專利名稱：編碼大腸桿菌熱敏毒素基因及其表達(dá)載體和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新基因，尤其涉及一種編碼人源性大腸桿菌熱敏毒素基因、該基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)以及所獲得的轉(zhuǎn)基因植物作為免疫佐劑的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗原對(duì)免疫系統(tǒng)有效的刺激是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的必要條件，對(duì)免疫系統(tǒng)的有效刺激需要兩個(gè)條件，一是疫苗抗原能夠有效的傳遞到淋巴組織；二是需要合適的佐劑。絕大多數(shù)非復(fù)合抗原如純蛋白質(zhì)抗原經(jīng)粘膜供給時(shí)免疫原性弱，特別是經(jīng)口服途徑，只有大量和反復(fù)接種后才可能引起免疫應(yīng)答，但應(yīng)答持續(xù)時(shí)間短，有時(shí)易引起免疫耐受，必須輔以適當(dāng)?shù)淖魟┎拍墚a(chǎn)生滿意的免疫效果。尋找合適的免疫原性的佐劑成為疫苗開發(fā)中的關(guān)鍵問題。比較理想的佐劑應(yīng)該高效、安全，能激活免疫系統(tǒng)，在其存在的情況下抗原可引發(fā)抗原特異性體液免疫、細(xì)胞免疫及全身粘膜免疫應(yīng)答，同時(shí)能避免誘導(dǎo)免疫耐受。
目前人們已開發(fā)出多種佐劑，其中有相當(dāng)一部分通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其在引發(fā)免疫上非常有效。目前所用的大腸桿菌熱敏毒素LT和霍亂毒素CT具有良好的佐劑性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
大腸桿菌熱敏毒素LT和霍亂毒素CT兩種毒素目前被認(rèn)為是最有效的佐劑，也是最主要的基因工程疫苗佐劑和粘膜免疫佐劑，可消除共抗原的免疫耐受。兩者一級(jí)結(jié)構(gòu)有80％同源，三維空間結(jié)構(gòu)基本相似，均為多亞單位的大分子，由結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能不同的A(11.6KD)和B(29KD)兩種亞單位組成AB5型結(jié)構(gòu)的六聚體蛋白。每種毒素的B亞基均由五個(gè)相同B亞單位組成，負(fù)責(zé)與細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，A亞基則具有ADP-核糖基化酶的活性。CT、LT引發(fā)粘膜免疫非常有效，CT與非關(guān)聯(lián)蛋白抗原經(jīng)口、鼻共用，可促進(jìn)分泌IL-4、IL-5的抗原特異性CD4+Th細(xì)胞的出現(xiàn)，引發(fā)極強(qiáng)的粘膜sIgA和血清IgG應(yīng)答。CT發(fā)揮佐劑效應(yīng)主要通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+Th2型細(xì)胞，活化的CD4+Th2型細(xì)胞不僅相應(yīng)產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，而且支持全身IgG1和IgG2b亞類、IgE和粘膜sIgA應(yīng)答的出現(xiàn)。LT與抗原口服用，可誘導(dǎo)CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生血清IgM、IgG1、IgG2a和粘膜sIgA〔Fujihashi K，KogaT，VanGinkel FW，etal.[J].Vaccine，2002，20(1920)2431-2438〕。LT作為佐劑可與多種抗原經(jīng)不同途徑共免疫均能明顯增強(qiáng)機(jī)體對(duì)共服抗原的粘膜sIgA和IgG應(yīng)答，與CT主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答不同，LT誘導(dǎo)的應(yīng)答要均衡些，產(chǎn)生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和粘膜IgA，顯然是Th1和Th2型應(yīng)答的混合。McNeal等分別用缺乏αβ型和γδCD4+T細(xì)胞的小鼠模型進(jìn)行研究，顯示αβ型CD4+T細(xì)胞可能是LT佐劑激活免疫應(yīng)答最關(guān)鍵的細(xì)胞，LT佐劑能誘導(dǎo)長(zhǎng)期記憶應(yīng)答〔McNeal MM，VanCott J1，Choi AH，etal.Virol，2002，76(2)560〕。與CT引起的致死性腹瀉相比，LT引起的腹瀉要溫和的多，而且與CT相比，LT同樣具有很好的佐劑作用，基本上不誘生IgE，卻能有效地啟動(dòng)機(jī)體局部和全身的體液和細(xì)胞免疫；而CT對(duì)Th1細(xì)胞無誘導(dǎo)作用，血清中也不產(chǎn)生IgG2a，因此，LT作為佐劑可能比CT更勝一籌〔Millar，D.G.，Hirst，T.R.，Snider，D.P.，InfectImmun，2001，69，3476〕。
LT作為粘膜免疫佐劑引起的免疫應(yīng)答主要有以下特點(diǎn)1、使機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)特異的粘膜sIgA；2、LT誘導(dǎo)腸集合淋巴結(jié)(peryer′spatch，PP)抗原特異的Th細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答，包括Th1(γ-INF)和Th2(IL-4、IL-5)細(xì)胞、血清IgG1、IgG2a、IgG2b及腸道粘膜sIgA應(yīng)答，產(chǎn)生體液免疫；3、LTs還誘導(dǎo)MHC-II限制的細(xì)胞介導(dǎo)免疫，使抗原特異的T細(xì)胞、IL-2、MHC-I限制的細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)顯著增多，產(chǎn)生細(xì)胞免疫〔Ermak TH，Giannasca PJ，Nichol SR，etal.[J].JExpMed，1998，188(12)2277-2288〕。
LT免疫佐劑的應(yīng)用1、防止免疫耐受。小分子抗原或半抗原免疫，特別粘膜免疫的最大缺陷是所需抗原劑量大和易對(duì)抗原產(chǎn)生免疫耐受。而LTs與抗原一起初次免疫動(dòng)物后，將長(zhǎng)期不會(huì)對(duì)該抗原產(chǎn)生免疫耐受。2、簡(jiǎn)化免疫途徑。粘膜免疫的最大特點(diǎn)之一是免疫途徑可采用口服、灌胃、鼻飼、直腸灌注、陰道滴注等，可以大大減低經(jīng)血傳播病原如人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)等在受試者之間的傳播率?？诜庖呖梢灶A(yù)防消化道傳染性疾病，鼻飼免疫可使陰道粘膜抗原特異性sIgA水平顯著升高，甚至優(yōu)于陰道內(nèi)免疫，這使通過鼻飼免疫可預(yù)防性傳播疾病。3、增強(qiáng)免疫防御?？共《究诜﨤T+感冒病毒疫苗能顯著增強(qiáng)小鼠血清抗-病毒IgG和粘膜sIgA應(yīng)答，LT使血清凝集抑制抗體和中和抗體均有增加，使病毒特異的T細(xì)胞、IL-2、MHC-I限制的細(xì)胞毒T細(xì)胞顯著增多。用LTB混合微量野生型LT(0.5％)作為佐劑(LTB)、三價(jià)滅活感冒病毒作混合抗原鼻飼免疫自愿者，能明顯增加呼吸道抗感冒病毒sIgA水平和增強(qiáng)機(jī)體抗感冒病毒感染的能力。LT及LTR192G作為粘膜免疫佐劑能使輪狀病毒2/6病毒樣顆粒(2/6-VLPs)疫苗刺激腸道粘膜產(chǎn)生高效價(jià)的病毒抗原特異性sIgA，對(duì)輪狀病毒感染的免疫保護(hù)率達(dá)100％，優(yōu)于CT佐劑(91％)?？辜?xì)菌目前主要為預(yù)防螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)研究。研究人員選用重組尿素酶(rUrease)作抗原，LT作佐劑，采用口服、鼻飼等途徑進(jìn)行免疫，結(jié)果均顯示了對(duì)螺桿菌感染的粘膜免疫保護(hù)活性。Welzin研究證實(shí)，盡管采用rUre每天鼻飼小鼠可以使唾液和糞便中產(chǎn)生高水平的sIgA，但僅rUre+LT產(chǎn)生的免疫對(duì)實(shí)驗(yàn)性貓螺桿菌(helicobacterfelis)感染具有免疫保護(hù)作用。而Ermak則研究認(rèn)為，尿素酶+LT免疫小鼠預(yù)防幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染主要依賴MHC-II限制的細(xì)胞介導(dǎo)免疫機(jī)制，可不需要對(duì)于尿素酶的抗體應(yīng)答。另外，Douce等研究也表明，破傷風(fēng)毒素C片段與LTK7共鼻飼免疫后的小鼠對(duì)有毒的破傷風(fēng)毒素具有明顯的粘膜免疫保護(hù)作用?？拐婢鶦ardenas用10mgLTR192G作佐劑、與滅活的白色念珠菌(heat-killedcandidaalbicans，HK-CA)鼻免疫CBA/J小鼠，同時(shí)以不加佐劑疫苗作對(duì)照。結(jié)果表明，加佐劑疫苗能引起更明顯的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，能根除機(jī)體104白色念珠菌活菌，并顯著提高小鼠感染后的存活率；而對(duì)照組僅使菌量減少〔Cardenasfreytag L，ChengE，Mayeu P，etal.[J].Infect Immun，1999，67(2)826-833.〕。
