專利名稱：一種調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
在自然界，植物與其它種類的生物一樣，具有自身決定的細(xì)胞程序性死亡，例如，落花、落果、落葉等。這些細(xì)胞程序性死亡是由生物自身的基因所決定，外界因素，如光、溫、濕和生長調(diào)節(jié)劑等最多只能對其起微量的調(diào)節(jié)作用，而無法控制這一進(jìn)程是否發(fā)生。在人類利用植物生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品時，往往需要并且希望能人工控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育進(jìn)程，包括死亡。例如，當(dāng)棉花、玉米和番茄等成熟時，人們希望整株的葉片凋萎脫離，以方便采收，特別是機(jī)械采收；人們也希望楊樹在春天不產(chǎn)生飛絮、法國梧桐(二球懸鈴木)在春夏不產(chǎn)生“飛絮”；為了利用作物的雜種優(yōu)勢，人們希望有穩(wěn)定而且完全的雄性不育系。但在自然狀態(tài)下，人們的這種希望僅僅是一種希望，因?yàn)槊藁ā⒂衩缀头阎仓暝谄涔麑?shí)或種子成熟時仍然有很多葉片處于活躍期，仍然在為植株生產(chǎn)所需的碳水化合物等；楊樹和法國梧桐的“飛絮”是它們?yōu)榱朔毖芎蟠_的花或結(jié)的籽。為了實(shí)現(xiàn)控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育進(jìn)程，人們在習(xí)慣上往往多利用化學(xué)劑，例如，用乙烯利使番茄落葉；用化學(xué)殺雄劑去雄等。然而，問題是，這些化學(xué)劑往往沒有選擇性，在使目標(biāo)組織或器官致死的同時，也對其它非目標(biāo)組織或器官乃至整體都生產(chǎn)毒害或致死作用。例如，化學(xué)殺雄劑在殺死花藥花粉的同時，也對雌蕊和葉片產(chǎn)生毒害。
為了克服純化學(xué)劑的缺點(diǎn)，人們轉(zhuǎn)向生物技術(shù)，特別是基因工程技術(shù)。近十幾年來，利用基因工程來控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育和死亡進(jìn)程取得了長足的進(jìn)展。Mariani等利用花藥絨氈層特異性啟動子TA29與細(xì)胞毒素酶基因(RNase T1或Barnase)連接構(gòu)建成嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草和油菜中，細(xì)胞毒素酶基因在轉(zhuǎn)基因植株的花藥中特異性地表達(dá)，將花藥的絨氈層細(xì)胞殺死，從而獲得了雄性不育的植株。Van der Meer等將“花藥盒”(anther box)和CaMV 35S啟動子串聯(lián)，然后與CHS(查爾酮合成酶)的反義基因融合構(gòu)建成花粉特異性表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化矮牽牛的結(jié)果表明CHS反義基因的花粉特異性表達(dá)在抑制CHS合成、導(dǎo)致類黃酮合成受阻的同時，阻斷了花粉的發(fā)育，造成了雄性不育。根據(jù)同樣的原理，花藥中特異表達(dá)反義LAT52和反義Bcpl基因，也得到了雄性不育。藥絨氈層特異性表達(dá)反義肌動蛋白基因(actin)在轉(zhuǎn)基因番茄和小麥等作物上也獲得了雄性不育株。這些成功范例實(shí)現(xiàn)了人類定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育和死亡進(jìn)程的夢想，但還沒有實(shí)現(xiàn)人們按照自己的意愿隨時定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育和死亡進(jìn)程的夢想。例如，在Mariani等的體系中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育到花藥形成時就自己啟動細(xì)胞毒素基因(RNase T1或Barnase)的表達(dá)而殺死花藥細(xì)胞，人們無法干預(yù)。1996年，Kriete等的工作突破了這種限制，初步實(shí)現(xiàn)了人們按照自己的意愿隨時定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發(fā)育和死亡進(jìn)程的夢想。大腸桿菌argE基因的產(chǎn)物為N-乙酰-L-鳥氨酸脫乙酰酶，它可以把非毒性的物質(zhì)N-乙酰-L-磷絲菌素(N-ac-pt)脫去乙?；D(zhuǎn)化為毒素物質(zhì)L-磷絲菌素，即PPT(除草劑Basta等的活性成分)。組成型啟動子(CaMV35S啟動子)與argE基因構(gòu)成嵌合基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)并不影響其生物學(xué)及形態(tài)學(xué)性狀，但當(dāng)葉面施用外源N-ac-pt時，轉(zhuǎn)基因煙草葉面出現(xiàn)壞死斑；在含有N-ac-pt的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草由于對N-ac-pt的吸收而出現(xiàn)葉面變白，以至整株枯死的現(xiàn)象。他們還將argE基因置于花藥特異性啟動子TA29的控制之下，轉(zhuǎn)化煙草，在花粉發(fā)育時期施用N-ac-pt，轉(zhuǎn)基因植株的花藥變空，表現(xiàn)為雄性不育，而不施用N-ac-pt時，轉(zhuǎn)基因植株的花藥正?？捎?。該體系的主要缺點(diǎn)是，用于誘導(dǎo)的非毒性物質(zhì)N-乙酰-L-磷絲菌素(N-ac-pt)迄今為止仍然沒有商品化生產(chǎn)。
胞嘧啶脫氨酶基因(codA)編碼胞嘧啶脫氨酶(Cytosine Deaminase，CD)，最早從大腸桿菌(E.coli)中克隆出。在細(xì)菌和真菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有胞嘧啶脫氨酶，但在高等植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)以及代謝活躍的植物樣品等沒有發(fā)現(xiàn)它的存在(Stougaard等，1993，Plant J，3755-761；Austin等，1993，Mol.Pharmacol.，43380-387)。在細(xì)菌體內(nèi)，CD參與核酸的合成代謝。它把5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，而5-FU被代謝為5-FUTP(5-氟三磷酸尿苷)和5-FdUTP(5-氟三磷酸脫氧尿苷)。5-FUTP能代替UTP整合到RNA從而抑制rRNA和mRNA的合成。5-FdUTP可抑制胸腺苷酸合成酶(TS)，從而抑制胸腺苷酸的合成，導(dǎo)致dNTP的衰竭從而引起了細(xì)胞的DNA合成障礙。也就是說5-FU可以從RNA和DNA分子水平來干擾細(xì)胞的存活，因而是細(xì)胞毒劑，而其前體藥物5-FC則是無毒無害。
codA基因在人體及動物的腫瘤治療方面的研究在國內(nèi)外都有很多。在國內(nèi)，王寶梅等以重組腺病毒ADCD為載體將大腸桿菌codA基因體外轉(zhuǎn)染小鼠紅白血病細(xì)胞(FBL3)，得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對5-FC的敏感性顯著提高，并對小鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié)的生長有明顯的殺傷效果。宋艷斌等用含codA基因的高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠T淋巴細(xì)胞(T/PCD2)，表達(dá)結(jié)果表明，外用5-FC濃度大于1μmol/L時，對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞有顯著的殺傷作用，而對未轉(zhuǎn)基因的正常T淋巴細(xì)胞基本無毒性，且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在加入5-FC后生存時間明顯短于未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。陳綱等的結(jié)果顯示，亞葉酸鈣(CF)與5-FC合用，對轉(zhuǎn)codA基因的直腸癌細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)。對肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤以及前列腺癌等的治療研究結(jié)果也表明，codA/5-FC的聯(lián)合作用均有一定的療效。
