專利名稱：產(chǎn)堿桿菌及其在降解甲胺磷中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌，尤其是一種產(chǎn)堿桿菌及其在降解甲胺磷中的應用。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應用已有多年歷史，其中有較早的活性污泥法處理工業(yè)廢水以及近20年來發(fā)展起來的生物修復技術(shù)。微生物可降解的污染物種類大致可分為多環(huán)芳烴(PAHs)、有機染料和顏料、表面活性劑、農(nóng)藥、酚類和鹵代烴等。目前，應用生物降解原理治理被污染的環(huán)境所具有的潛在優(yōu)勢得到了廣泛認可。它不僅經(jīng)濟、安全，而且所能處理的污染物閾值低、殘留少，其應用前景看好。
在有機污染物的高效降解菌方面，國內(nèi)有不少單位獲得了不同有機污染物相應需要的降解菌株，有些已成功地開發(fā)應用。例如，中國農(nóng)業(yè)科學院原子能所陳明等人(2000年)從工業(yè)廢水污染的水體和污泥中分離篩選到6株對氯苯和苯酚類有機污染物高濃度耐受力和不同程度降解能力的細菌菌株；中山大學曾鋒等人(2001年)從處理石化廠廢水的活性污泥中分離出一株鄰苯二甲酸酯降解菌FS1(Pseudomonas fluorescens FS1)；中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所李秋芬等人(2001年)篩選到蝦池有機污染物降解菌10株，對養(yǎng)殖對蝦沒有致病作用，且其中6株可提高仔蝦的成活率；中國科學院微生物研究所賈省芬等(2000年)從城市污水及工業(yè)廢水中分離選育出一種高效多功能混合菌群，包括芽孢桿菌7株、其他細菌6株和酵母7株等；華南理工大學化工學院侯軼等(1999年)分離到1株能有效降解硝基苯的枯草芽孢桿菌，直接用好氧技術(shù)就可將廢水完全無害化；張志杰等(2000)人從處理廢水的活性污泥中分離出2株萘降解菌和1株吡啶降解菌，經(jīng)微生物共代謝能促進難降解有機物的降解，當三者協(xié)同作用時效果最好；南開大學蔡寶立等(1998年)從工業(yè)污水中分離到5個能以苯甲酸為唯一碳源和能源的細菌菌株；安徽農(nóng)業(yè)大學章健等人(1997年)從長期受苯胺污染的土壤中篩選到2株對苯胺降解能力很強的細菌；李淑彬等(1999年)報道分離到一株能高效降解有機磷農(nóng)藥甲胺磷的假單胞菌；劉玉煥等(2000)從被有機磷污染的土壤中分離到能降解甲胺磷的曲霉M-2和降解樂果活性較高的華麗曲霉Z58；莊鐵誠等(2000)的研究結(jié)果表明，飽受工農(nóng)業(yè)和生活污水污染的紅樹林土壤中存在著降解甲胺磷的優(yōu)勢細菌種群；黃志勇等(1999)從印染廠污泥鐘分離到一株沼澤紅假單胞菌H3，該菌對酸性紅B2GL染料有很強的厭氧脫色和降解作用；李惠蓉等分離到的一株白腐真菌OGC101對偶氮染料、噻嗪染料、酞菁染料等染料大類均具有廣譜且有效的降解能力；曹孟德等從印染廢水污染環(huán)境中分離到一株對偶氮染料活性艷紅X-3B駝色的氣單孢菌RD2。
甲胺磷是一種水溶性的廣譜、劇毒的有機農(nóng)藥，化學名稱為O，S-二甲基胺基硫代磷酰胺。該農(nóng)藥具有胃毒、觸殺和內(nèi)吸作用，用于防治多種害蟲，在農(nóng)業(yè)上廣為施用。1964年，由西德和美國相繼開發(fā)了甲胺磷。近年來，隨著有機氯農(nóng)藥的禁用，甲胺磷的用量迅速上升，已成為我國目前用量最大的農(nóng)藥品種之一。1996年用量已達到6萬噸，占殺蟲劑總量的21.4％，位居諸多殺蟲劑之首(華小梅，1996)。人們在大量使用其防治蟲害的同時，致使糧食、蔬菜等的農(nóng)藥殘留超標，甲胺磷農(nóng)藥中毒事件及職業(yè)性中毒病例相繼增加(Bellis，1994；Sundaranc，1993)。并且，大量排放的甲胺磷農(nóng)藥的生產(chǎn)廢水，其有機磷濃度高、組分復雜、生物降解性差、生化處理效應低，造成土壤、水體環(huán)境污染，生態(tài)平衡破壞。它現(xiàn)已成為我國優(yōu)先監(jiān)測的十大農(nóng)藥品種之一(江希流，1993)。