LT根據(jù)來源不同分為人源(LT-h)和豬源(LT-p)兩大類，它們具有很高的基因和氨基酸順序同源性，理化性質(zhì)和免疫性均極為相似。LT(87KD)由1個(gè)A亞單位(LtA 29KD)和5個(gè)B亞單位(LtB 11.6KD)組成。5個(gè)完全相同的B亞單位在空間上形成環(huán)狀五聚體；LtA位于中央，其C-端以非共價(jià)鍵與LtB結(jié)合。A亞單位能被蛋白酶裂解為兩個(gè)片段A1和A2，二者以二硫鍵相連。A1具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，它由B亞單位介導(dǎo)能透過細(xì)胞膜，激活細(xì)胞內(nèi)的腺苷環(huán)化酶，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，刺激腸粘膜過度分泌水和電解質(zhì)，導(dǎo)致腹瀉，是CT的毒力活性部分；A2的主要功能是連接A1和B亞單位；B亞單位由五條多肽鏈以非共價(jià)鍵方式連結(jié)成一個(gè)五聚體環(huán)，可與靶細(xì)胞膜上神經(jīng)節(jié)苷脂1(GM1)特異性結(jié)合，打開通道，介導(dǎo)A亞單位進(jìn)入靶細(xì)胞，以發(fā)揮毒素活性。LtA和LtB分別由toxA和toxB編碼，它們有4個(gè)核苷酸的的重疊。胞漿中的A、B亞單位均以攜帶信號(hào)肽的前體形式存在，當(dāng)穿越細(xì)胞膜后才組裝成完整的LT。A亞單位具有GTP依賴的ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，通過G蛋白介導(dǎo)的ADP-核糖基化反應(yīng)破壞胞內(nèi)cAMP的降解與平衡，刺激cAMP水平增高，從而引發(fā)毒素效應(yīng)。B亞單位的作用是與真核細(xì)胞表面的GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異性結(jié)合，以利于A亞單位進(jìn)入靶細(xì)胞。LT具有很強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體接觸LT后可產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。LT-h和LT-p作用于不同的G蛋白，前者是Gs蛋白，后者是Gi蛋白，而最終都是使蛋白激酶A失活，引起一系列生化反應(yīng)，導(dǎo)致腹瀉。
80年代后期，Clements等首次報(bào)道了LT具有免疫佐劑活性，并可消除共免疫抗原的免疫耐受。當(dāng)LT與卵白蛋白(ovalbumin，OVA)同時(shí)初次口服免疫小鼠時(shí)，不但可以消除機(jī)體對(duì)OVA的免疫耐受性，還使血清抗-OVAIgG和粘膜抗-OVAsIgA含量比僅用OVA抗原初次免疫時(shí)高約30倍；但當(dāng)動(dòng)物在服用OVA后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)時(shí)，血清抗-OVAIgG和粘膜抗-OVAsIgA水平均明顯降低，不能消除機(jī)體對(duì)OVA的免疫耐受，表明LT對(duì)共免疫抗原(co-administeredantigen)的佐劑作用需以機(jī)體對(duì)該抗原是初次接觸或以接種為基礎(chǔ)。1992年，Rollwagen等進(jìn)一步研究表明，LT可以加強(qiáng)彎曲菌的粘膜免疫應(yīng)答，并加速腸道對(duì)該菌的清除〔Rollwagen，F(xiàn)M，Pacheco，ND，Clements，JD，etal.[J].Vaccine，1993，11(13)1316-1320〕。De Haan等對(duì)LT的佐劑作用機(jī)制和A、B亞單位在佐劑功能中所起的作用進(jìn)行了廣泛的研究，他們分別用LTB、LT、LT-E112K(LTAGlu112-lys)、LTB-G33D、LT-G33D、LT-E112K/G33D作粘膜免疫佐劑、流感HA分別作共免疫抗原采用鼻飼、陰道滴注途徑免疫小鼠，結(jié)果表明雖然LTA的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性在LT的免疫原性中不起主要的作用，也不是LT佐劑性所必須的，但它的存在卻增強(qiáng)了LT的免疫原性，它的缺失降低了LTB特異性血清IgG的水平，使特異性血清IgA幾乎為0；但對(duì)經(jīng)鼻、陰道免疫的佐劑性卻影響不大，這與其他人的研究結(jié)果一致〔DiTommaso A.，Saletti G.，Pizza M.etal.Infec Immun，1996，64，974；De HaanL，Verweij WR，F(xiàn)eil IK，etal.[J]Infect Immun，1996，645413〕。另外一些實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了其他缺乏ADP-核糖基化活性的突變體如LT R 7K、LT R 192G、LT S 63K與多種抗原經(jīng)多種途徑都產(chǎn)生與野生型LT相同的佐劑性。另一方面，LTB的GM1結(jié)合性對(duì)于LTB、LT的免疫原性，是必不可少的，GM1結(jié)合特性的缺失也會(huì)極大的降低LT、LTB的免疫原性，抗毒素特異性血清IgG、IgA，sIgA都大幅降低；但是，GM1的結(jié)合特性對(duì)LTB、LT的佐劑性卻不是必須的〔Dehaan L，Verweij W.R.，F(xiàn)eill K.et al.[J].Immunology，1998，94(3)424 430〕、〔Guidry J.J.，Cardenas L.，Cheng E.&J.D.Infect Immun，1997，65，4943〕。
目前，LT作為免疫佐劑的觀點(diǎn)已獲公認(rèn)，但本身強(qiáng)烈的腸毒性限制了它在臨床上的推廣應(yīng)用。目前一些研究正嘗試將這兩種分子的致腹瀉活性(毒性)與佐劑活性分開，單獨(dú)使用LTB做為免疫佐劑，會(huì)出現(xiàn)佐劑活性比較低，并基本不產(chǎn)生sIgA，佐劑效果還受如抗原類型、免疫途徑、動(dòng)物種屬、免疫劑量以及偶聯(lián)方法許多因素影響，所以LTB不適宜成為一種通用佐劑。另外一種受歡迎的做法是采用定點(diǎn)誘變的方法替換A亞基活性部位上某一氨基酸，在保持其粘膜佐劑活性的前提下降低或消除細(xì)菌毒素的毒性。目前已構(gòu)建了多種缺乏ADP-核糖基化活性的LT突變體，用以觀察ADP-核糖基化活性在LT粘膜免疫佐劑活性中的作用。Lycke等用無ADP-核糖基化活性的LTE112K(第112谷氨酸→賴氨酸)與KLH共口服免疫小鼠幾乎不能(遠(yuǎn)不及LT)增強(qiáng)刺激機(jī)體或腸粘膜產(chǎn)生針對(duì)KLH的免疫應(yīng)答，因而認(rèn)為，LT的佐劑效應(yīng)機(jī)制與ADP-核糖基化活性和激發(fā)cAMP產(chǎn)生的能力直接相關(guān)。而Verwei等用LTE112K作佐劑，與HA抗原共鼻免疫小鼠，卻比僅用HA顯著增加了血液中IgG水平和鼻腔粘膜sIgA應(yīng)答，與用野生型LT作佐劑無明顯差異。同樣，其他研究者們還分別證實(shí)了LTK7(A亞單位第7位的精氨酸→賴氨酸)、LTR192G(第192位的精氨酸→甘氨酸)、LTK63(第63位的絲氨酸→賴氨酸)、LTR72(A亞單位丙氨酸-精氨酸)等無或減弱ADP-核糖基化活性的LT突變體及rLTB具有顯著的粘膜免疫佐劑活性；不過，這些結(jié)論均基于鼻免疫。Giuliani認(rèn)為，經(jīng)突變得到得低毒AB復(fù)合物，具有和野生型同樣的廣譜免疫佐劑性，佐劑活性不受免疫途徑、免疫動(dòng)物、共免疫抗原等因素限制，但毒性卻比野生型低得多，在安全范圍內(nèi)。LTR72就是A亞單位72位丙氨酸突變?yōu)榫彼幔w外Y1細(xì)胞上檢測(cè)毒性比野生型低1000倍，但免疫活性卻等同于野生型〔Neidleman JA，VajdyMM，Ugozzoli G，etal.[J].Immunology，2000，101154-160〕、〔Gill Douce.[J].InfectImmun，1999，(9)4400-4406〕。本發(fā)明基因編碼的蛋白即為L(zhǎng)TA72(A-R)和LTB組成，安全無毒，佐劑活性等同于同樣劑量的野生型LT。