在植物上，codA基因主要用作轉(zhuǎn)基因植物研究的一種選擇標(biāo)記基因。Helmi等將組成型codA基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草耐受5-FC的能力明顯比未轉(zhuǎn)基因的對照低未轉(zhuǎn)codA基因的煙草葉盤在含5-FC 1000mg/L的分化培養(yǎng)基上都生長良好，而轉(zhuǎn)codA基因的煙草葉盤在250mg/L的分化培養(yǎng)基上只有20％可以分化再生。Babwah等發(fā)現(xiàn)，野生型蕓薹的子葉、胚軸、真葉和根在5-FC 1600mg/L上生長16天都沒有顯著的影響，而轉(zhuǎn)組成型codA基因的蕓薹植株則對培養(yǎng)基中的5-FC就非常敏感。Dai等發(fā)現(xiàn)野生型水稻的幼胚和種子在含5-FC分別為500mg/L和1.5g/L的培養(yǎng)基上正常生長或正常萌發(fā)，而在含有5-FU分別為25mg/L和50mg/L的培養(yǎng)基上則停止發(fā)育或停止萌發(fā)。他們將codA基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株的子代有3/4對5-FC敏感。Prasad等在榨菜上的結(jié)果表明，導(dǎo)入的codA基因在子一代可以穩(wěn)定表達(dá)。codA基因作為選擇標(biāo)記基因還被轉(zhuǎn)入擬南芥和日本山茶蓮等植物，其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)效率可以通過T-DNA的非同源性重組來提高。
上述結(jié)果表明，植物，特別高等植物，盡管自身因?yàn)闆]有codA基因或codA基因不表達(dá)而對外源5-FC不敏感，但是對外源5-FU卻非常敏感。這暗示，5-FU也可以從RNA和DNA分子水平來干擾植物細(xì)胞的存活。外源codA基因在植物體內(nèi)不僅能正確表達(dá)，而且表達(dá)產(chǎn)物-胞嘧啶脫氨酶(CD)能將外源無毒的5-FC在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成有毒的5-FU，從而賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、器官乃至個體對無毒的5-FC的敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于定時定向調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體，所述胞嘧啶脫氨酶(codA)基因表達(dá)盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。
所述胞嘧啶脫氨酶基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.2；2)編碼胞嘧啶脫氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脫氨酶具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID No.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No.2由1824個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1位-1824位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列的胞嘧啶脫氨酶。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜。
所述組織特異性啟動子是能驅(qū)動基因(內(nèi)源和外源)編碼區(qū)在植物的特定組織或器官表達(dá)而在其它組織和器官都不表達(dá)的啟動子。所述植物組織特異性啟動子可為花藥或花粉特異性啟動子、花絲特異性啟動子、花瓣特異性啟動子、子房特異性啟動子、花柱特異性啟動子、柱頭特異性啟動子、葉片特異性啟動子、種子或胚特異性啟動子或根特異性啟動子等。
所述花藥或花粉特異性啟動子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、Def A、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13啟動子等；所述花絲特異性啟動子包括TSJT1等；所述花瓣特異性啟動子包括(cell-wall)P4等；所述子房特異性啟動子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9等；所述花柱特異性啟動子包括SA2-Rnase、Chi21、SIs、SLG-13和Sp4等；所述柱頭特異性啟動子包括ARC1和ARClBoler等；所述種子或胚特異性啟動子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、AB13、Fus3、KCS和Vp1等；所述的葉片特異性啟動子包括psbA、Osppc和St-LS1等；所述根特異性啟動子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7等。
所述花藥特異性啟動子優(yōu)選為TA29。
所述終止子包括Nos終止子，Ocs終止子(章魚堿合成酶基因的終止子)和花椰菜花葉病毒(CaMV)35s終止子。
用于構(gòu)建所述調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體，優(yōu)選為Ti類質(zhì)粒載體。
所述Ti類質(zhì)粒載體優(yōu)選為目前通用或商品雙元載體，如pCAMBIA3301，pBI101，pBI121，pBIN19等。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(如抗卡那霉素基因NPT II、NPT I和NPT III，抗潮霉素基因hpt等)或除草劑抗性基因(如，bar、PAT、bxn、aroA、EPSPS等)。
所述調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體優(yōu)為p3dAJM。
本發(fā)明的第二個目的提供一種定時定向調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法，是將上述調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)胞嘧啶脫氨酶基因的轉(zhuǎn)基因植株，利用5-氟胞嘧啶誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)組織或器官凋亡。
所述5-氟胞嘧啶的使用時期為目標(biāo)凋亡組織或器官發(fā)育期前7-14天；優(yōu)選的使用時期為目標(biāo)凋亡組織或器官發(fā)育期前7天。
所述目標(biāo)凋亡組織或器官為花藥時，所述5-氟胞嘧啶的使用時期為花藥絨氈層形成前7-14天。
所述被調(diào)控的植物可為自花授粉或常自花授粉的單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、水稻、高梁、谷子和玉米；所述雙子葉植物包括煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍(lán)、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。
所述5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度為對非目標(biāo)調(diào)亡組織或器官不產(chǎn)生毒害的最高濃度，可為100-350mM。對于雙子葉植物(煙草)，5-氟胞嘧啶的使用濃度為100-200mM時效果較好，對于單子葉植物，5-氟胞嘧啶的使用濃度為為250-350mM時效果較好。
本發(fā)明的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
本發(fā)明通過調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)胞嘧啶脫氨酶基因的定向表達(dá)，通過5-氟胞嘧啶實(shí)現(xiàn)定時誘導(dǎo)組織或器官凋亡。
本發(fā)明的調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法，使人們能夠根據(jù)自己的意愿隨時、定向、徹底地除去不需要的植物或作物的某一器官或組織而保留所需要的部分，并且對所保留的所需要的部分不產(chǎn)生負(fù)作用。如，在番茄和棉花上，可以將葉片特異性啟動子控制的codA基因?qū)?，在轉(zhuǎn)基因番茄或棉花成熟時，通過施用上述的無毒誘導(dǎo)劑(5-FC)來殺死葉片，而保留番茄或棉花果及其植株，從而方便采收，特別是機(jī)械采收。而經(jīng)典的去葉片的方法則多利用具有植物毒性的全身性的化學(xué)物質(zhì)。例如，在番茄上，施用乙烯利能除去葉片，但也同時促進(jìn)和刺激了果實(shí)的后熟，縮短了果實(shí)的儲藏壽命和貨架壽命。本發(fā)明的具體實(shí)施例中建立了一種新的化學(xué)調(diào)節(jié)性雄性不育/保持兼用系植物的培育方法及由此產(chǎn)生的雜交種子生產(chǎn)的“兩系”法。兩系法則可省去繁殖保持系及保持系與不育系雜交的操作程序，打破恢保關(guān)系的限制，可以大大地提高配組自由度，是一種前景廣闊雜交育種方法。當(dāng)人們需要植物或作物為雄性不育時，可以施用無毒的5-FC，定向“殺死”花藥花粉；當(dāng)人們需要植物或作物為雄性可育時，或人們不需要雄性不育時，不施用5-FC就可以了。而在經(jīng)典的雜交種子生產(chǎn)時，通常必須要三系(雄性不育系、保持系和恢復(fù)系)配套，這無形中增加了育種工作的時間和資金，并且三系法可利用的親本有限，配組不自由?，F(xiàn)有的兩系法存在雄性育性穩(wěn)定性問題，到目前為止，兩系法中的不育系與保持系兼得性多數(shù)依靠“光敏”或“溫敏”來調(diào)節(jié)，這就導(dǎo)致其不育系的育性對環(huán)境敏感，容易受外界環(huán)境因素的影響以及不育系的起點(diǎn)溫度漂移，容易造成自花授粉結(jié)實(shí)從而降低雜交種子的純度。按照本發(fā)明方法及本發(fā)明實(shí)施例中已經(jīng)建立的“兩系法”則是通過人工施用或不施用化學(xué)劑來調(diào)節(jié)，不受環(huán)境因素的影響，因此，不存在育性穩(wěn)定性的問題。