因此，應加強對其降解的研究。在生態(tài)系統(tǒng)中，微生物的代謝類型多，具有很強的生化適應能力，能較快地產(chǎn)生相應酶系來利用各類人工合成的農(nóng)藥作為碳、氮源生長，并常能完全降解成無機物，這些都是其它途徑無法比擬的。微生物對農(nóng)藥的分解作為一種有效的環(huán)境治理措施，在消除污染、凈化環(huán)境方面具有重要現(xiàn)實意義(阮少江，2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)，并且人為轉(zhuǎn)入卡納(Kn)抗性的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒做為生物標記，可以在開放環(huán)境降解過程中隨時檢測該菌株的豐度。
本發(fā)明的另一目的在于提供產(chǎn)堿桿菌在降解甲胺磷中的應用。
本發(fā)明提供一株產(chǎn)堿桿菌，為Alcaligenes sp.LY-5，已于2005年4月1日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM205027。
本發(fā)明所提供的細菌Alcaligenes sp.LY-5經(jīng)16srDNA序列分析為產(chǎn)堿桿菌，并且被轉(zhuǎn)入卡納(Kn)抗性的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒作為生物標記，具有Kn抗性和誘導劑異丙基-Beta-D-硫代半乳糖苷(ITPG)誘導的GFP表達能力，可在熒光顯微鏡下檢測到其發(fā)光現(xiàn)象，可以在開放環(huán)境降解過程中隨時檢測該細菌的豐度。
產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.LY-5可以以甲胺磷為唯一營養(yǎng)源，將甲胺磷降解為磷酸根形式并且與環(huán)境中的重金屬源形成磷酸鹽沉淀，一次達到減毒和除磷的作用。用產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.LY-5降解甲胺磷時，液體培養(yǎng)基的組成為NaCl 0.2g，KCl 0.2g，無水MgSO40.2g，MnCl20.2g，NH4NO31.0g，純凈水1000mL，pH＝7.0。甲胺磷1g。
將甲胺磷降解為無毒的磷酸根形式可通過高效液相色譜儀(HPLC)和NMR檢測。
產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.LY-5的選育方法如下1.降解菌的采集沿三明市沙溪污染河段周圍的農(nóng)藥廠的排污口、生化池等區(qū)段，共6個采樣點①福建省三明化工廠總排污口(簡稱三化總口)污泥；②渣廠NaCl堆積池污泥；③生化池一級及二級池混合污水；④福建省三明市磷排污口(簡稱黃磷口)污水；⑤生化池污泥；⑥渣廠滲濾液。
2.甲胺磷降解菌的馴化與分離取土樣5g或水樣10ml，分別接種入80ml甲胺磷濃度為100mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37℃，120r/min搖床培養(yǎng)一周后，取10ml接入甲胺磷濃度為200mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以后每周接種一次，逐步提高甲胺磷濃度，依次為400mg/L、800mg/L，并在800mg/L的濃度條件下再培養(yǎng)一周。
在含有800mg/L甲胺磷的LB固體培養(yǎng)基平板上涂布菌液。37℃溫箱中培養(yǎng)，挑出單菌落再劃線培養(yǎng)，直至沒有雜菌出現(xiàn)。
3.甲胺磷降解的檢測高效液相色譜儀(HPLC)條件Varian Prostar210高效液相色譜儀，C18反相柱(150×4.6mm)，流動相為20％甲醇，80％水；檢測范圍210-300nm，監(jiān)測波長為215nm。