目前，LT、LTB作為毒素免疫原或佐劑融合蛋白已在多種系統(tǒng)中表達(dá)。1983年Clements等從大腸桿菌中首先產(chǎn)生LTB〔Clements，J.D.，F(xiàn)lint，D.C.，Engert，R.F.，Klipstein，F(xiàn).A.Infect Immun.1983，40，653〕；Ichikawa等在短芽孢桿菌中表達(dá)重組LTB〔Ichikawa，Y.，Yamagata，H.，Tochikubo，K.and Udaka，S.FEMS Microbial.Left，1993，111，219-224〕；Schonberger等在酵母中表達(dá)LTB〔Schonberger，O.，Hirst，T.R.and Pines，0.Mol.Microbial.1991，5，2663-2671〕；Lauterslager、Chikwamba、Lamphear在煙草、馬鈴薯、玉米中表達(dá)了LTB〔Lauterslager，T.G.，F(xiàn)lorack，D.E.，Van der wal，T.J.，etal.Vaccine，2001，19，2749〕、〔Chikwamba R，Cunnick J，Hathaway D，McMurrayJ，Mason H，Wang K.Transgenic Res，2002，11(5)479-493〕、〔Lamphera BJ etal.Delivery of subunit vaccines in maize seed.J Control Release.2002，85(1-3)169-180〕。Hugn等在馬鈴薯中表達(dá)人工合成的LTB，表達(dá)量為每克塊莖中含4-10微克LTB，每毫升可溶性蛋白提取液中含0.7-1.5微克LTB，以含20或50ug LTB的5g無葉馬鈴薯塊莖飼喂小鼠，產(chǎn)生的血清IgG和sIgA水平與強(qiáng)飼5ug大腸桿菌源的重組LTB相當(dāng)，以25ug的LT攻毒后，可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)〔Hugh S.Mason 11，Tariq A.Haq John D.Clementss and Charles J.gene.1998.Vccine 16(13)1336-1343〕。Birgit等用TMV做載體在煙草中表達(dá)LTB五聚體，每1克新鮮植物材料中含量為75微克，有GM1結(jié)合性，以15ug/鼠經(jīng)鼻免疫，可產(chǎn)生LTB特異性IgG1，與三葉橡膠乳膠過敏原Hevb3鼻腔共免疫小鼠，產(chǎn)生Hevb3特異性IgG1、IgG2，具有佐劑效果〔Birgit Wagner，KarinHufnagl，Christian Radauer，etal.Journal of Immunological Methods 2004 287203-215〕。Kang等在煙草葉綠體中表達(dá)了LTK63，表達(dá)量為可溶性蛋白的3.7％〔Tae-Jin Kang，So-Chon Han，Mi-Young Kim，etal.Protein Expression andPuriWcation 2004，38123-128〕。Rogano等將LTB與結(jié)核抗原融合后在擬南芥中成功得以表達(dá)〔Riggno MM.etal.Plant cell Rep，2004，22(7)502-508〕。
綜合以上所述文獻(xiàn)可以看出將大腸桿菌熱敏毒素基因在植物中表達(dá)均不同程度的存在著表達(dá)量較低、佐劑效果較差、表達(dá)產(chǎn)物有毒性等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的編碼大腸桿菌熱敏毒素基因，該基因能夠在植物中高表達(dá)，所表達(dá)的重組大腸桿菌熱敏毒素或轉(zhuǎn)基因植物可用做免疫佐劑，該免疫佐劑具有效果好、安全、無毒等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因，由NLTA和NLTB兩個(gè)亞單位組成，其中NLTA具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NLTB具有序列表SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明根據(jù)對(duì)植物基因表達(dá)使用的密碼子的統(tǒng)計(jì)分析，選出同一編碼氨基酸時(shí)植物偏愛使用的密碼子，然后在保持大腸桿菌熱敏毒素(Heat-libileEnterotoxin of Escherichia colli)的A亞單位和B亞單位的氨基酸序列不變的情況下，采用植物偏愛的密碼子進(jìn)行反翻譯，同時(shí)屏蔽基因序列中的提前加尾信號(hào)及促mRNA降解的序列，提高基因G+C的百分含量，兼顧不形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)人工合成適合于在植物中高表達(dá)的新的大腸桿菌熱敏毒素A亞單位、B亞單位的基因NLTA和NLTB。與天然LTA、LTB基因序列相比，新的NLTA和NLTB基因打破了原核基因結(jié)構(gòu)與植物基因結(jié)構(gòu)不同的物種界限，采用植物密碼子優(yōu)化的思路設(shè)計(jì)，使之更適合在植物中表達(dá)。
NLTA有如下特點(diǎn)1、777個(gè)堿基對(duì)中改換了206個(gè)，改換率為26.5％。
2、在259個(gè)氨基酸密碼子中，被改變堿基的密碼子有179個(gè)，改變率為69％。
3、在259個(gè)氨基酸密碼子中，包含154個(gè)植物優(yōu)化密碼子，占密碼子總數(shù)的59％，比天然LTA提高82個(gè)，提高了31％。
4、777個(gè)堿基對(duì)中G+C數(shù)目由297個(gè)改換到381個(gè)，G+C含量由38.2％提高到49％。
5、在天然基因中的1個(gè)PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改換，改換率為100％。
6、為使基因操作方便，在除去了基因序列中間的一些主要的顯著性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，增強(qiáng)了合成基因的適用性。
NLTB有如下特點(diǎn)1、375個(gè)堿基對(duì)中改換了107個(gè)，改換率為28.5％。
2、在125個(gè)氨基酸密碼子中，被改變堿基的密碼子有97個(gè)，改變率為78％。
3、在125個(gè)氨基酸密碼子中，包含91個(gè)植物優(yōu)化密碼子，占密碼子總數(shù)的73％，比天然LTB提高45個(gè)，提高了36％。
4、375個(gè)堿基對(duì)中G+C數(shù)目由137個(gè)改換到186個(gè)，G+C含量由36.5％提高到49.6％。
5、在天然基因中的3個(gè)PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改換，改換率為100％。
6、在天然LTB基因中存在的2個(gè)干擾基因表達(dá)和使mRNA不穩(wěn)定的序列(ATTTA)，全部被改換，改換率為100％。
7、為使基因操作方便，在除去了基因序列中間的一些主要的顯著性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，增強(qiáng)了合成基因的適用性。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是構(gòu)建一種能夠在植物中高效表達(dá)NLTA和NLTB核苷酸序列的表達(dá)載體。
一種高效表達(dá)NLTA和NLTB核苷酸序列的植物表達(dá)載體，其構(gòu)建方法的步驟為將所述的NLTA和NLTB核苷酸序列插入植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄起始密碼子之后，即得。
一種優(yōu)選的構(gòu)建方法，步驟如下1)將NLTA和NLTB序列分別插入到植物超表達(dá)元件pTΩ4A中，構(gòu)建中間載體pTΩ4ANLTA和pTΩ4ANLTB；
2)酶切回收Ω4A+NLTA和Ω4A+NLTB片段，將上述片段同時(shí)插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301中，從而構(gòu)建高效植物表達(dá)載體pC234ANLTAB。
