(diǎn)雜交制備在水中煮沸或高壓消毒可以將硝酸纖維素膜滅菌。將一個(gè)單個(gè)的滅菌膜置于瓊脂的表面并用已被處理釋放其DNA的血清點(diǎn)滴。例如，可以用稀堿水溶液(例如0.1至1M氫氧化鈉)將此血清樣本裂解。該堿還可以用來(lái)使DNA變性。其它的變性操作包括但不限于升高溫度、使用有機(jī)溶劑(如醇、酰胺、胺、脲、苯酚和亞砜)或某種無(wú)機(jī)離子(如硫氰酸根和高氯酸根)。
將此樣本變性后，在緩沖水溶液(pH一般為約6至8，通常為7)中可以洗滌此濾膜。經(jīng)裂解、變性并洗滌后，可以將此樣本DNA點(diǎn)滴濾膜在升高的溫度下干燥，一般為約50至70℃，以將樣本DNA固定在此濾膜上。
然后，在溫和的升溫下將此濾膜與不含探針的雜交溶液孵育足夠的時(shí)間以將徹底潤(rùn)濕此濾膜?？梢允褂枚喾N雜交溶液，其中含約20％至60％，優(yōu)選30％體積百分比的惰性極性有機(jī)溶劑。一種普通的雜交溶液使用約50％甲酰胺、約0.5至1M氯化鈉、約0.05至0.1N枸櫞酸鈉、約0.05至0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)和少量的EDTA、菲可(約300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500kdal)和血清白蛋白。在此雜交溶液中還可以含有約0.5至5mg/ml的超聲變性的DNA(例如，胎牛胸腺或鮭魚精液)，及選擇性存在的約0.5至2％重量/體積(wt/vol)的甘氨酸。還可以含有其它添加劑，例如約100至1000kdal的硫酸葡聚糖和約8至15wt％的雜交溶液。
標(biāo)記DNA探針的量變化很大，這依賴于標(biāo)記物的特性及其是否可以有效地與濾膜結(jié)合，以及該雜交的嚴(yán)格條件?？傊?，應(yīng)使用化學(xué)計(jì)量基本上過(guò)量的探針以提高該探針與固定樣本DNA的結(jié)合速度。
室溫下，用含與雜交溶液類似濃度的氯化鈉、枸櫞酸鈉和SDS的第二溶液清洗該濾膜后，現(xiàn)在可以按照標(biāo)記物的本質(zhì)檢測(cè)此濾膜存在的雙螺旋。當(dāng)該標(biāo)記物是放射性的時(shí)，將此濾膜干燥并用其使X射線底片曝光。如果此標(biāo)記物是熒光物質(zhì)，則可以直接用熒光顯微鏡觀察。
此探針不需要與其雜交的序列完全互補(bǔ)；其中可以存在30％或更多的錯(cuò)配堿基對(duì)。影響DNA雜交體形成的條件是熟知的并由Crosa等，J.Bact.(1973)，115(3)904-911詳述。
實(shí)施例6制備抗幽門螺桿菌的兔多克隆抗體新西蘭白兔，先用存在于完全弗氏佐劑中的0.5至1.0mg的幽門螺桿菌抗原，通過(guò)肌肉注射進(jìn)行免疫，再每隔4周用存在于不完全弗氏佐劑中的0.5-1.0mg相同抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在第3次加強(qiáng)免疫后采集血樣進(jìn)行分析。一旦該抗體滴度到達(dá)了約106的所需水平，便開始放血。
將個(gè)體的血液先在PBS中稀釋至1×106。然后將100μl的稀釋后兔血清加入到幽門螺桿菌抗原包被孔中。室溫下孵育1小時(shí)后，用PBS將此板洗滌4次并加入100μl山羊抗兔IgG-HRP結(jié)合物。將此板在室溫下再孵育30分鐘。用PBS洗滌4次后，向每個(gè)孔中加入100μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物以染色，并在450/650nm用微孔讀數(shù)器檢測(cè)每個(gè)孔中的顏色強(qiáng)度。OD450/650必須大于1.0才能用于抗體的制備。
實(shí)施例7制備抗體-HRP酶結(jié)合物選擇酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)來(lái)與抗幽門螺桿菌抗體偶聯(lián)。此抗體-HRP酶結(jié)合物的制備是根據(jù)改良的Nakane方法(Nakane等，1978Inimmunoflorescence and related staining techniques，Knapp等編輯，p215-220，Elsivier/North-Holland Biomedical Press，Amsterdam)。