圖1為質(zhì)粒pdAJM的部分結(jié)構(gòu)示意2為含有codA基因表達(dá)盒的載體pUATA的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)示意3為含有codA基因表達(dá)盒的5-FC誘導(dǎo)性花藥特異性凋亡植物表達(dá)載體p3dAJM的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)示意4為轉(zhuǎn)p3dAJM煙草植株的PCR檢測圖5為轉(zhuǎn)codA基因煙草的Southern雜交圖譜圖6為150mM 5-FC調(diào)控轉(zhuǎn)p3dAJM煙草植株和對照植株一次的花粉萌發(fā)率比較圖7為150mM 5-FC調(diào)控轉(zhuǎn)p3dAJM煙草植株二次的花粉萌發(fā)結(jié)果比較圖8為150mM 5-FC調(diào)控轉(zhuǎn)p3dAJM植株E-2株系三個單株一次，二次，三次的花粉萌發(fā)比較圖9為轉(zhuǎn)p3dAJM小麥分化苗的PCR檢測圖10為5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥花藥大小的變化圖11為5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥和未轉(zhuǎn)基因小麥花粉的I2-KI染色圖12為5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥和未轉(zhuǎn)基因小麥的小穗比較圖13為5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥和未轉(zhuǎn)基因小麥與未經(jīng)5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥和未轉(zhuǎn)基因小麥的幼穗比較圖14為5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥和未轉(zhuǎn)基因小麥的成熟穗的比較圖15為轉(zhuǎn)p3dAJM小麥T1代幼胚在含PPT3.0(mg/L)的培養(yǎng)基上的分化具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
T0表示由愈傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株及其無性系，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株和無性系。
實(shí)施例1、含有codA基因表達(dá)盒的5-FC誘導(dǎo)性花藥特異性凋亡植物表達(dá)載體p3dAJM的構(gòu)建根據(jù)GenBank登記號為S56903.1的codA基因序列，設(shè)計5’端引物dA1，未端加Bam HI識別位點(diǎn)；設(shè)計3’端引物dA2，未端加Sac I識別位點(diǎn)。引物序列如下dA15’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’(31nt)dA25’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’(34nt)。
以大腸桿菌株系JM101基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了預(yù)期的約1.3Kb的目標(biāo)片段?；厥沾似危⑵溥B接到pUCm-T(上海生工公司)載體上，構(gòu)建成pdAJM(圖1，EiEcoRI，SaSacI，KpKpnI；NdNde I；ClClaI；EvEcoRV；NcNcoI；NtNotI；PsPstI；BgBgII I；BhBamHI；XhXhoI；XbXbaI；S1Sal I；PaPaeI；HdHindIII)。用Bam HI和Sac I對pdAJM進(jìn)行酶切，結(jié)果切出了約1.3Kb的目標(biāo)帶和3.0Kb的載體帶。說明1.3Kb的目標(biāo)片段正確地連接到pUCm-T載體上，即pdAJM構(gòu)建正確。測序結(jié)果表明擴(kuò)增出的片段全長1284bp(SEQ ID No.2)，編碼427個氨基酸，氨基酸序列詳見SEQ ID No.1?？寺∑蔚暮塑账嵝蛄泻陀纱送茖?dǎo)的氨基酸序列與GenBank登記號為S56903.1和AE000140.0的序列除了第一個氨基酸編碼(翻譯起始編碼)為植物識別的ATG外均有100％的同源性。該片段的核苷酸序列已經(jīng)在GenBank注冊，登記號為AY331712。
從pdAJM質(zhì)粒中用Sac I和Bam HI雙酶切取下大約1.28kb的小片段，連接到經(jīng)Sac I和Bam HI消化的克隆載體pG729上得到pGTA。其中，pG729是在pGEM-7(購自Promega公司)中插入TA29啟動子得到的，具體方法如下根據(jù)Mariani等(1990，Nature，347737-741)的方法從煙草品種NC89中克隆TA29啟動子，在其5’和3’端分別加入Kpn I和Bam HI酶切位點(diǎn)，將克隆的TA29插入經(jīng)過Kpn I和Bam HI雙酶切的pGEM-7，形成pG729。pGTA質(zhì)粒用Sac I和Kpn I雙酶切，取下大約1.58kb(TA29+codA)的小片段，插入到用Sac I和KpnI消化的pUAN質(zhì)粒(pUAN含增強(qiáng)子APS和終止子nos，按照楊曉東，2001，北京，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文“花藥特異性啟動子的克隆和人工雄性不育基因表達(dá)載體的改良”第53頁的方法構(gòu)建)，得到pUATA(圖2)。pUATA用Sac I和Bam HI和KpnI三酶切鑒定，結(jié)果切出1.28kb(codA基因)、450bp(APS基因)以及大約300bp(TA29啟動子)三條目標(biāo)帶和一條2.95kb的載體帶。酶切鑒定結(jié)果表明，含有codA基因表達(dá)盒的pUATA構(gòu)建正確。
pUATA質(zhì)粒用Xba I和Eco RI消化，取出2294bp的小片段，連接到經(jīng)過Xba I和Eco RI雙酶切的通用雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA3301(澳大利亞CAMBIA)上，得到codA基因化學(xué)誘導(dǎo)性組織特異凋亡基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p3dAJM(圖3)。分別用Sac I和Bam HI雙酶切和Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切p3dAJM，Sac I和Bam HI酶切得到1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標(biāo)帶和12kb的載體帶；Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切得到1.28kb(codA)、450bp(APS)、大約300bp(TA29啟動子)三條目標(biāo)帶和一條12kb的載體帶。該酶切鑒定結(jié)果表明，含有codA基因表達(dá)盒的5-FC誘導(dǎo)性花藥特異性凋亡植物表達(dá)載體p3dAJM構(gòu)建正確。
實(shí)施例2、利用含有codA基因表達(dá)盒的5-FC誘導(dǎo)性花藥特異性凋亡植物表達(dá)載體p3dAJM調(diào)控?zé)煵莸男坌杂?、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定用所構(gòu)建的p3dAJM轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株系EHA105。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)與轉(zhuǎn)化(凍熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的鑒定方法如下挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落，經(jīng)含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12小時，小量堿液法(Sambrook等，2001)提取質(zhì)粒DNA；質(zhì)粒用Sac I和Bam HI雙酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標(biāo)帶和12kb的載體帶。酶切結(jié)果說明，質(zhì)粒載體p3dAJM已經(jīng)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌株系EHA105中。
