專利名稱：癌靶向超抗原融合蛋白質及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是一種融合蛋白。還公開了含有該融合蛋白的表達載體和宿主細胞，及其制備方法。
背景技術：
目前對于癌癥疾病的藥物治療主要是以化學藥物為主，副作用大，化學藥物在殺傷癌細胞的同時也傷害了正常細胞，化學藥物缺乏針對癌細胞的特異性作用。
為了解決藥物的特異性問題，抗體是一類很有效的工具，是一種常用的癌細胞特異性定位導向載體，它可以特異地作用于癌細胞?？贵w本身可以封閉癌細胞，它的Fc片段能引起細胞毒作用?？贵w也可以接上一個毒素蛋白質，引導毒素蛋白質殺死癌細胞。
超抗原(Superantigen)也能引起細胞毒作用，它是一類特殊的抗原分子，主要是一些細菌的毒素和逆轉錄病毒基因的產物，不需要抗原提呈細胞的加工處理，而以完整的蛋白質形式直接與細胞膜上的MHC II類分子結合形成復合物，識別TCR的Vβ片段，激活比普通抗原多得多的T細胞(包括CD4+，CD8+)，并釋放大量細胞因子，對靶細胞產生強而有力的細胞毒作用。
超抗原與人類多種急、慢性疾病的發(fā)生有關，但在抗腫瘤研究中也發(fā)揮了獨特的作用，嘗試用它激活的T細胞來殺傷腫瘤，并取得了一定的成果，目前較有研究基礎的超抗原主要是金黃色葡萄球菌腸毒素A、B等。因為超抗原無抗腫瘤的特異性，它也會作用于表達MHC II類分子的正常細胞上，直接用于抗腫瘤會產生副作用，臨床使用有很多的限制。
為了解決超抗原的無抗腫瘤特異性問題，人們將超抗原連接到抗體上，由抗癌抗體將超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A，SEA)定位到癌細胞上(M.Dohlsten，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8945-8949，1994；J.Ihle，et al，Cancer Res.，55，623-628，1995)。該SEA基因早在80年代就報道了(I.Y.Huang，et al，J.Biol.Chem.，262，7006-7013，1987；M.J.Betley and J.J.Mekalanos，J.Bacteriol.，170，34-41，1988)。
除了抗體外，與癌細胞生長有關的細胞因子也被用于癌細胞的特異性定位。例如表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)被連接到RNA水解酶(H.Jinno，et al，Cancer Chemother.Pharmacol.，38，303-308，1996)和毒素(A.Schmidt，et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000)，堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)和轉化生長因子(Transforming growth factor-α，TGF-α)也分別與毒素形成融合蛋白質(Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000；L.M.Veenendaal，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，7866-7871，2002；A.Kihara andI.Pastan，Cancer Res.，54，5154-5159，1994)。而其它的細胞因子也有報告，例如白細胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)和白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)則分別被連接到毒素上(S.R.Husain，et al，Cancer Res.，58，3649-3653，1998；J.M.Dore，et al，FEBS Lett.，402，50-52，1997)。
以上工作都使用細胞因子與蛋白質毒素或RNA水解酶所組成的融合蛋白質的形式，思想方法是出于同樣的戰(zhàn)略模式(E.B.Sweeney and J.R.Murphy，Essays Biochem.，30，119-131，1995)。在這些細胞因子的癌細胞定位的作用下，蛋白質毒素和RNA水解酶才特異地殺傷癌細胞。但是這個作用機制不同于抗體的Fc片段以及超抗原，后兩者是動員機體的免疫系統(tǒng)來激發(fā)抗癌的細胞毒作用。