簡(jiǎn)言之，先用高碘酸鈉對(duì)HRP進(jìn)行氧化處理。此氧化在碳水合物側(cè)鏈上產(chǎn)生醛基。該抗體和氧化后的HRP再在堿性pH下混合，讓該抗體上的氨基與HRP上的醛基反應(yīng)，形成Schieff堿，并將抗體和HRP之間還原為共價(jià)鍵。然后，通過(guò)用Sephacryl-S300柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化抗體-HRP結(jié)合物。
此HRP可以與一級(jí)抗體如抗幽門螺桿菌的兔抗體，或與二級(jí)抗體如抗兔IgG的山羊抗體結(jié)合。
實(shí)施例8凝膠電泳和免疫印跡分析血清樣本可以通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。電泳后，可以通過(guò)改良的銀染色方法(Oakley等，Anal.Biochem.(1980)，105361-363)固定凝膠并分離蛋白。
或者，蛋白質(zhì)可再通過(guò)lamp電印跡1小時(shí)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素紙上。用封閉劑如吐溫20和脫脂牛奶將未占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)封閉后，向此硝酸纖維素紙中加入足量的實(shí)施例6(見(jiàn)上)所述的幽門螺桿菌抗體。然后，可將此硝酸纖維素紙?jiān)谑覝叵路跤?小時(shí)。最后，可向此硝酸纖維素紙中加入抗產(chǎn)生幽門螺桿菌抗體的動(dòng)物種屬免疫球蛋白的二級(jí)抗體(如山羊抗兔IgG)的堿性磷酸酶結(jié)合物。此反應(yīng)可以通過(guò)加入5-溴-4-氯-3-異丁基磷酸(BCIP)/氮藍(lán)四唑(NBT)檢測(cè)。
實(shí)施例9制備游離形式的血清幽門螺桿菌抗原血清幽門螺桿菌抗原可以游離形式及免疫復(fù)合物的形式存在。幽門螺桿菌的游離形式可以通過(guò)免疫檢定或任何可以檢測(cè)方法容易地檢測(cè)。對(duì)于那些與血清中幽門螺桿菌抗體形成免疫復(fù)合物的抗原，它們只能在從此免疫復(fù)合物中解離后檢測(cè)。
血清幽門螺桿菌抗原可以游離形式及免疫復(fù)合物的形式存在，且幽門螺桿菌的游離形式可以通過(guò)本發(fā)明的ELISA容易地檢測(cè)，但免疫復(fù)合物不能容易地通過(guò)相同的方法檢測(cè)，這個(gè)事實(shí)示于表1。
表1是血清幽門螺桿菌摻加研究。被測(cè)樣本都不含有幽門螺桿菌抗原。盡管血清中不存在幽門螺桿菌，但是血清樣本中可能含有幽門螺桿菌抗體(即“抗體陽(yáng)性樣本”)，這可能是由于原來(lái)的感染造成的，其與不含任何幽門螺桿菌抗體的樣本(即“抗體陰性樣本”)相反。在摻加組中，將已知量的幽門螺桿菌抗原(1×105細(xì)菌/ml)，不論是全細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞裂解液，加入到“抗體陰性”及“抗體陽(yáng)性”血清樣本中。在“非摻加”組中，不加入幽門螺桿菌抗原。
表1的結(jié)果表明在“抗體陰性”樣本中，由OD450/650讀數(shù)的增加反映出了幽門螺桿菌抗原的加入。相反，在“抗體陽(yáng)性”樣本中加入幽門螺桿菌抗原不會(huì)將OD450/650讀數(shù)增加到與“抗體陰性”樣本中相同的水平。一個(gè)可能的解釋是加入的幽門螺桿菌抗原與血清幽門螺桿菌抗體形成了免疫復(fù)合物，其干擾ELISA檢測(cè)。
為了將血清幽門螺桿菌抗原的免疫復(fù)合物解離，可以用解離試劑或在樣本的解離條件下處理該血清樣本。有四種主要的解離試劑，其對(duì)解離這些免疫復(fù)合物很有效。第一種解離試劑是氯化鈉或氯化鉀的高鹽溶液。優(yōu)選高鹽溶液的濃度至少是1M。優(yōu)選的鹽是氯化鉀。第二種解離試劑是含洗滌劑如SDS、吐溫20、辛基葡糖苷、脫氧膽酸鹽或Triton X-100的溶液。這些洗滌劑可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。此洗滌劑優(yōu)選的濃度大于1％。第三種解離試劑是含離液劑如鹽酸胍、脲和硫氰酸鉀(KSCN)的溶液。這些離液劑的濃度可以大于2M。第四種解離試劑是含有機(jī)溶劑如10％二惡烷和40％乙二醇的溶液。