挑取攜帶植物表達(dá)載體p3dAJM的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于5ml含Rif 20mg/L YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)10小時，按1∶50的體積比稀釋到含Rif 20mg/L的新鮮YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值0.6-0.8。5000rpm離心5min，收集菌體，用1/2MSO液體培養(yǎng)基(1/2MS礦質(zhì)營養(yǎng)成分)洗滌菌體一次，并將其稀釋到離心前菌液5倍體積的1/2MSO液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備侵染用。
選取30天苗齡的煙草品種“NC89”無菌苗，在無菌條件下，切下成熟葉片，用直徑6mm的打孔器取葉圓盤；將取下的葉盤投入上述準(zhǔn)備好的菌液中，15分鐘后，取出葉盤，置于再生培養(yǎng)基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上于25℃暗培養(yǎng)2天。然后接種到含有羧芐青霉素(Carb)500mg/L和膦化麥黃酮(PPT)1.25mg/L的再生培養(yǎng)基上。侵染葉盤不斷膨大，10天后長出綠色愈傷，繼代后，抗性愈傷很快分化出小芽，而對照葉盤(未被侵染葉盤)則保持原有大小并黃化死亡。當(dāng)抗性芽長到1-1.5cm時，將其切下，轉(zhuǎn)到含有PPT 5.0mg/L和Carb 200mg/L的生根培養(yǎng)基(MS+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上10天左右開始生根，2-3周后得到正常生根的抗性植株。
2、轉(zhuǎn)基因煙草的組織化學(xué)和分子檢測分析(1).PPT抗性苗的GUS染色結(jié)果將已經(jīng)生根的煙草PPT抗性植株的整株和部分葉片按照J(rèn)efferson等(1987，EMBO J，63901-3907)的方法進(jìn)行GUS染色，脫色后轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉都呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色，而未轉(zhuǎn)基因的對照株則完全白化無藍(lán)色。表明報告基因GUS已經(jīng)整合到煙草基因組中并得到正確表達(dá)。
(2).GUS陽性苗的PCR擴(kuò)增對GUS染色的陽性苗進(jìn)一步進(jìn)行分子檢測。用目標(biāo)基因codA兩端的特異性引物dA1和dA2(dA15’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’；dA25’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，GUS陽性株均擴(kuò)增得到大小為1.28kb的目標(biāo)帶，而未轉(zhuǎn)化的對照煙草在相應(yīng)位置則沒有擴(kuò)增出此目標(biāo)片段。這一結(jié)果初步表明目標(biāo)基因codA已整合到煙草基因組中。圖4中，MλDNA(Hin dIII和Eco RI)雙酶切marker；泳道1質(zhì)粒對照p3dAJM，目的片段為1.28kb(箭頭所指)，泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16GUS陽性植株，擴(kuò)出1.28kb的帶，泳道11未轉(zhuǎn)基因植株對照。
(3).GUS和PCR陽性苗的Southern雜交檢測通過Southern分析來檢驗(yàn)基因組的整合情況。
用Sac I和Bam HI于37℃過夜消化轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA(10μg)。通過電泳法0.7v/cm在0.8％瓊脂糖凝膠上分離酶切后的DNA 16-20小時，DNA用向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到一帶正電荷的尼龍膜上(BoehringerMannheim，Germany)。用內(nèi)切酶Bam HI和Sac I從p3dAJM上切下約1.28kb的codA片段，以此作為模板，利用地高辛DNA標(biāo)記試劑盒(Roche)所帶的DIG-標(biāo)記dNTP和酶，對上述模板DNA進(jìn)行標(biāo)記。以標(biāo)記好的單鏈DNA作為探針，按照地高辛DNA標(biāo)記試劑盒所敘述的方法，將制備好的探針與上述尼龍膜雜交，并用堿性磷酸酶標(biāo)記地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)(購自Roche公司)進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖5所示，陽性對照質(zhì)粒出現(xiàn)一條很明顯的1.28kb的雜交帶，但同時還有其他的弱帶；轉(zhuǎn)基因煙草植株呈現(xiàn)陽性，出現(xiàn)一條1.28kb的雜交帶，而未轉(zhuǎn)基因的對照植株NC89則無雜交帶出現(xiàn)。用Eco RI單酶切轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，也出現(xiàn)雜交帶(見圖5)。此結(jié)果表明，嵌合codA基因確實(shí)已經(jīng)整合到煙草的基因組中。圖5中，泳道1，質(zhì)粒對照(經(jīng)Sac I和Bam HI酶切的p3dAJM)；泳道2，3，4，6，7為轉(zhuǎn)基因煙草；泳道5，8為未轉(zhuǎn)基因煙草對照。
3、codA基因表達(dá)盒在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析(1).轉(zhuǎn)基因植株的移栽將GUS染色、PCR和Southern雜交均呈陽性的轉(zhuǎn)codA基因的煙草植株在三角瓶中開口煉苗一周，移入花盆，在溫室中培養(yǎng)，第一周套袋保濕，之后去袋并進(jìn)行常規(guī)管理。
(2).化學(xué)誘導(dǎo)劑5-FC對煙草植株不致死最高濃度的選擇選取長勢大小基本相同的煙草5株，其中3株為NC89未轉(zhuǎn)基因苗(NC89-1、NC89-2和NC89-3)，2株為轉(zhuǎn)基因的抗性苗(L-1-1，L-5-1)，選取接近中部的完整的完全伸展開的3片葉子，取對稱葉片的一半涂抹不同濃度(0.0-500mM)的5-FC，每50mM為一個濃度梯度，另一半作為對照。涂抹后每天進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察8天。從中選出不殺死煙草葉片的最高5-FC濃度，此后采用該濃度進(jìn)行整株噴施，檢測其對整株的作用效果。
用50-500mM的5-FC涂抹野生型煙草NC89和轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，處理后1-8天觀察葉片的反應(yīng)，結(jié)果如表1和圖6所示。
表1.5-FC涂抹煙草NC89以及轉(zhuǎn)基因植株的葉片反應(yīng)情況統(tǒng)計

說明數(shù)字---可引起葉片局部傷害的最低濃度；*--表示微黃，**--有小死斑，***--有較大的死斑，****--有大的壞死斑。空者--沒有反應(yīng)，葉片的位置是從下向上數(shù)，括號內(nèi)的數(shù)目是指涂抹時葉片的數(shù)目(設(shè)有清水對照)。
表1表明，一般在大于150mM濃度的5-FC才可以完全殺死涂抹部位，并使周圍組織黃化。當(dāng)然不同生長狀態(tài)的植株和涂抹不同部位的葉片對5-FC的敏感程度是不完全相同的，有的植株耐受5-FC的程度更高一些，達(dá)到300mM，而有的植株在150mM處就使組織有少許損傷。
綜合涂抹的所有植株的情況，選用150mM進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草的育性調(diào)控。經(jīng)過全株噴施150mM的5-FC處理，煙草植株均正常生長。說明這一濃度的5-FC本身不會對煙草產(chǎn)生毒害作用，噴施不會使煙草黃化或死亡。
(3)轉(zhuǎn)基因植株的雄性育性調(diào)控根據(jù)codA基因表達(dá)盒的設(shè)計原理，轉(zhuǎn)基因植株需經(jīng)過適當(dāng)濃度的5-FC誘導(dǎo)處理，5-FC進(jìn)入植物體內(nèi)，在花藥中在胞嘧啶脫氨酶的作用下，轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn)物5-FU，引起DNA合成障礙，導(dǎo)致花粉敗育。試驗(yàn)中除了對轉(zhuǎn)基因植株(L-1-1，L-5-1，E-2-1，E-2-2，E-3-2，E-2-3，E-6-2和L-5-2)的5-FC處理之外，還設(shè)計了轉(zhuǎn)基因植株不處理(nCK，n為株系號)、非轉(zhuǎn)基因植株不處理(CK0)和非轉(zhuǎn)基因植株5-FC處理(CK1)三個對照。5-FC處理植株從開花前7天開始每隔5天噴施一次5-FC(150mM)，選擇同一株系號的不同植株分別噴施1-3次，這期間對花粉活力進(jìn)行連續(xù)檢測。
花粉活力檢測方法取含苞待放的花朵(花藥未開散)，挑取其中的花粉，置于花粉萌發(fā)培養(yǎng)基(蔗糖10％，硼酸100mg/L，瓊脂0.5％，pH5.6)上，室溫暗處培養(yǎng)4-5小時顯微鏡下觀察，記錄正常萌發(fā)和不萌發(fā)或萌發(fā)后畸形的花粉數(shù)目。