植物超表達(dá)元件pTΩ4A是在Puc19的多克隆位點(diǎn)HindIII和EcoRI之間含有兩個(gè)35S增強(qiáng)子、1個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子、1個(gè)Ω序列、1個(gè)Kozak序列、4個(gè)(poly)A和Nos終止子，Ω序列、Kozak序列、4個(gè)(poly)A的作用是增強(qiáng)翻譯。
本發(fā)明所要解決的另外一個(gè)技術(shù)問題是利用上述含有人工合成編碼大腸桿菌熱敏毒素的高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，制備免疫佐劑。
一種免疫佐劑，主要由下述方法制備而成1)用構(gòu)建的包含NLTA和NLTB序列的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物；2)獲得轉(zhuǎn)基因植物。
其中所述構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pC234ANLTAB；轉(zhuǎn)化方法選用農(nóng)桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、胚囊、子房注射法、浸泡轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、電激法、超聲波法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)法等方法。本發(fā)明優(yōu)選農(nóng)桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法或浸泡轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植物，更優(yōu)選使用農(nóng)桿菌浸染法，并從中篩選出能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因工程植株；所述受體植物為紅三葉草、白三葉草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、煙草、馬鈴薯、百脈根或番茄，優(yōu)選為百脈根。
將上述獲得的轉(zhuǎn)基因植物直接與目的抗原混合后直接飼喂動(dòng)物，或?qū)⑺磉_(dá)的重組大腸桿菌熱敏毒素分離、純化后，將其通過混合、融合、化學(xué)偶連、雙價(jià)載體等方式與目的抗原相連，經(jīng)直接飼喂、飲水、點(diǎn)眼、滴鼻、腹腔注射、肌注、十二指腸、皮下注射等途徑免疫動(dòng)物，結(jié)果表明，上述方式均能達(dá)到增強(qiáng)目的抗原免疫應(yīng)答的效果。
本發(fā)明整體技術(shù)方案概述本發(fā)明根據(jù)人源性大腸桿菌熱敏毒素A亞單位(LTA)、B亞單位(LTB)的氨基酸序列，人工優(yōu)化合成適合在植物中高表達(dá)的編碼大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的新的DNA序列NLTA和NLTB；構(gòu)建用于植物的超表達(dá)元件；將已插入該序列的超表達(dá)元件連到植物表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)構(gòu)建植物表達(dá)載體；用該載體轉(zhuǎn)化植物，獲得高水平表達(dá)大腸桿菌熱敏毒素的轉(zhuǎn)基因植株；用抗生素篩選、PCR、Southern blot、Northern blot鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株；測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中大腸桿菌熱敏毒素含量，用ELISA鑒定表達(dá)蛋白的性質(zhì)；繁殖和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株；用不同劑量表達(dá)大腸桿菌熱敏毒素的植株、其蛋白提取液或其他純化物，以不同的方式加牛血清白蛋白(BSA)，以不同的途徑免疫動(dòng)物，證明其有加強(qiáng)免疫的佐劑性。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明編碼大腸桿菌熱敏毒素基因能夠在植物中高表達(dá)重組大腸桿菌熱敏毒素；并且采用植物作為表達(dá)系統(tǒng)，克服了微生物系統(tǒng)不能對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確翻譯后加工和蛋白的糖基化等缺陷，能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化、酰氨化、磷酸化、亞單位的正確裝配等轉(zhuǎn)譯后加工，使表達(dá)產(chǎn)物三維空間結(jié)構(gòu)更趨于自然狀態(tài)，所表達(dá)的大腸桿菌熱敏毒素具有更好的生物活性，能夠有效加強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)。
2)所表達(dá)的重組大腸桿菌熱敏毒素安全、無毒性。


圖1為pCAMBIA2301的質(zhì)粒圖譜。
圖2為植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的構(gòu)建流程示意圖。
圖3為對(duì)照野生型基因植物載體pC234ACKLTAB的構(gòu)建流程示意圖。
圖4為轉(zhuǎn)本發(fā)明基因百脈根Southern blot雜交結(jié)果。
圖4A用LTA做探針檢測(cè)結(jié)果；其中，1為陽性對(duì)照；2～5為轉(zhuǎn)本發(fā)明基因植株；6為陰性對(duì)照。
圖4B用LTB做探針檢測(cè)結(jié)果；其中，1為陰性對(duì)照；2為陽性對(duì)照；3～5為轉(zhuǎn)本發(fā)明基因植株。
圖5為轉(zhuǎn)本發(fā)明基因百脈根Northern blot雜交結(jié)果。
圖5A用LTA做探針檢測(cè)結(jié)果；圖5B用LTB做探針檢測(cè)結(jié)果。
圖6為轉(zhuǎn)本發(fā)明基因百脈根Western blot雜交結(jié)果。
1、陽性對(duì)照；2、陰性對(duì)照；3、轉(zhuǎn)野生型基因植株；4、轉(zhuǎn)本發(fā)明基因植株。
圖7為本發(fā)明基因表達(dá)產(chǎn)物的GM1-ELISA檢測(cè)結(jié)果。
圖8為ELISA檢測(cè)抗BSA血清IgG結(jié)果。
橫坐標(biāo)為血清稀釋度，縱坐標(biāo)為450nm的OD值。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
試驗(yàn)材料1、菌株與載體大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自華美生物公司。
農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)根癌農(nóng)桿菌EHA105購自華美生物公司。
PUC18(Ampr)購自promega公司。
pTΩ4A(Ampr)購自Invitrogene公司。
pCAMBIA2301(Kanr)購自CAMBIA公司。
2、酶和試劑及人工寡聚核苷酸引物限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4DNA連接酶等常用酶類購自NewLand和Takara等公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit和DIG DNA Labeling and Detection Kit購自Roche公司；pfu DNA Polymerase購自天為時(shí)代公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天為時(shí)代科技有限公司；寡聚核苷酸引物由Sangon公司合成；測(cè)序由上?；倒?、申能博彩公司和Bioasia公司完成。
3、生化試劑IPTG、X-Gal、Agar為Sigma公司產(chǎn)品；TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂、SDS、NaOH、NH4NO3KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、肌酸、煙酸、VB6、VB1、甘氨酸、胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、NaCl均購自北京市生化試劑公司。
4、培養(yǎng)基
LB細(xì)菌培養(yǎng)基每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌待用。加1.5％瓊脂配成固體培養(yǎng)基。
藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基每升LB固體培養(yǎng)基中加20mg/mL的X-Gal 40ul和200mg/mL的IPTG 40ul。
YEB培養(yǎng)基每升含胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO40.5g。用NaOH調(diào)至pH至7.5，滅菌后待用。加1.5％瓊脂配成固體培養(yǎng)基。
MS培養(yǎng)基購自sigma公司。
MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA(2mg/l)及IAA(0.5mg/l)。
MS選擇培養(yǎng)基MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素(500mg/l)及卡那霉素(100mg/l)。
MS生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素(500mg/l)或頭孢拉定(500mg/l)+卡那霉素(50mg/l)+IBA(0.1mg/ml)。
5、植物豆科牧草百脈根“里奧”6、儀器常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)來自sigma公司；凝膠成像儀、電泳儀購自Bio-Rad公司。
本發(fā)明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTA和NLTB的制備根據(jù)Internet上公布的coden usage數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)出植物偏愛使用密碼子，然后再利用生物軟件DNASTAR，在保持大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的氨基酸序列不變的情況下，采用植物偏愛的密碼子進(jìn)行反翻譯、同時(shí)屏蔽基因序列中的植物多聚腺核苷酸信號(hào)序列(PPSS)(AATAAA、AATAAT)及促mRNA降解的序列(ATTTA)，提高基因的G+C％，避免15～30個(gè)堿基對(duì)中A+T％＞80％，避免在10個(gè)堿基對(duì)中出現(xiàn)4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)A或T，避免連續(xù)A+T或G+C多于5個(gè)，避免一些酶切位點(diǎn)，同時(shí)兼顧不形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)適合于在植物中高表達(dá)的新的編碼大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的NLTA序列(SEQ ID NO.1)、NLTB序列(SEQ ID NO.2)。
NLTA、NLTB序列再由大連寶生物公司合成后連在載體PUC18的PstI和XhoI之間構(gòu)成PUC18NLTA、PUC18NLTB。
構(gòu)建高效植物表達(dá)載體pC234ANLTAB及對(duì)照野生型表達(dá)載體pC234ACKLTAB2.1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備1)取在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體菌DH5α單菌落，接種于5ml B液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜(200r/min)；2)1％接種量轉(zhuǎn)接到100ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，300r/min搖約3hr，可通過測(cè)量OD600值(0.4～0.6)來檢測(cè)培養(yǎng)物生長(zhǎng)狀況；3)在無菌條件下，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，在冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃；4)4℃，4000rpm，離心10min，回收菌體細(xì)胞，除盡培養(yǎng)液；5)用10ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀，放置于冰上30min；6)4℃，4000rpm，離心10min，回收細(xì)胞，除盡培養(yǎng)液，5、6步驟可重復(fù)一次；7)50ml初始培養(yǎng)物，用1ml冰預(yù)冷的0.2M CaCl2和1ml 30％甘油，重懸每份細(xì)胞沉淀；8)每管200ul分裝，置于液氮中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2大腸桿菌的轉(zhuǎn)化在200ul的DH5a感受態(tài)菌中分別加入2ul質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上放置30min；42℃熱激90秒，快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻5min；每管加800ul LB培養(yǎng)基，于37℃搖床(200r/min)溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇；在超凈臺(tái)中將約600ul菌液轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，均勻涂板，待液體吸收后，倒置平皿，37℃培養(yǎng)12-16hr。
2.3堿裂解法小量提取PUC18NLTA、PUC18NLTB、PUC18CKLTA、PUC18CKLTB質(zhì)粒DNA[參見《分子克隆》]。
2.4酶切和回收在50ul酶切體系中加入5ul質(zhì)粒PUC18NLTA、PUC18NLTB、5ul10×buffer、PstI和XhoI(購自大連寶生物公司)各2ul，其余用雙蒸水補(bǔ)齊，混勻后37℃放置4小時(shí)，然后在1％瓊脂糖凝膠中150V電泳，紫外燈下切下回收大小NLTA(800bp)、NLTB(400bp)左右的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司)回收，離心管中的液體即是純化的產(chǎn)物，取1ul電泳，檢測(cè)并目測(cè)定量。
在50ul酶切體系中加入5ul質(zhì)粒PUC18CKLTA、PUC18CKLTB(購自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所)、5ul10×buffer、PstI和XhoI(購自大連寶生物公司)各2ul，其余用雙蒸水補(bǔ)齊，混勻后37℃放置4小時(shí)，然后在1％瓊脂糖凝膠中150V電泳，紫外燈下切下回收大小CKLTA(800bp)、CKLTB(400bp)左右的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司)回收，離心管中的液體即是純化的產(chǎn)物，取1ul電泳，檢測(cè)并目測(cè)定量。
2.5連接、轉(zhuǎn)化、鑒定同時(shí)，用PstI和XhoI雙酶切pTΩ4A，回收約2.9Kb片段，分別在10ul連接體系中加入1ul回收的NLTA、NLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×連接buffer，1ulT4DNA連接酶(購自大連寶生物公司)，其余用ddH2O補(bǔ)齊，置于16℃低溫水浴鍋中12小時(shí)后，在轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定，正確的即為中間載體pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB。同樣的方法，用HindIII和EcoRI(購自大連寶生物公司)雙酶切pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB，回收Ω4ANLTA(2.1Kb)、Ω4ANLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA連接酶將Ω4ANLTA片段插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301(購自CAMBIA公司，見圖1)的HindIII和EcoRI之間中間載體pC234ANLTA，在用EcoRI酶切pC234ANLTA，乙醇沉淀，KlnowI(購自TAKARA公司)補(bǔ)平。同樣的方法，補(bǔ)平Ω4ANLTB兩端，10ul體系中T4連接酶補(bǔ)平的兩個(gè)片段，構(gòu)建從而構(gòu)建高效植物表達(dá)載體pC234ANLTAB(見圖2)，做酶切、PCR、測(cè)序鑒定。