或者，該血清樣本可以在樣本解離的條件下處理，此條件可以是高或低pH，或者升高的溫度。優(yōu)選的高pH是9或更高。優(yōu)選的低pH是3或更低。優(yōu)選的高溫是至少50℃。
表1.血清幽門螺桿菌抗原摻加研究

實(shí)施例10兔抗幽門螺桿菌抗體的親和純化A.制備親和柱將1至5克的幽門螺桿菌細(xì)胞糊懸浮于12.5ml PBS緩沖液(0.1M磷酸鈉、0.15M氯化鈉，pH7.2)，其中含有辛基葡糖苷，并在室溫下攪拌30分鐘。然后將此懸液在冰浴中以最大的輸出功率超聲波處理10分鐘，每分鐘的超聲波處理有1分鐘的時(shí)間間隔。超聲處理后，以25000g離心30分鐘除去不溶物。保留上清液并用PBS將蛋白濃度調(diào)節(jié)為1-3mg/mL。將在PBS中預(yù)平衡的氨基連接臂偶聯(lián)凝膠(由Pierce制備)以1-10mg蛋白每ml填充凝膠的比例加入到該上清液中，然后每毫升填充凝膠中加入存在于水中的10-40μl的5M硼氫化鈉。再將此反應(yīng)漿在4℃下孵育過(guò)夜(至少6小時(shí))，同時(shí)輕輕混合。孵育后，將此凝膠漿倒入適當(dāng)大小的色譜柱中并排出過(guò)量的液體。然后，用兩個(gè)柱體積的偶聯(lián)緩沖液洗脫此柱，隨后用兩個(gè)柱體積的1M Tris HCl，pH7.4洗脫。將洗脫后的凝膠再懸浮于1個(gè)柱體積的1M TrisHCl，pH7.4。再懸浮后，每毫升填充凝膠加入10-40μl的5M硼氫化鈉。室溫下孵育所得懸浮液1小時(shí)，同時(shí)溫和地?cái)嚢?。然后排掉柱中的水，用PBS大量洗滌以除去柱中任何未結(jié)合的抗原。
B.通過(guò)親和柱純化抗體為了純化兔抗體，向等體積的兔血清中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，以沉淀幽門螺桿菌抗體。室溫下攪拌30分鐘后，離心30分鐘收集沉淀，在PBS中再溶解并用100倍過(guò)量的PBS透析。透析后，通過(guò)0.2μm過(guò)濾器將此溶液過(guò)濾，并加樣到此親和柱上。加樣后，用PBS充分洗滌此柱直到洗脫液到達(dá)基線。此柱中的抗幽門螺桿菌特異性抗體用3M KSCN水溶液洗脫。收集含免疫球蛋白的餾份并用PBS透析，最少換兩次透析液以除去過(guò)量的KSCN。然后，將純化的抗體濃縮至約1.0-2.0mg/ml并在-20℃下保存。
實(shí)施例11血清抗原ELISA試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)方法將血清從全血中分離。按照實(shí)施例1收集游離的血清樣本。在20μg/ml和1.0μg/ml之間將親和純化的抗體在磷酸緩沖液中作系列稀釋。將每個(gè)稀釋液的0.1ml等份加入到Costar Strip Plate中，覆蓋并在室溫下孵育過(guò)夜。將此板用PBS洗滌一次并在室溫下用存在于PBS中的1％BSA封閉4小時(shí)。除去BSA溶液后，向此抗體包被的微孔條板中加入0.1ml游離形式的血清樣本，覆蓋并室溫下孵育2小時(shí)。然后，用PBS/吐溫洗滌液將此板洗滌5次。接著，向每個(gè)微孔中加入0.1ml與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的兔抗幽門螺桿菌抗體，覆蓋并在室溫下孵育1小時(shí)。用PBS/吐溫洗滌液再將此板洗滌5次并在室溫下與0.1ml四甲基聯(lián)苯胺孵育10分鐘。在450nm測(cè)定顏色的變化。用0.1ml 1N硫酸停止此反應(yīng)。將獲得最大光密度和最低本底的稀釋液選為最佳稀釋液。
表2和表3代表了在不同的時(shí)間用不同患者血清樣本進(jìn)行的兩個(gè)試驗(yàn)。這些試驗(yàn)表明了血清ELISA檢測(cè)幽門螺桿菌的結(jié)果。第一個(gè)試驗(yàn)(表2)包括5個(gè)對(duì)象。第二個(gè)試驗(yàn)(表3)包括3個(gè)對(duì)象。結(jié)果以O(shè)D450/650表示。幽門螺桿菌的存在和定量可以在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)(650nm表示檢測(cè)本底[即該板]的波長(zhǎng))。OD450/650表示了在OD450的讀數(shù)減去在OD650的讀數(shù)。OD450/650≤0.1的樣本表示陰性結(jié)果(即，沒(méi)有幽門螺桿菌感染)。