經(jīng)過150mM的5-FC處理，轉(zhuǎn)基因植株和對照植株在花藥形態(tài)和花粉活力等各方面有著顯著的差異。
1).用150mM的5-FC噴施一次轉(zhuǎn)基因植株和各種對照植株，花粉萌發(fā)率如表2和圖6所示。
表2.一次噴施150mM的5-FC對轉(zhuǎn)codA基因煙草株系花粉活力的影響
注*時間是指從噴藥后算起，開花期取花粉檢測的時間(天)；CK0未轉(zhuǎn)基因煙草，不用5-FC處理；CK1未轉(zhuǎn)基因煙草，用5-FC處理；nCK轉(zhuǎn)基因煙草，不用5-FC處理。
表2和圖6表明，未轉(zhuǎn)基因植株不管用(CK1)或不用(CK0)150mM的5-FC處理，自處理后的第5天至第30天取樣，其花粉的萌發(fā)率都在80％以上。轉(zhuǎn)基因植株不用5-FC處理(nCK)時，其相應(yīng)的花粉萌發(fā)率也都在80％以上。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株用150mM的5-FC處理后，株系L-5-1自第13天后，花粉萌發(fā)率顯著下降，一直到第24天。其中的第14天至第19天下降最明顯，花粉萌發(fā)率為40％以下，即下降了一半；株系L-1-1自處理后，第10天花粉的萌發(fā)率顯著下降，一直持續(xù)到第21天。其中，處理后的第11天至第17天花粉的萌發(fā)率在40％以下，第14-16天的萌發(fā)率還不到30％；株系E-2-1自處理后第9-19天，花粉萌發(fā)率下降顯著，特別是從第11天至第17天，花粉萌發(fā)率在30％以下，其中有2天(第14-15天)在20％以下，不到同時期對照株系的1/4。
從表2還可以看出，用150mM的5-FC處理的效果在處理后的第9-10天才明顯可見，其作用可以持續(xù)13天左右，但以處理的第14-17天最為明顯(圖6)。
2).150mM的5-FC隔5天二次噴施，轉(zhuǎn)基因植株及其各種對照株系花粉的萌發(fā)率如表3和圖7所示。
表3.二次噴施150mM的5-FC對轉(zhuǎn)codA基因煙草花粉活力的影響

注*時間是指從第一次噴藥算起，取花粉檢測的時間(天)，兩次施藥的時間相隔5天。
表3和圖7表明，二次處理，觀察的4個轉(zhuǎn)基因株系的花粉萌發(fā)率自第一次處理后的第10天至第27天，花粉的萌發(fā)率都在40％以下(株系E-3-2的至第24天)，而此時的各對照花粉萌發(fā)率均在80％以上。株系E-2-2自處理后的第12-14天的萌發(fā)率僅為12.4-17.8％，第17-20天在30％以下，以后在40％以下，直到第34天仍在56％以下。
比較一次噴施與二次噴施5-FC的花粉萌發(fā)率，可以看出，二次比一次顯著的降低了轉(zhuǎn)基因植株株系的花粉萌發(fā)率，而且這種降低持續(xù)的天數(shù)延長近10天(圖7)。
3).對于同一轉(zhuǎn)基因株系(E-2)的三個單株，噴施一、二和三次150mM的5-FC之后的花粉萌發(fā)率進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如表4和圖8。
表4不同次數(shù)噴施150mM的5-FC，對轉(zhuǎn)codA基因株系E-2各單株花粉萌發(fā)率的影響


*時間(天)是從最初噴藥的時間開始算起，同一株系的三棵苗子的花粉萌發(fā)率的縱向比較。
表4和圖8表明，自第一次噴施后的第9-10天開始，花粉的萌發(fā)率開始顯著下降。噴一次(E-2-1)顯著下降的作用時間持續(xù)大約7-8天，而以第一次噴后的第11-16天的效果最為顯著，花粉發(fā)芽率在17-30％之間。噴二次時(E-2-2)，花粉的萌發(fā)率自第一次噴后的第10天至第28天，一直在40％以下，而噴一次時的第19天，花粉萌發(fā)率已經(jīng)上升到50％以上。噴二次時，花粉萌發(fā)率最低時段出現(xiàn)在第一次噴后的第11-14天，都在20％以下。這一作用持續(xù)4天，然后逐漸減弱，故花粉萌發(fā)率有所上升，在22-35％左右，至到第28天。噴施三次(E-2-3)，其效果與噴施二次沒有顯著的差異，只不過維持低水平的花粉萌發(fā)率的時間更長一些(至第31天)。
從表4還可以看出，單株E-2-1和E-2-3噴后第7-9天花粉萌發(fā)率就有46.5-85.1％之間，此后才開始顯著下降(圖8)，可能由于起始噴施時間偏晚。
4、轉(zhuǎn)基因T1代的雄性育性調(diào)控(1)轉(zhuǎn)基因T1代的獲得收集飽滿的野生型NC89植株的種子，放入1.5ml離心管(Eppendorf管)中，用70％酒精消毒20秒，0.1％HgCl2消毒3分鐘，無菌水洗滌5次，放入含不同濃度PPT的種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS)中，暗處培養(yǎng)7天，后置于光下培養(yǎng)30天，統(tǒng)計NC89種子的萌發(fā)情況，并找出致使NC89種子萌發(fā)后黃化死亡的最低PPT濃度(3.0mg/L，表5)，作為轉(zhuǎn)基因T0代植株種子(T1)的發(fā)芽選擇濃度。
收集飽滿的轉(zhuǎn)基因T0代植株的種子，做同樣的消毒處理，轉(zhuǎn)入含有上述選擇濃度PPT的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗處培養(yǎng)7天，置于光下培養(yǎng)30天，統(tǒng)計T1代的萌發(fā)情況(表5)。
表5.轉(zhuǎn)codA基因的煙草T1與對照植株的種子在不同濃度的PPT培養(yǎng)基上的成苗率 說明成苗率是指萌發(fā)后的綠苗數(shù)與接種的總數(shù)目(綠苗+黃化苗+未萌發(fā)種子)的比值。
表5表明，在PPT 3.0mg/L或以上時，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?NC89-1，NC89-2)的種子完全不能成苗(成苗率為0％)，而轉(zhuǎn)基因(L-1，E-2，E-8)T1的成苗率在60-65％。
(2)T1代苗的GUS染色將在選擇濃度PPT(3.0mg/L)的培養(yǎng)基中得到的T1代苗洗凈根部培養(yǎng)基，將整株和部分葉片按照上述方法進(jìn)行GUS染色，脫色后轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉都呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色，而未轉(zhuǎn)基因的對照株則完全白化無藍(lán)色。
(3)轉(zhuǎn)基因T1代植株的功能分析待T1代苗長到5cm左右高時，移入花盆，在溫室中培養(yǎng)，第一周套袋保濕，之后去袋并進(jìn)行常規(guī)管理。在T1代植株開花前10天噴施150mM 5-FC，然后每5天噴一次，共噴3次，開花時檢測花粉活力。在檢測的3個株系共7個單株中，花粉發(fā)芽率在25-30％的只有1個單株，其余的都在20％以下，其中株系T1E-8的2個單株的花粉發(fā)芽率都在10％以下，達(dá)到育種學(xué)上的完全雄性不育。而未調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株、調(diào)控和未調(diào)控的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕ǚ郯l(fā)芽率都在85％以上。
實(shí)施例3、利用植物表達(dá)載體p3dAJM調(diào)控小麥的雄性育性選取普通小麥(Triticum aestivum L.)半冬性栽培品種—“揚(yáng)麥158”。取開花后12-16天的幼嫩種子，用0.1％的HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，每次5分鐘，然后于超凈工作臺上剝?nèi)∮着叽谩?br> 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件(單位為mg/L；除特別說明外，含3％蔗糖和7g/L瓊脂)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0+KT0.5pH5.8高滲培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0+KT0.5+甘露醇0.4M pH5.8恢復(fù)培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500pH5.8誘導(dǎo)愈傷組織篩選培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500+PPT5.0pH5.8分化篩選培養(yǎng)基MS+VB10.5+CuSO40.5+KT0.5+carb150-500+PPT1.5-3.0pH5.8生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+NAA1.0+PPT3.0-5.0+2％蔗糖+7g/L瓊脂pH5.8培養(yǎng)條件溫度25±1℃，光暗周期16(光照)/8hr(黑暗)—、p3dAJM轉(zhuǎn)化小麥的愈傷組織可用農(nóng)桿菌法或基因槍法轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織。