除了上面提到的細胞因子外，激素多肽也被用于類似的實驗，例如促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)、催乳激素(Prolactin，PRL)和促黑激素(α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH)，它們被連接到一個毒素蛋白而形成融合蛋白質(A.Nechushtan，et al，J.Biol.Chem.，272，11597-11603，1997；Z.Wen，et al，J.Biol.Chem.，266，12289-12293，1991；J.F.Langenheim，et al，Breast Cancer Res.Treat.，90，281-293，2005)。
癌細胞是由正常細胞轉變而來的，癌細胞的抗原是自身抗原，所以癌細胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。人們一直在尋找新的抗癌方法來提高癌癥病人的免疫力，特別是針對癌細胞的特異性免疫力。因此，本領域迫切需要一種特別針對癌細胞的強有力的新的抗癌方法。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種對癌癥具有特異性的，殺傷力強的方法。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種融合蛋白，其含有a)促進癌細胞生長并與癌細胞過度表達受體相對應的配體、與癌細胞受體有親和力及有拮抗作用的人工篩選多肽或直接與癌細胞表面相互作用的多肽分子；
b)能引起抗癌的免疫反應的超抗原。
在該方面的一個優(yōu)選例中，該配體選自促胃液素釋放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)、生長激素釋放激素(Growth hormonereleasing hormone，GHRH)、促性腺激素釋放激素GnRH、促黑激素α-MSH、催乳激素(Prolactin，PRL)、催乳激素釋放激素(Prolactin releasing hormone，PRLH)、生長激素(Growth hormone，GH)、促卵泡激素(Follicle stimulatinghormone，FSH)、胎盤泌乳激素(Placental lactogen，PL)、絨毛膜促性腺激素(Chorionic gonadotropin，CG)和促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropinreleasing hormone，CRH)等以及其它與癌癥或免疫疾病有關聯的配體，及其氨基酸序列有70％以上的相同性的自然變異體和人為的變異體。更優(yōu)選的，選自促胃液素釋放肽GRP、生長激素釋放激素GHRH、促性腺激素釋放激素GnRH、促黑激素α-MSH和催乳激素PRL。
在該方面的另一個優(yōu)選例中，該超抗原選自金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA、SEB、SEC、SED、SEE，鏈球菌毒素的SPE-A、SPE-B、SPE-C，金黃色鏈球菌毒休克綜合征毒素、鏈球菌有絲分裂外毒素、鏈球菌超抗原、病毒蛋白以及其氨基酸序列有70％以上的相同性的自然和人為的變異體。更優(yōu)選的，選自金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA。
在該方面的還有一個優(yōu)選例中，超抗原是SEA蛋白；配體選自表皮生長因子和血管內皮細胞生長因子。
在該方面的一個優(yōu)選例中，融合蛋白含有(a)超抗原；(b)配體；(c)可操縱性連接超抗原和配體的接頭。更優(yōu)選的，超抗原是SEA蛋白；配體選自GRP、GHRH、GnRH、α-MSH、或PRL；所述接頭具有SEQ ID NO11的核苷酸序列。更優(yōu)選的，該接頭編碼SEQ ID NO12的氨基酸序列。