表2.血清ELISA試驗(yàn)(試驗(yàn)1)

取梯度稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板(濃度為109-102copies/ul)，，進(jìn)行熒光定量，總體積20ul，其中17.8ul PCR反應(yīng)液，2ul梯度樣品(陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板、淋病奈瑟菌DNA樣品及解脲支原體、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、乳桿菌和大腸桿菌的DNA)，0.2ul Taq酶。反應(yīng)條件95<p>表4清楚表明，就低本底讀數(shù)和高(更靈敏)陽(yáng)性樣本讀數(shù)而言，親和純化的抗體和親和純化的酶結(jié)合物產(chǎn)生了最好的結(jié)果。親和純化的抗體用于板的兩側(cè)而酶結(jié)合物作為參考標(biāo)準(zhǔn)(檢測(cè)1)。所有的其它檢測(cè)結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)比較。當(dāng)與參考標(biāo)準(zhǔn)比較時(shí)，由于升高的本底(即陰性樣本的較高OD)和陽(yáng)性樣本的OD降低(檢測(cè)3)，DEAE板和DEAE結(jié)合物顯示了假陽(yáng)性結(jié)果。用親和板代替DEAE板，陽(yáng)性信號(hào)升高，但是較高的本底仍然存在，這導(dǎo)致了假陽(yáng)性結(jié)果(檢測(cè)2)。通過(guò)降低DEAE結(jié)合物濃度至原來(lái)的50％，本底降低但是陽(yáng)性信號(hào)也降低，這樣導(dǎo)致了假陰性結(jié)果(檢測(cè)4)。
表4.DEAE和親和純化抗體的比較

實(shí)施例13免疫色譜檢測(cè)免疫色譜檢測(cè)裝置有帶有兩個(gè)視窗的外部塑料盒“加樣視窗”和“結(jié)果觀察視窗”。此“加樣視窗”，向其中加入流動(dòng)相，其中還含有“標(biāo)記墊”或含第二種抗體的貯庫(kù)，該抗體用檢測(cè)試劑如免疫-金標(biāo)記。將此墊置于加樣點(diǎn)和“結(jié)果觀察視窗”的較低邊界之間?！敖Y(jié)果觀察視窗”在固定相上，其含有檢驗(yàn)線，其用一級(jí)抗體定位，以及對(duì)照線，其用抗第二種抗體的抗體定位。此檢驗(yàn)線在加樣點(diǎn)和對(duì)照線之間。
為了進(jìn)行檢測(cè)，將4-6滴血清加入到該盒的樣本區(qū)。該樣本流經(jīng)含純化的、與免疫-金的紅顏色或其它標(biāo)記物偶聯(lián)的幽門螺桿菌抗體的標(biāo)記墊?，F(xiàn)在含標(biāo)記的抗體的樣本將移動(dòng)該檢驗(yàn)條首先通過(guò)檢驗(yàn)線，然后通過(guò)對(duì)照線。如此樣本中含有幽門螺桿菌抗原，此抗體將此抗原與紅色免疫-金偶聯(lián)，接著將與固定在硝酸纖維素膜上的幽門螺桿菌抗體結(jié)合，形成一條線。抗幽門螺桿菌抗體-抗原-抗體復(fù)合物被捕獲時(shí)，在結(jié)果視窗中可以看到一條紅色檢驗(yàn)線(膜-抗體抗原抗體-紅色免疫-金)。此對(duì)照線用山羊抗兔抗體點(diǎn)滴。當(dāng)該樣本流經(jīng)(如果一種單克隆抗體用來(lái)偶聯(lián)有色顆粒，此對(duì)照線用山羊抗小鼠點(diǎn)滴)時(shí)，幽門螺桿菌-免疫-金-抗體被山羊抗兔線捕獲，以確保正確進(jìn)行此試驗(yàn)。
液體樣本，其中可能含有其它流動(dòng)相，將從較低的部分移至較高的部分(色譜作用)，并且通過(guò)頂部吸收墊，所有過(guò)量的液體將排向此盒的上部。如果在此樣本中不含抗原，只有對(duì)照線在試驗(yàn)的后期是看見(jiàn)的。如果存在抗原，將見(jiàn)到檢驗(yàn)線。