1.農(nóng)桿菌法侵染小麥愈傷組織用所構(gòu)建的p3dAJM轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株系LBA4404。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)與轉(zhuǎn)化(凍熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的鑒定方法如下挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落，經(jīng)含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12小時，小量堿液法(Sambrook等，2001)提取質(zhì)粒DNA；質(zhì)粒用Sac I和Bam HI雙酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標(biāo)帶和12kb的載體帶。酶切結(jié)果說明，質(zhì)粒載體p3dAJM已經(jīng)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌株系LBA4404中。
(1).愈傷組織的誘導(dǎo)與前處理選取開花12-15天的小穗，剝?nèi)》N子，在超凈工作臺上70％的乙醇消毒30秒，無菌水洗一次，再用0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5遍，每次5分鐘。仔細(xì)剝?nèi)∮着?，將幼胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±2℃暗處培養(yǎng)。10-20天后產(chǎn)生的淡黃色、鮮嫩的愈傷組織。在轉(zhuǎn)化前4-6小時轉(zhuǎn)移至含0.4M的甘露醇的高滲培養(yǎng)基上，用于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。
(2).農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及活化從YEB培養(yǎng)基中挑取少量帶有目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404接種于5ml含Str(鏈霉素)100mg/l和Kan(卡那霉素)50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)10小時，按1∶50的體積比稀釋到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的新鮮YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值大約為0.6-0.8，待侵染。
(3).侵染幼胚愈傷組織挑取淡黃色、幼嫩的小麥幼胚愈傷組織置于活化好的農(nóng)桿菌菌液中。侵染1-2小時后取出愈傷組織用無菌、干燥的濾紙和吸水紙吸干，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基)上，2-3天轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基，繼續(xù)暗培養(yǎng)7-10天左右，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)愈傷組織篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-4周，轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基，光下分化培養(yǎng)。20天后將再生出的綠苗移至生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)的同時進(jìn)行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng))，15天后移至新鮮生根培養(yǎng)基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng)。
2.基因槍法轉(zhuǎn)化小麥愈傷(1).質(zhì)粒的提取和純化將p3dAJM通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將含有p3dAJM的大腸桿菌DH5α加入100mg LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50mg/L)中，于37℃，振蕩培養(yǎng)(200rpm)至OD值為0.5-0.6時，按照QIAGEN-tip100試劑盒的說明提取質(zhì)粒。
(2).微彈制備基本按說明書進(jìn)行。稱取50mg直徑為1μm的金粉顆粒放入滅菌的離心管中，加入1ml無水乙醇振蕩懸浮，放置過夜。5000rpm離心3分鐘，去上清，收集金粉，無菌水沖洗3-4次至乙醇完全除去，最后加入1ml無菌水制成濃度為50mg/ml的金粉懸液。用前吸取50μl金粉懸液移至Eppendorf管中，加入5μg質(zhì)粒DNA，充分震蕩；然后分別加入2.5M CaCl250μl和0.1M亞精胺20μl，并充分混勻；靜置2分鐘后用140μl的70％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加140μl 100％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加入90μl 100％乙醇，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3).愈傷組織的前處理愈傷組織在轉(zhuǎn)化前4-6小時轉(zhuǎn)移至含0.4M的甘露醇的高滲培養(yǎng)基上，集中在直徑5cm的培養(yǎng)基的中央(直徑2cm的范圍內(nèi))，用于基因槍的轉(zhuǎn)化。
(4).基因槍轟擊轟擊使用PDS-1000/He型基因槍。打開電源，將消毒過的可裂圓片裝入固定蓋，旋緊。取微彈懸浮液10μ|均勻涂抹在消過毒的微彈載體中心區(qū)域，自然風(fēng)干，然后于阻擋網(wǎng)一并裝入發(fā)射裝置中。將待轉(zhuǎn)化的材料放在樣品板上(轉(zhuǎn)化材料與微彈之間的距離為7cm)，關(guān)上轟擊室，按VAC鍵抽真空，當(dāng)真空度為27-28Pa時，將VAC鍵轉(zhuǎn)到HOLD位置，按FIRE鍵使氮?dú)鈮毫_(dá)到可裂膜的壓力(1000-1100psi)時進(jìn)行轟擊。
(5).植株再生與篩選將轟擊12小時后的幼胚愈傷組織移至不加滲透壓調(diào)節(jié)劑和選擇壓的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼續(xù)暗培養(yǎng)兩周后移至分化篩選培養(yǎng)基，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng)；20天后將再生出的綠苗移至生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)的同時進(jìn)行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng))，春化處理15天后移至新鮮生根培養(yǎng)基中，25±2℃，16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng)。
3、農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化愈傷和分化苗的GUS染色農(nóng)桿菌侵染小麥幼胚愈傷組織7天后，對愈傷組織進(jìn)行GUS染色，有25％的愈傷組織能染成藍(lán)色，而未侵染的對照愈傷則不能被染色(表6)。
表6.農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化小麥愈傷的GUS染色

愈傷組織在經(jīng)過恢復(fù)、誘導(dǎo)、篩選培養(yǎng)后，最終轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基上分化出苗，取出部分抗性苗進(jìn)行GUS染色，結(jié)果染出深淺不等藍(lán)色，而對照無藍(lán)色?？剐悦缭谏囵B(yǎng)基上正常生根，而對照揚(yáng)麥158則在生根培養(yǎng)基上不生根，黃化死亡。生根后的小麥移苗到溫室，轉(zhuǎn)基因植株在株高，株葉，形態(tài)方面與對照植株沒有差異。
從侵染的650塊愈傷組織中，有8塊愈傷組織的再生苗能被GUS染色，由此計算，轉(zhuǎn)化頻率為1.23％。
4、基因槍法轉(zhuǎn)化愈傷組織的GUS染色用基因槍轟擊350塊愈傷組織，其中6塊愈傷組織的再生苗能被GUS染色，轉(zhuǎn)化頻率約為1.71％二、轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測用目標(biāo)基因codA兩端的特異性引物dA1和dA2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果GUS陽性株可以擴(kuò)增得到大小為1.28kb的目標(biāo)帶，而未轉(zhuǎn)化的對照小麥在相應(yīng)位置則沒有擴(kuò)增出此目標(biāo)片段(圖9)。圖9中，泳道1λDNA經(jīng)Hind III和EcoRI雙酶切分子量標(biāo)記(虛線箭頭所指1.375Kb)；泳道2載體p3dAJM對照，目的片段為1.28Kb(實(shí)線箭頭所指)；泳道3-6轉(zhuǎn)codA基因小麥PPT抗性植株，其中，泳道4，6為GUS陽性植株；泳道7未轉(zhuǎn)基因小麥對照。