磷譜Varian UNITY+500核磁共振儀，將挑取的單菌落接種入裝有5ml富集培養(yǎng)基(甲胺磷含量為500mg/L)的螺口試管，置于37℃，120r/min搖床培養(yǎng)過夜，每株按照10％的接種量，接入甲胺磷含量為1000mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(20ml)，置于37℃，120r/min搖床，10min后取出菌液0.5ml，離心(3000rpm，10min)后，.取上清用于HPLC檢測，以后每隔3天，取一次樣品，進行HPLC檢測，同時將以上的離心菌液上清取0.5mL用于500兆核磁進行磷譜分析。
4、結(jié)果HPLC檢測結(jié)果表明，篩選出14株甲胺磷降解細菌對于甲胺磷的降解效能都比較高，在培養(yǎng)4，7，14天后對甲胺磷平均降解率分別為67.6％、81.1％和85.9％。對樣品進行同步的磷譜分析，發(fā)現(xiàn)隨著色譜中甲胺磷峰面積的減弱，磷譜中甲胺磷42.6ppm處的峰也逐漸減弱，并向低場漂移，在10ppm，24ppm和1ppm處出現(xiàn)新的峰。不同的菌株降解甲胺磷后產(chǎn)物的磷譜峰不完全相同，14株菌株可分為3種類型(A，B，C)。降解一周后的核磁結(jié)果見圖1。
選取可以把甲胺磷降解為磷酸根的A組的三株細菌中降解力最高的一株，進行16sRNA測序分析，發(fā)現(xiàn)其為產(chǎn)堿桿菌屬細菌。對該細菌轉(zhuǎn)入廈門大學細胞腫瘤重點實驗室構(gòu)建的GFPxm18質(zhì)粒，使其產(chǎn)生Kn抗性，并且通過誘導劑(ITPG)誘導，在低溫17℃下培養(yǎng)，可在熒光顯微鏡下檢測到其發(fā)光現(xiàn)象。
該菌株降解過程中的搖床培養(yǎng)階段(14天)結(jié)束后，靜置一周左右，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中出現(xiàn)細小的晶體。對其進行X射線衍射分析，得知其為MnHPO4晶體。該晶體為正交晶系，空間型P2(1)，晶包參數(shù)為a＝11.234(5)nm，b＝6.145(3)nm，c＝6.948(3)nm；α＝90deg；β＝90deg，γ＝90deg.Z＝4?？梢娖渑囵B(yǎng)基中的Mn離子可以用于降解甲胺磷產(chǎn)生的磷酸根離子結(jié)合沉淀，達到初磷的效果。


圖1為3組細菌一周的降解甲胺磷的磷譜結(jié)果。
具體實施例方式
取我們構(gòu)建的Kn抗性產(chǎn)堿桿菌，在開放環(huán)境中進行模擬的甲胺磷降解實驗。取3組2L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中第一組加入甲胺磷2g，不人為接種任何細菌，作為對照組，第二組加入2g甲胺磷和20ml我們構(gòu)建的Kn抗性產(chǎn)堿桿菌培養(yǎng)液，第三組在第二組的基礎(chǔ)再加入20ml的20g土壤的浸出液。通氣培養(yǎng)，每2天取樣，分別通過HPLC和涂板檢測其甲胺磷降解率和細菌生長量(無抗性平板中的菌落數(shù)/Kn抗性平板中的菌落數(shù))。檢測8天，結(jié)果如下表所示。并且取第二天的工作菌液，加入IPTG低溫誘導培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下檢測到發(fā)光現(xiàn)象。通過以上實驗可以證實，我們的細菌在開放環(huán)境中保持其甲胺磷降解活性，且為含有較高甲胺磷濃度的水環(huán)境中的絕對優(yōu)勢菌種，當甲胺磷壓力解除后，其優(yōu)勢消失，環(huán)境中菌株分布趨于正常。
甲胺磷降解率 (％)

生長量 (菌數(shù)/105)

權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)堿桿菌，為Alcaligenes sp.LY-5，已于2005年4月1日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM205027。