經(jīng)過(guò)對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并參考優(yōu)選的實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在不背離本發(fā)明范圍的前題下，本發(fā)明的改良形式和變化形式是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是用得自幽門螺桿菌菌株的、對(duì)幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來(lái)檢測(cè)幽門螺桿菌的核酸片段。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，用一對(duì)特異性檢測(cè)幽門螺桿菌的引物檢測(cè)的。
3.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述血液是血漿。
4.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述引物對(duì)包括得自ATTC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌株的共有核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是使用第一套和第二套特異性檢測(cè)幽門螺桿菌的寡核苷酸通過(guò)連接酶鏈反應(yīng)測(cè)定的，其中第一套中的寡核苷酸彼此是連續(xù)的，第二套與第一套互補(bǔ)，第二套寡核苷酸彼此是連續(xù)的。
6.權(quán)利要求5所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述第一套和第二套寡核苷酸含有得自ATTC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌株的共有核苷酸序列。
7.權(quán)利要求5所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述連接酶鏈反應(yīng)是用Pfu DNA連接酶進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是通過(guò)DNA雜交用幽門螺桿菌DNA探針檢測(cè)的。
9.權(quán)利要求8所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述DNA探針是用放射性同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記的。
10.權(quán)利要求8所述的檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述DNA雜交是在硝酸纖維素膜上制備的點(diǎn)狀DNA雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及在被感染個(gè)體的血液中發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)幽門螺桿菌(H.pylori)抗原，并提供了檢測(cè)血液中幽門螺桿菌抗原的方法。此幽門螺桿菌抗原是幽門螺桿菌細(xì)胞的組分，其包括但不限于DNA、RNA、核苷酸、蛋白和肽片段。幽門螺桿菌DNA、RNA及核苷酸片段抗原通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)或DNA雜交方法或其它擴(kuò)增方法檢測(cè)。幽門螺桿菌蛋白或肽或其其它抗原組分可通過(guò)免疫檢定或免疫印跡法用幽門螺桿菌抗體檢測(cè)，該抗體優(yōu)選是通過(guò)親和柱純化的抗體。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1680605SQ20051006606
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2000年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月19日
發(fā)明者伊慶燧 申請(qǐng)人:蘇榮仁