三、誘導(dǎo)劑5-FC對揚(yáng)麥158葉片最高非致死致傷濃度的篩選用葉片涂抹法對轉(zhuǎn)基因植株(dA-10，L158-20，L158-11)和未轉(zhuǎn)基因植株(揚(yáng)麥158-1，揚(yáng)麥158-2，揚(yáng)麥158-3，揚(yáng)麥158-4)進(jìn)行5-FC的耐受性試驗(yàn)，5-FC的濃度為150-500mM，從處理后的第一天進(jìn)行觀察，葉片有反應(yīng)的5-FC的濃度如表7。
表7野生型小麥與轉(zhuǎn)基因小麥葉片對5-FC濃度的耐受性(單位mM) 注方格內(nèi)數(shù)字是表示在這一時間可以使葉片凋亡的最低5-FC濃度，空格為沒有明顯反應(yīng)。*--表示黃化，**--表示有壞死斑。
從表7中可以看出，5-FC涂抹小麥葉片7天以后，涂抹點(diǎn)葉片的變化基本沒有明顯的改變。5-FC在300mM以上，造成了葉片明顯的傷害。因此以下實(shí)驗(yàn)選用300mM的5-FC來噴施全株作育性調(diào)節(jié)。
四、轉(zhuǎn)基因小麥雄性育性的化學(xué)調(diào)控1.轉(zhuǎn)化株的花器官的解剖結(jié)構(gòu)觀察在植株長到4-6節(jié)高時用300mM的5-FC噴施全株一次，小麥營養(yǎng)生長正常。在小麥抽穗的過程中，小心撥開內(nèi)外麩，觀察雄蕊的發(fā)育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有L-13，L-11，L-19，L-20，dA-4，dA-10，dA-20這7個GUS陽性株系出現(xiàn)雄蕊發(fā)育不良現(xiàn)象(圖10)，花藥小而淡黃。圖10中，左側(cè)花藥為未轉(zhuǎn)基因植株未調(diào)控(對照)的花藥；右側(cè)花藥為轉(zhuǎn)基因植株調(diào)控的花藥。
2.轉(zhuǎn)化株花粉的碘-碘化鉀染色轉(zhuǎn)p3dAJM小麥植株經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)后花粉的碘-碘化鉀(I2-KI)染色結(jié)果如表8。表8表明，轉(zhuǎn)基因株6個株號(dA-10-3，dA-10-4，dA-20-1，dA-8-1，L-158-19，L-158-3)降低了約20％，dA-10-2的花粉染色率比對照少將近30％(圖11)，這些株號均為GUS陽性株。圖11中，左側(cè)圖片為未轉(zhuǎn)基因經(jīng)5-FC調(diào)控的對照株的花粉；右側(cè)圖片為轉(zhuǎn)基因株調(diào)控株的花粉。
雄蕊發(fā)育不良或花粉I2-KI染色藍(lán)色率低的麥穗一般伴隨有花藥短小皺縮，花絲縮短，花藥內(nèi)花粉含量較少等形態(tài)學(xué)改變，如果不進(jìn)行人工授粉，(株號L-13，L-20)，在后期的生長發(fā)育的過程中則出現(xiàn)內(nèi)、外稃張開，穎殼開放，最后則不產(chǎn)生或產(chǎn)生很少幾粒種子(圖12，13，14)。圖12表明，5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥的小穗(A)與5-FC調(diào)控的未轉(zhuǎn)基因小麥的小穗相比，內(nèi)、外稃張開，穎殼開放。圖13表明，5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥的幼穗(A)的小穗張開，內(nèi)、外稃張開，穎殼開放，顯示出典型的雄性不育的特征，而5-FC調(diào)控的未轉(zhuǎn)基因小麥的幼穗(B)、未經(jīng)5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥的幼穗(C)和未經(jīng)5-FC調(diào)控的未轉(zhuǎn)基因小麥的幼穗(D)則，小穗抱軸，內(nèi)、外稃密閉，穎殼不開。圖14表明，5-FC調(diào)控的轉(zhuǎn)p3dAJM小麥的成熟穗(A)瘦癟，沒有種子，而未轉(zhuǎn)基因小麥的成熟穗(B)則肥碩，有36粒以上的飽滿種子。
表8.轉(zhuǎn)p3dAJM小麥花粉的碘-碘化鉀染色

注*CK(1-3)是野生型的揚(yáng)麥158的種子苗。#GUS陽性。
3、T1代幼胚在分化篩選培養(yǎng)基上的分化為了加快轉(zhuǎn)基因小麥的繁殖循環(huán)，可以用幼胚培養(yǎng)加抗性篩選。篩選壓以野生型揚(yáng)麥158的幼胚愈傷在0-5mg/L PPT上的芽分化情況來確定(表9)。
表9野生型揚(yáng)麥158的幼胚愈傷在含不同濃度的PPT分化篩選培養(yǎng)基上的分化(分化30天)

表9表明殺死揚(yáng)麥158幼胚的最低有效濃度是PPT 3.0mg/L。根據(jù)這一結(jié)果，以下試驗(yàn)用PPT 3.0mg/L篩選轉(zhuǎn)基因T1代幼胚苗。
取所有轉(zhuǎn)p3dAJM株號的T1代幼胚愈傷，置于含PPT 3.0mg/L的分化篩選培養(yǎng)基上，分化30天后，芽分化率如表10，其分化狀態(tài)照片如圖15。
表10轉(zhuǎn)p3dAJM小麥T1代幼胚愈傷組織在PPT 3.0mg/L的分化篩選培養(yǎng)基上分化(分化30天)


表10表明轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)p3dAJM)植株小麥幼胚在含PPT 3.0mg/L的分化篩選培養(yǎng)基上的分化率都在30％以上，遠(yuǎn)比未轉(zhuǎn)基因的(表9)分化率高。轉(zhuǎn)基因植株小麥幼胚分化率最高的是L-19，為73.33％，是對照(野生型)揚(yáng)麥158幼胚分化的14.7倍。分化率最低的是L-13，為31.25％，是對照愈傷組織的6.25倍。
表10也顯示，不同的轉(zhuǎn)基因植株，其幼胚愈傷對PPT 3.0mg/L的抗性有較大的差別，這可能與導(dǎo)入的PPT抗性基因(bar)的拷貝數(shù)、插入位置及其分離有關(guān)。
PPT抗性苗在進(jìn)行生根培養(yǎng)的同時進(jìn)行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng))，春化處理15天后移至新鮮生根培養(yǎng)基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養(yǎng)。當(dāng)苗高大約5-6cm時，移栽到溫室。
當(dāng)苗長出新葉后，取其新葉，進(jìn)行GUS染色，陽性苗再進(jìn)行PCR確認(rèn)。對經(jīng)過PCR確認(rèn)者，按照前述方法進(jìn)行雄性育性的化學(xué)調(diào)控(300mM 5-FC)，每隔4天1次，共3次。開花時用碘-碘化鉀(I2-KI)對花粉活力進(jìn)行檢測，花粉活力低于10％的植株套袋，成熟時檢查單穗結(jié)實(shí)率。結(jié)果表明，55-60％的植株的花粉活力在20％以下，40-45％在10％以下。在套袋自交的15株中，僅有5株能產(chǎn)生1-5粒種子，而且種子很癟。
序列表<160>2<210>1<211>427<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly1 5 10 15Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala20 25 30Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp35 40 45Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His50 55 60Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly65 70 75 80Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu85 90 95Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln100 105 110Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp115 120 125Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val130 135 140Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu165 170 175Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu180 185 190Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr
195 200 205Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser210 215 220Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly225 230 235 240Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly245 250 255Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn260 265 270Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp275 280 285Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu290 295 300Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp305 310 315 320Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu325 330 335His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn340 345 350Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly355 360 365Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn370 375 380Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg385 390 395 400Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr405 410 415Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg420 425<210>2<211>1284<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>3atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg120cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag180ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc240acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat300gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg360cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg420aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt480ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta540gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa600accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat660gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc720gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca780cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat840attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa900gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg960tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260gaagccatcg attacaaacg ttga 128權(quán)利要求
1.調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體，所述胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述胞嘧啶脫氨酶基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.2；2)編碼胞嘧啶脫氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脫氨酶具有序列表中SEQ IDNo.1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID No.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述植物組織特異性啟動子為花藥或花粉特異性啟動子、花絲特異性啟動子、花瓣特異性啟動子、子房特異性啟動子、花柱特異性啟動子、柱頭特異性啟動子、葉片特異性啟動子、種子或胚特異性啟動子或根特異性啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述花藥或花粉特異性啟動子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、DefA、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13啟動子；所述花絲特異性啟動子包括TSJT1；所述花瓣特異性啟動子包括(cell-wall)P4；所述子房特異性啟動子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9；所述花柱特異性啟動子包括SA2-Rnase、Chi2∶1、SIs、SLG-13和Sp4；所述柱頭特異性啟動子包括ARC1和ARC1Boler；所述種子或胚特異性啟動子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、ABI3、Fus3、KCS和Vpl；所述的葉片特異性啟動子包括psbA、Osppc和St-LS1；所述根特異性啟動子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述花藥特異性啟動子為TA29。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述終止子包括Nos終止子，Ocs終止子和CaMV 35s終止子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，其特征在于所述調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體為p3dAJM。
8.一種調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法，是將權(quán)利要求1-7中任一所述的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)胞嘧啶脫氨酶基因的轉(zhuǎn)基因植株，利用5-氟胞嘧啶誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)組織或器官凋亡。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述5-氟胞嘧啶的使用時期為目標(biāo)凋亡組織或器官發(fā)育期前7-14天；優(yōu)選的使用時期為目標(biāo)凋亡組織或器官發(fā)育期前7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)凋亡組織或器官為花藥，所述5-氟胞嘧啶的使用時期為花藥絨氈層形成前7-14天。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或9或10所述的方法，其特征在于所述被調(diào)控的植物是自花授粉或常自花授粉的單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、水稻、高梁、谷子和玉米；所述雙子葉植物包括煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍(lán)、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9或10所述的方法，其特征在于所述5-氟胞嘧啶的使用濃度為100-350mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體，所述胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法，是將該調(diào)控植物組織或器官凋亡的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)胞嘧啶脫氨酶基因的轉(zhuǎn)基因植株，利用5－氟胞嘧啶誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)組織或器官凋亡。本發(fā)明的調(diào)控植物組織或器官凋亡的方法，使人們能夠根據(jù)自己的意愿隨時、定向、徹底地除去不需要的植物或作物的某一器官或組織而保留所需要的部分，并且對所保留的所需要的部分不產(chǎn)生負(fù)作用。
文檔編號C12N15/82GK1699580SQ20051007761
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者肖興國, 孫曉紅, 曹克浩, 王志林, 韓曉紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)