同樣的方法，用PstI和XhoI雙酶切pTΩ4A回收約2.9Kb片段，分別在10ul連接體系中加入1ul回收的CKLTA、CKLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×連接buffer，1ulT4DNA連接酶(購自大連寶生物公司)，其余用ddH2O補(bǔ)齊，置于16℃低溫水浴鍋中12小時(shí)后，在轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定，正確的即為中間載體pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，同樣的方法，用HindIII和EcoRI(購自大連寶生物公司)雙酶切pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，回收Ω4ACKLTA(2.1Kb)、Ω4ACKLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA連接酶將Ω4ACKLTA片段插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301(購自CAMBIA公司，見圖3)的HindIII和EcoRI之間中間載體pC234ACKLTA，在用EcoRI酶切pC234ACKLTA，乙醇沉淀，KlnowI(TAKARA公司)補(bǔ)平，同樣的方法，補(bǔ)平Ω4ACKLTB兩端，10ul體系中T4連接酶補(bǔ)平的兩個(gè)片段，構(gòu)建野生型對(duì)照表達(dá)載體pC234ACKLTAB(見圖3)，做酶切、PCR、測(cè)序鑒定。
2.6農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化百脈根及鑒定2.6.1農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化1)挑取單菌落EHA105接種于5ml YEB(加利福平100mg/l)液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜；2)取2ml菌液轉(zhuǎn)入50ml YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5；3)轉(zhuǎn)入無菌離心管，冰浴30min，5000r/min離心5min，去上清液；4)加入2ml 20mM CaCl2重懸菌體；5)每管200ul分裝于無菌Eppendorf管中，于4℃保存；6)取20ug提取純化的重組pC234ANLTAB、pC234ACKLTAB質(zhì)粒DNA，分別加入200ul感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；7)冰浴5min，轉(zhuǎn)入液氮冷凍8min，迅速置37℃水浴5min；8)加入800ul YEB液體培養(yǎng)基，28℃，200r/min預(yù)表達(dá)4-5hr；9)將菌液移至YEB固體選擇培養(yǎng)基(含卡那霉素100mg/l，利福平100mg/l)表面，均勻涂布于整個(gè)平板，28℃培養(yǎng)1-2天。
10)挑取轉(zhuǎn)化后單菌落，接種于5ml含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2天，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用酶切或PCR方法鑒定。
2.6.2百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化1)取百脈根種子75％酒精消毒后種在MS0培養(yǎng)基上發(fā)芽；2)剪取10日齡的百脈根子葉放在農(nóng)桿菌菌液(OD600≈0.5)中浸泡5min或用基因槍轟擊；3)用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入表面鋪一層濾紙的MS固體基本培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)；4)三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中進(jìn)行培養(yǎng)(25℃，鎢燈3000mol.m-2.s-1，光照周期為16hr光照/8hr黑暗)；5)待抗性芽生長(zhǎng)至2～3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中誘導(dǎo)生根。由于幼苗生根時(shí)對(duì)卡那霉素非常敏感，此時(shí)適當(dāng)提高Kan的濃度至100-125g/ml，以降低轉(zhuǎn)化體假陽性出現(xiàn)的頻率，從而減少后續(xù)篩選工作量。
2.6.3轉(zhuǎn)基因百脈根的分子生物學(xué)鑒定2.6.3.1轉(zhuǎn)基因植株的DNA提取1)取2g百脈根葉片，加入液氮充分研磨后，將粉末倒入50ml離心管中；2)待離心管中液氮揮發(fā)完全后，加入適量DNA提取Buffer(4ml/g)，充分混勻后(可適當(dāng)加熱)，室溫下充分抽提10～15min；3)加入0.5倍體積苯酚，抽提5～10min；再加入0.5倍體積氯仿，繼續(xù)抽提10～15min；4)3,750rpm，室溫離心20min；5)吸取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動(dòng)離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，可見白色絮狀DNA；6)將DNA沉淀挑入新的1.5ml離心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗滌沉淀；7)沉淀干燥后加入0.5ml TE(含終濃度50mg/ml的RNaseA)溶解，37℃消化RNA 0.5～1hr；8)等體積苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；9)上清加入1/10倍體積3M NaAc(pH5.2)和2-2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，于-20℃放置30min，12,500rpm，4℃離心15min，棄上清；10)70％乙醇洗滌DNA沉淀，干燥后溶于適量TE或水中；11)取少許DNA，瓊脂糖凝膠上檢查其質(zhì)量并進(jìn)行DNA量的標(biāo)定，其余DNA樣品保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.6.3.2Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因植株按照《分子克隆》所提供的方法進(jìn)行Southern雜交，Southern blot結(jié)果如圖4。雜交結(jié)果說明，本發(fā)明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTAB已成功的整合到受體植物百脈根中。
2.6.3.3Nouthern雜交按照《分子克隆》所提供的方法進(jìn)行Northern雜交，轉(zhuǎn)基因百脈根Northernblot結(jié)果如圖5。Northern雜交說明，本發(fā)明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTAB已在受體植物百脈根中得到表達(dá)。
檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中蛋白的表達(dá)量測(cè)定及活性檢測(cè)3.1提取轉(zhuǎn)基因植物中的可溶性蛋白取100mg轉(zhuǎn)本發(fā)明基因和非轉(zhuǎn)基因植物材料，用液氮研成粉末，加100ul可溶性總蛋白提取液TBSP(10mM Tris-Cl，0.02％NaCl，0.001％PMSF，pH 8.0)，再研磨5min，4℃放置20分鐘后把勻漿倒入離心管中，12000rpm，離心5min，上清即為提取物。
3.2Bradford測(cè)定總蛋白含量按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》所提供的方法進(jìn)行Bradford法測(cè)蛋白含量，結(jié)果為轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液，其可溶性總蛋白含量為13ug/ul，轉(zhuǎn)野生型大腸桿菌熱敏毒素基因pC234ACKLTAB載體的百脈根蛋白提取液，其可溶性總蛋白含量為10ug/ul。