2.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)堿桿菌，其特征在于經(jīng)16srDNA序列分析為產(chǎn)堿桿菌，并且被轉(zhuǎn)入卡納抗性的綠色熒光蛋白質(zhì)粒作為生物標記，具有Kn抗性和誘導劑異丙基-Beta-D-硫代半乳糖苷誘導的綠色熒光蛋白表達能力，可在熒光顯微鏡下檢測到其發(fā)光現(xiàn)象，可以在開放環(huán)境降解過程中隨時檢測該細菌的豐度。
3.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)堿桿菌，其特征在于以甲胺磷為唯一營養(yǎng)源，將甲胺磷降解為磷酸根形式并且與環(huán)境中的重金屬源形成磷酸鹽沉淀，一次達到減毒和除磷的作用。
4.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)堿桿菌，其特征在于用產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.LY-5降解甲胺磷時，液體培養(yǎng)基的組成為NaCl 0.2g，KCl 0.2g，無水MgSO40.2g，MnCl20.2g，NH4NO31.0g，純凈水1000mL，pH＝7.0，甲胺磷1g。
5.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)堿桿菌，其特征在于產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.LY-5的選育方法如下1).降解菌的采集沿三明市沙溪污染河段周圍的農(nóng)藥廠的排污口、生化池等區(qū)段，共6個采樣點①福建省三明化工廠總排污口污泥；②渣廠NaCl堆積池污泥；③生化池一級及二級池混合污水；④福建省三明市磷排污口污水；⑤生化池污泥；⑥渣廠滲濾液；2).甲胺磷降解菌的馴化與分離取土樣5g或水樣10ml，分別接種入80ml甲胺磷濃度為100mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37℃，120r/min搖床培養(yǎng)一周后，取10ml接入甲胺磷濃度為200mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以后每周接種一次，逐步提高甲胺磷濃度，依次為400mg/L、800mg/L，并在800mg/L的濃度條件下再培養(yǎng)一周；在含有800mg/L甲胺磷的LB固體培養(yǎng)基平板上涂布菌液.37℃溫箱中培養(yǎng)，挑出單菌落再劃線培養(yǎng)，直至沒有雜菌出現(xiàn)；3).甲胺磷降解的檢測高效液相色譜儀條件Varian Prostar210高效液相色譜儀，C18反相柱，流動相為20％甲醇，80％水；檢測范圍210-300nm，監(jiān)測波長為215nm；磷譜Varian UNITY+500核磁共振儀，將挑取的單菌落接種入裝有5ml富集培養(yǎng)基，甲胺磷含量為500mg/L的螺口試管，置于37℃，120r/min搖床培養(yǎng)過夜，每株按照10％的接種量，接入甲胺磷含量為1000mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃，120r/min搖床，10min后取出菌液0.5ml，離心后，取上清用于HPLC檢測，以后每隔3天，取一次樣品，進行HPLC檢測，同時將以上的離心菌液上清取0.5mL用于500兆核磁進行磷譜分析。
全文摘要
產(chǎn)堿桿菌及其在降解甲胺磷中的應用，涉及一種細菌，提供一株產(chǎn)堿桿菌以及在降解甲胺磷中的應用。產(chǎn)堿桿菌為Alcaligenes sp.LY－5，保藏編號為CCTCC NOM205027。以甲胺磷為唯一營養(yǎng)源，將甲胺磷降解為磷酸根形式并且與環(huán)境中的重金屬源形成磷酸鹽沉淀，一次達到減毒和除磷的作用。
文檔編號C12N1/21GK1687402SQ20051007452
公開日2005年10月26日 申請日期2005年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月25日
發(fā)明者趙玉芬, 路楊, 紀思遙, 黃耀堅, 許鵬翔 申請人:廈門大學