在該方面的一個優(yōu)選例中，融合蛋白具有SEQ ID NO1、3、5、7或9的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。優(yōu)選融合蛋白具有SEQ ID NO2、4、6、8或10的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種重組載體，含有編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明的還有一個方面提供了一種宿主細胞，含有上述重組載體。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產上述融合蛋白的方法，包括步驟培養(yǎng)上述宿主細胞，收集表達的上述融合蛋白。
在該方面的一個優(yōu)選例中，還包括純化收集的融合蛋白的步驟。
在本發(fā)明的還有一個方面，提供了上述融合蛋白用于制備治療癌癥或免疫疾病的藥物的用途。
為了有效地開發(fā)針對癌癥的特異性藥物，本發(fā)明利用超抗原和激素的各自特性，構建一種新型激素-超抗原融合蛋白質，促進癌細胞生長或與癌細胞表面受體相對應的激素可以將融合蛋白質定位到癌細胞上，而超抗原則在癌細胞周圍引起抗癌的免疫反應，即超抗原依賴的細胞介導的細胞毒作用(Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity，SDCC)。利用此方法就可以將這種類型的融合蛋白質特異地定位到癌細胞并在癌細胞周圍引起抗癌的細胞毒免疫反應。
本發(fā)明選擇了一個嶄新的戰(zhàn)略，將超抗原連接到激素或短肽上，這樣產生了新型的細激素-超抗原融合蛋白質，作為一類模型，本發(fā)明使用生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素、促黑激素和催乳激素分別與超抗原SEA來構建這種新型的融合蛋白質。而選擇另一個與癌有關的促胃液素釋放肽作為構建融合蛋白質的一部分，表明了像激素那樣的小分子多肽也能夠起到癌細胞定位的作用。
在此雖然只選擇超抗原SEA，當然超抗原SEB和SEC以及其它超抗原也能夠說明本發(fā)明的思想?？乖璖EA或其它超抗原的作用是激發(fā)機體內的免疫反應。
同樣，作為實驗材料的4種激素以及一個短肽分子只是利用它們癌細胞的定位作用，采用與癌細胞緊密相關的其它激素和短肽分子也能夠說明本發(fā)明的思想。
考慮到本發(fā)明的融合蛋白質可以由各種類型的激素與超抗原構建，所以采用了一個通用的蛋白質純化方法，即按照同樣的方法來純化各種融合蛋白質。此方法是利用6個組氨酸作為純化用的Tag，質粒pET-40b(Novagen公司)含有這個6His-Tag。
采用與癌緊密有關的激素作為癌細胞定向的載體，是因為癌細胞通常大量表達這些激素的受體。而正常細胞膜上的這些受體的表達量沒有或很少，所以激素也可以起著癌細胞的特異性定位作用。利用激素能認識癌細胞的特性，把超抗原SEA分別連接到GRP、GHRH、GnRH、α-MSH、或PRL激素上，就能使得SEA集中在癌細胞的周圍，特異地激發(fā)免疫反應，產生極其強大的針對癌細胞的細胞毒作用。單獨使用超抗原SEA會產生全身用藥的副作用，而采用融合蛋白質就會使得只在癌組織周圍集中由SEA所誘導的大量T殺傷細胞。
超抗原SEA與T細胞激活產生增殖和產生細胞毒作用呈劑量依賴關系，其范圍在每只小鼠0.1μg～100μg，最大效應出現在注射后24小時，96小時內消失，SDCC最大效應濃度為每只小鼠1μg，效應高峰在第48小時，96小時內消失(G.Hedlund，et al，Cancer Immunol.Immunother.，36，89-93，1993)。
所以融合蛋白質可以發(fā)揮類似于抗體-SEA的作用，而采用這個方法能夠節(jié)約藥物開發(fā)成本，例如小鼠抗體人源化和大規(guī)模動物細胞表達生產。所以超抗原SEA的藥物就能大大地降低藥物生產和病人醫(yī)療成本，同樣含有超抗原SEA的本發(fā)明的融合蛋白質也可以大大地降低使用劑量。
GRP-SEA、GHRH-SEA、GnRH-SEA、α-MSH-SEA和PRL-SEA僅僅是用來說明本發(fā)明的材料，而本發(fā)明的思想范圍可以拓展，例如可以采用各種類型的激素和超抗原以及它們的變異體，對融合蛋白質的結構進行改造，這些變異體可以完善其生物學功能以及減少其可能產生的副作用。例如SEA在第227位置的氨基酸改造(J.Hansson，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，2489-2494，1997)或其它位置上的改造后的變異體(E.Erlandsson，et al，J.Mol.Biol.，333，893-905，2003)可以大大地降低副作用。