3.3Western blot鑒定轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的大腸桿菌熱敏毒素3.3.1試劑標(biāo)準(zhǔn)重組LTB蛋白和兔抗CT血清購自sigma，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和其他試劑購自promega等公司3.3.2轉(zhuǎn)基因植株中大腸桿菌熱敏毒素蛋白的檢測(cè)按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法進(jìn)行，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)積層膠為5％，分離膠為15％，電壓為130V，上樣量為20ul蛋白提取液，設(shè)20ul(0.1ug/ul)標(biāo)準(zhǔn)重組LTB設(shè)為陽性對(duì)照，20ul非轉(zhuǎn)基因百脈根可溶性總蛋白提取液為陰性對(duì)照，20ul轉(zhuǎn)野生型大腸桿菌熱敏毒素基因pC234ACKLTAB載體的百脈根可溶性總蛋白提取液，20ul轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為樣品電泳，蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，電泳結(jié)束后立即進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，條件為30V，90mA，4℃過夜電轉(zhuǎn)，結(jié)束后用麗春紅染色，標(biāo)出分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的位置，用5％脫脂奶粉封閉，一抗為sigma提供抗CT的兔血清，800倍稀釋，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔的IgG，2000倍稀釋，BCIP/NBT顯色，照像，結(jié)果如圖6。
陽性對(duì)照在11.6KD有特異性條帶，轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液、轉(zhuǎn)野生型對(duì)照表達(dá)載體pC234ACKLTAB的百脈根蛋白提取液都在29KD、11.6KD有特異性帶，而陰性對(duì)照則無特異條帶，說明本發(fā)明血凝素蛋白基因已在植株中表達(dá)。
3.4ELISA測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中大腸桿菌熱敏毒素的蛋白量設(shè)標(biāo)準(zhǔn)LTB為陽性對(duì)照，野生型非轉(zhuǎn)基因百脈根可溶性蛋白提取液為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為測(cè)定樣本1，轉(zhuǎn)野生型表達(dá)載體pC234ACKLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為測(cè)定樣本2。
3.4.1試劑標(biāo)準(zhǔn)重組LTB蛋白和兔抗CT血清購自sigma，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和其他試劑購自promega等公司1)包被緩沖液(pH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液)NaCO31.59克、NaHCO32.93克加蒸餾水至1000ml。
2)洗滌緩沖液(pH7.4 PBST)KH2PO40.6克、Na2HPO4·2H2O2.9克、NaCl8.0克、KCl0.2克、Tween-200.05％0.5ml加蒸餾水至1000ml。
3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩沖液至100ml。
4)終止液(2M H2SO4)蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。
5)底物緩沖液(pH5.0磷酸/檸檬酸)2M Na2HPO4(28.4克/L)25.7ml、0.1M檸檬酸(19.2克/L)24.3ml、加蒸餾水50ml。
6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml、底物緩沖液(pH5.5)10ml、0.75％H2O232ul。
3.4.2器材1)聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50ul及100ul加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
3.4.3操作步驟1)包被用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10ug/ml，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。
2)加樣加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)，然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔(非轉(zhuǎn)基因植物的蛋白)及陽性對(duì)照孔。
3)加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。
4)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6)結(jié)果判定在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。
7)用標(biāo)準(zhǔn)陽性LTB蛋白不同量(mg)稀釋梯度為橫坐標(biāo)，以450nm OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性百脈根可溶性蛋白提取液進(jìn)行同樣條件下OD值，計(jì)算出大腸桿菌熱敏毒素的含量。
結(jié)果見表1表1 轉(zhuǎn)基因百脈根細(xì)織中大腸桿菌熱敏毒素的表達(dá)量

注樣本0為陰性對(duì)照結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白含量占植物可溶性總蛋白的0.6％，轉(zhuǎn)對(duì)照表達(dá)載體pC234ACKLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白含量占植物可溶性總蛋白的僅為0.01％，本發(fā)明基因可在植物中高表達(dá)，與野生型基因相比，其表達(dá)量提高了近60倍。
3.5GM1-ELISA檢測(cè)GM1結(jié)合性GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂(購自sigma公司)，用GM1、BSA包被，方法參照上。結(jié)果如圖7。
結(jié)果表明，轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白有GM1結(jié)合活性。
轉(zhuǎn)基因植物的繁殖和培育篩選出穩(wěn)定表達(dá)大腸桿菌熱敏毒素的轉(zhuǎn)基因百脈根后，通過常規(guī)組織培養(yǎng)方法擴(kuò)繁，然后將這些幼苗轉(zhuǎn)入田間繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因百脈根。
轉(zhuǎn)本發(fā)明基因百脈根的免疫佐劑效果試驗(yàn)5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只7周齡BALB/c雌性小鼠，體重16～22g，分為4組，每組6只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。
5.2試驗(yàn)材料1)PBS溶液(pH7.2)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，蒸餾水定容1L，調(diào)pH值7.2。
2)50ug/30ul牛血清白蛋白(BSA≥99.9％)(購自sigma公司)BSA溶于pH7.2的磷酸緩沖鹽液(PBS)中，4℃，8000g，離心20min，取上清，濾膜過濾，配成50ug/30ul的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)含BSA50ug的各種百脈根可溶性總蛋白提取液30ul蛋白提取液中加入BSA50ug，溶解混勻。