融合蛋白質可以是GRP-SEA、GHRH-SEA、GnRH-SEA、α-MSH-SEA和PRL-SEA形式，也可以是SEA-GRP、SEA-GHRH、SEA-GnRH、SEA-α-MSH和SEA-PRL形式，在空間上兩種蛋白質是獨立的，所以兩種形式都可以使得細胞因子和超抗原獨立地發(fā)揮作用。
連接這兩種蛋白質的接頭的氨基酸組分和長度則可以是各種形式，過短的接頭會造成細胞因子和超抗原因過分接近而產生空間阻礙，合適的接頭對于充分發(fā)揮細胞因子和超抗原的作用是至關重要的。
以上的各種融合蛋白質基因可以轉入動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母、細菌等生物體在內的重組工程化宿主細胞，表達方式可以是分泌和不分泌等各種形式。無細胞體外翻譯系統(tǒng)也可以用來進行融合蛋白質的生產。
當然融合蛋白質也可以通過化學交聯反應等化學反應手段分別將激素和超抗原的多肽片段進行連接，例如共價鍵連接，從而構建成融合蛋白質。
對于融合蛋白質可以進行化學修飾、缺損融合蛋白質的一部分多肽片段以及將其它多肽連接在這些蛋白質上等一系列的改造。
本發(fā)明闡述的是一種新的抗癌方法，即把激素和超抗原構建成融合蛋白質，由激素將超抗原定位到癌細胞上，從而在癌細胞周圍發(fā)生抗癌的細胞毒免疫反應。
從更大的范圍來看，激素與其癌細胞表面上過度表達的受體實際上是一種配體(Ligand)和受體之間相互作用的關系，利用這種配體和受體的親和力，將超抗原定位到腫瘤組織。除了激素多肽外，還包括細胞因子，例如表皮生長因子EGF家族、血管內皮細胞生長因子VEGF家族、堿性成纖維細胞生長因子bFGF及FGF家族、轉化生長因子TGF-α、白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-6、白細胞介素-13、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF、肝素結合EGF樣生長因子、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子、胎盤生長因子、干細胞因子、白細胞介素-8、Heregulin、erbB配體、各種趨化因子，以及其它有與癌細胞過度表達受體相對應的多肽分子即配體也可用于癌細胞的特異性定位。這樣的物質有Ephrin家族、血管生成素，Ang、血小板生成素TPO和凝血因子VII、尿激酶型纖溶酶原激活物uPA、生長抑素SST、去唾液酸糖蛋白ASGP、低密度脂蛋白LDL和轉鐵蛋白Tf等，許多腫瘤組織都過量表達這些物質的受體，從而這些蛋白等多肽分子配體就可以像激素那樣與超抗原相連接形成融合蛋白質，將超抗原定位到腫瘤組織。
除了上面所說的與癌細胞上的受體對應的配體外，從噬菌體展示(phagedisplay)等方法篩選到的與癌細胞上的受體有親和力并有拮抗作用的人工篩選多肽以及其它能夠直接與癌細胞表面相互作用的多肽分子都可以和超抗原形成融合蛋白質。
細胞因子例如EGF和VEGF等也可以起到激素類似的作用，即與超抗原構建融合蛋白質，EGF和VEGF能將超抗原定位到癌細胞周圍。在通常情況下，與有些激素比較，細胞因子的分子量較大，EGF有51個氨基酸，VEGF超過100個氨基酸。而GRP、GHRH、GnRH、α-MSH和PRL分別是27、44、10、13和199個氨基酸，在此只是PRL分子量較大，在通常情況下激素的上游調控激素例如GnRH等都是小分子的多肽。另外細胞因子常含有二硫鍵，需要蛋白質復性操作，而此處所選的激素不含二硫鍵。所以激素和超抗原的融合蛋白的生產成本要比細胞因子和超抗原的融合蛋白低，操作更簡便。激素和超抗原的融合蛋白更能針對特定器官的腫瘤例如卵巢癌、乳腺癌、子宮癌和前列腺癌等。
本發(fā)明采用pET-40b質粒(Novagen公司，美國)，它含有一個與目標蛋白共表達的參與二硫鍵復性DsbC蛋白，這個體系有利于外源基因所表達的產物保持生物活性。這個質粒供外源基因插入的地方含有多個限制性內切酶位點，可以很方便地插入超抗原和激素，從而形成各種融合蛋白質。對于10個氨基酸短肽的激素，只用引物就可以將編碼這個激素的核酸序列導入質粒。
融合蛋白質不但可以起著和抗體相似的特異性抗癌作用，而且由超抗原所激發(fā)的T細胞殺傷效果要大于抗體，使用劑量卻遠遠低于抗體藥物的用量，這樣就可以大大地降低生產成本。
作為藥物形式應用的以上各種類型的融合蛋白質可應用于抗癌和免疫疾病等醫(yī)學的臨床方面，它們和防腐劑、乳化劑、脂質體、分散劑、安定化劑等一起制成各種注射、口服、敷貼以及手術處理等藥物的給藥形式。
除了融合蛋白質本身可以作為藥物外，編碼融合蛋白質的核苷酸片段或載體還可以作為基因治療形式來應用。例如將這些核苷酸片段注射動物體內并被轉入細胞，從而表達融合蛋白質。


圖1表示用pET-40b質粒構建各種融合蛋白質基因及其表達。
圖2和圖3表示了5種融合蛋白抑制腫瘤細胞的實驗。
具體實施例方式
以下實施例是為了更清楚的說明本發(fā)明，而不是為了特別限制。
實施例1、合成超抗原SEA基因根據早已發(fā)表的SEA基因序列論文，它含有699個堿基，進行人工全合成(Takara公司，日本)，還加上一個編碼多肽接頭堿基序列SEQ ID NO11，它在SEA的上游，在這個合成的核酸序列的起始部位有SalI和HindIII限制性內切酶位點，它的末端有NotI和XhoI限制性內切酶位點。用限制性內切酶處理，就可以將這個DNA片段插入pET-40b質粒。反應條件是，HindIII在M緩沖液37℃和5個小時，然后再進行NotI處理，條件是H緩沖液37℃和5個小時，在這個反應緩沖液里再加入牛血清白蛋白和和Triton試劑。將限制性內切酶處理后的片段進行純化以去除HindIII和NotI，加入同樣經過HindIII和XhoI處理過的pET-40b質粒，再加入DNA連接酶進行16℃連接反應。最后將這個含有SEA基因及接頭的pET-40b質粒轉入大腸桿菌JM109，這樣就得到了帶有SEA基因的pET-40b質粒，可作為構建融合蛋白質基因的材料。
實施例2、制備生長激素釋放激素GHRH和超抗原SEA融合蛋白基因根據生長激素釋放激素GHRH的GenBank信息(ACCESSION，NM_021081)人工全合成一個編碼44個氨基酸成熟多肽的核酸序列(Takara公司，日本)，并且在它的兩端增添限制性內切酶位點，上游是BamHI和EcoRI位點，下游是SalI和HindIII位點。在此可以同時進行EcoRI和SalI處理，反應條件是H緩沖液37℃和5個小時。然后將這個片段與經過EcoRI和SalI處理過的實施例1中所得到的帶有SEA基因的pET-40b質?；旌?，加入DNA連接酶進行16℃連接反應。最后將其轉入大腸桿菌JM109，篩選陽性菌落并提取質粒，這樣就得到了包含GHRH和SEA融合蛋白基因的質粒。
實施例3、制備促性腺激素釋放激素GnRH和超抗原SEA融合蛋白基因由于促性腺激素釋放激素GnRH只是一個10氨基酸的多肽，可以直接合成編碼此多肽的堿基序列的引物。
1、包含促性腺激素釋放激素GnRH序列的正向引物，5’-CGCGGATCCGAATTCGCAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGAGTCGACAAGCTTGGCGGAGGTGGCTCCGGC(SEQ ID NO13)，下線表注的是GnRH序列，上游含有BamHI和EcoRI位點，下游含有SalI和HindIII位點。
2、含有NotI和XhoI限制性內酶切點的SEA基因反向引物，5’-CCGCTCGAGTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’(SEQ ID NO14)。
利用這兩個引物，對實施例1含有SEA基因的質粒進行PCR反應，PCR反應的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃100秒，一共是30個循環(huán)反應，最后是72℃10分鐘。將所得片段進行EcoRI和XhoI處理，插入不含外源基因的pET-40b質粒，這樣就得到了包含GnRH和SEA融合蛋白基因的質粒。
實施例4、制備促黑激素α-MSH和超抗原SEA融合蛋白基因促黑激素α-MSH也是一個短肽，由13個氨基酸組成。它也可引物方法來合成此多肽的堿基序列。
1、包含限制性內切酶和促黑激素α-MSH序列的正向引物，5’-CGCGGATCCGAATTCGTCCTACTCCATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGTCGACAAGCTTGGCGGAGGTGGCTCCGGC(SEQ ID NO15)，下線表注的是α-MSH序列，上游含有BamHI和EcoRI位點，下游含有SalI和HindIII位點。
2、含有NotI和XhoI限制性內酶切點的SEA基因反向引物，5’-CCGCTCGAGTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’(SEQ ID NO14)。