5.3試驗(yàn)方法小鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只，以非免疫鼠血清作為0組，30ulPBS經(jīng)鼻免疫的小鼠組為第1組、30ul含BSA50ug的PBS經(jīng)鼻免疫的小鼠組為第2組、30ul含BSA50ug加非轉(zhuǎn)基因百脈根可溶性蛋白提取液經(jīng)鼻免疫的小鼠組為第3組、30ul含BSA50ug加轉(zhuǎn)野生型表達(dá)載體pC234ACKLTAB百脈根可溶性蛋白提取液經(jīng)鼻免疫的小鼠組為第4組，30ul含BSA50ug加轉(zhuǎn)本發(fā)明植物表達(dá)載體pC234ANLTAB百脈根可溶性蛋白提取液經(jīng)鼻免疫的小鼠組為第5組，在0、7、14天各經(jīng)鼻腔免疫小鼠，21天后頸動(dòng)脈采血，ELISA檢測(cè)抗體水平。
ELISA檢測(cè)抗體方法用含50ul BSA(30ug/ml)、碳酸鹽50mM，pH9.6的包被緩沖液包被96孔玻板過夜，再用PBS-Tween20清洗緩沖液洗3次，用1％明膠封閉板，清洗后每孔中加入稀釋樣品50ul，室溫溫育過夜，再用清洗緩沖液清洗，加入50ul800倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體(購自sigma公司)，室溫放置2小時(shí)，清洗后，50ulTMB-H2O2(購自Bio-rid公司)顯色30min，1MH2SO410ul終止，405nm檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。
試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因百脈根的可溶性蛋白提取液作為佐劑免疫小鼠，其血清中抗BSA血清IGg顯著升高，證明本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物有增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，具有良好的免疫佐劑效果。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，深圳市農(nóng)科集團(tuán)公司<120>編碼大腸桿菌熱敏毒素基因及其表達(dá)載體和用途<130>fm003<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>777<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>artificial<400>1atgaagaaca tcactttcat cttcttcatc ctcctcgctt ctccactcta cgctaacggt 60gacaagctct acagggctga ttctaggcca ccagatgaga tcaagaggtc tggtggtctc120atgccaaggg gtcataacga gtacttcgat aggggtactc agatgaacat caacctctac180gatcatgcta ggggtactca aactggtttc gtgaggtacg atgatggtta cgtgtctact240tctctctctc tcaggtctgc tcatctcagg ggtcaatcta tcctctctgg ttactctact300tactacatct acgtgatcgc tactgctcca aacatgttca acgtgaacga tgtgctcggt360gtgtactctc cacatccata cgagcaagag gtgtctgctc tcggtggtat cccatactct420cagatctacg gttggtacag ggtgaacttc ggtgtgatcg atgagaggct ccataggaac480agggagtaca gggataggta ctacaggaac ctcaacatcg ctccagctga ggatggttac540aggctcgctg gtttcccacc agatcatcag gcttggaggg aggagccatg gatccatcat600gctccacaag gttgcggtaa ctcttctagg actatcactg gtgatacttg caacgaggag660actcagaacc tctctactat ctacctcagg aagtaccaat ctaaggtgaa gaggcagatc720ttctctgatt accaatctga ggtggacatc tacaacagga tcaggaacga gctctaa 777<210>2<211>375<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>artifical<400>2atgaacaagg tgaagttcta cgtgctcttc accgctctcc tctcttctct ctgcgctcat60ggtgctccac agtctatcac cgagctctgc tctgagtacc ataacaccca gatctacacc 120atcaacgata agatcctctc ttacaccgag tctatggctg gtaagaggga gatggtgatc 180atcaccttca agtctggtgc taccttccag gtggaggtgc caggttctca gcatatcgat 240tctcagaaga aggctatcga gaggatgaag gataccctca ggatcaccta cctcaccgag 300accaagatcg ataagctctg cgtgtggaac aacaagaccc caaactctat cgctgctatc 360tctatggaga aactaa 37權(quán)利要求
1.一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因NLTA，其特征是具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因NLTB，其特征是具有序列表中SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
3.包含權(quán)利要求1和2所述基因的植物表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其特征是所述的植物表達(dá)載體是pC234ANLTAB。
5.權(quán)利要求3所述植物表達(dá)載體的應(yīng)用方法，包括如下步驟將權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體植物中，獲表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征是所述的植物表達(dá)載體是pC234ANLTAB；所述的轉(zhuǎn)化方法選自農(nóng)桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法或浸泡轉(zhuǎn)化法；所述的受體植物選自紅三葉草、白三葉草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、煙草、馬鈴薯、百脈根或番茄。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征是所述的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌浸染法；所述的受體植物為百脈根。
8.一種免疫佐劑，其特征是由權(quán)利要求5～7任一所述應(yīng)用方法制備得到的產(chǎn)品。
9.權(quán)利要求1所述的基因在制備免疫佐劑中的用途。
10.權(quán)利要求2所述的基因在制備免疫佐劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的編碼大腸桿菌熱敏毒素的基因NLTAB以及該基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及表達(dá)。根據(jù)人源性大腸桿菌熱敏毒素的氨基酸序列，采用密碼子優(yōu)化原則設(shè)計(jì)，人工合成新的編碼大腸桿菌熱敏毒素(A亞單位、B亞單位)的基因－NLTA、NLTB；構(gòu)建高表達(dá)上述基因的重組植物表達(dá)載體pC234ANLTAB；獲得高表達(dá)大腸桿菌熱敏毒素的轉(zhuǎn)基因植株；動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)本發(fā)明基因植株能有效加強(qiáng)共免疫抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有良好的免疫佐劑效果。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1861792SQ200510068058
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者吳燕民, 唐益雄, 劉建利, 盧運(yùn)明 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 深圳市農(nóng)科集團(tuán)公司