利用這兩個引物，對實施例1含有SEA基因的質粒進行PCR反應，PCR反應的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃100秒，一共是30個循環(huán)反應，最后是72℃10分鐘。將所得片段進行EcoRI和XhoI處理，插入不含外源基因的pET-40b質粒，這樣就得到了包含α-MSH和SEA融合蛋白基因的質粒。
實施例5、制備催乳激素PRL和超抗原SEA融合蛋白基因根據催乳激素PRL的GenBank信息(ACCESSION，NP_000939)人工全合成一個編碼199個氨基酸成熟多肽的核酸序列(Takara公司，日本)，并且在它的兩端增添限制性內切酶位點，上游是BamHI和EcoRI位點，下游是SalI和HindIII位點。在此可以同時進行BamHI和SalI處理，反應條件是H緩沖液37℃和5個小時。然后將這個片段與經過BamHI和SalI處理過的實施例1中所得到的帶有SEA基因的pET-40b質?；旌?，加入DNA連接酶進行16℃連接反應。最后將其轉入大腸桿菌JM109，篩選陽性菌落并提取質粒，這樣就得到了包含PRL和SEA融合蛋白基因的質粒。
實施例6、促胃液素釋放肽GRP和超抗原SEA融合蛋白基因促胃液素釋放肽GRP由27個氨基酸組成(E.R.Spindel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5699-5703，1984)，在此人工全合成一個編碼這個多肽的核酸序列(Takara公司，日本)，并且在它的兩端增添限制性內切酶位點，上游是BamHI和EcoRI位點，下游是SalI和HindIII位點。在此可以同時進行BamHI和SalI處理，反應條件是H緩沖液37℃和5個小時。然后將這個片段與經過BamHI和SalI處理過的實施例1中所得到的帶有SEA基因的pET-40b質?；旌希尤隓NA連接酶進行16℃連接反應。最后將其轉入大腸桿菌JM109，篩選陽性菌落并提取質粒，這樣就得到了包含PRL和SEA融合蛋白基因的質粒。
實施例7、各種融合蛋白基因的測序鑒定利用美國Novagen公司的引物pET upstream primer(Cat.No.69214-3)和T7terminator primer(Cat.No.69337-3)對于攜帶融合蛋白基因的pET-40b質粒進行DNA序列測定。
序列表中的SEQ ID NO1是生長激素釋放激素(GHRH)-接頭-超抗原-(SEA)融合蛋白質基因的序列，SEQ ID NO2是SEQ ID NO1的氨基酸序列。從第1位氨基酸到第44位氨基酸的多肽是GHRH，從第45位氨基酸到第63位氨基酸的多肽是接頭，從第64位氨基酸到第296位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO3是促性腺激素釋放激素(GnRH)-接頭-超抗原-(SEA)融合蛋白質基因的序列，SEQ ID NO4是SEQ ID NO3的氨基酸序列。從第1位氨基酸到第10位氨基酸的多肽是GnRH，從第11位氨基酸到第29位氨基酸的多肽是接頭，從第30位氨基酸到第262位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO5是促黑激素(α-MSH)-接頭-超抗原-(SEA)融合蛋白質基因的序列，SEQ ID NO6是SEQ ID NO5的氨基酸序列。從第1位氨基酸到第13位氨基酸的多肽是α-MSH，從第14位氨基酸到第32位氨基酸的多肽是接頭，從第33位氨基酸到第265位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO7是催乳激素(PRL)-接頭-超抗原-(SEA)融合蛋白質基因的序列，SEQ ID NO8是SEQ ID NO7的氨基酸序列。從第1位氨基酸到第199位氨基酸的多肽是PRL，從第200位氨基酸到第218位氨基酸的多肽是接頭，從第219位氨基酸到第451位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO9是促胃液素釋放肽(GRP)-接頭-超抗原-(SEA)融合蛋白質基因的序列，SEQ ID NO10是SEQ ID NO9的氨基酸序列。從第1位氨基酸到第27位氨基酸的多肽是GRP，從第28位氨基酸到第46位氨基酸的多肽是接頭，從第47位氨基酸到第279位氨基酸的多肽是SEA。
實施例8、分離純化各種融合蛋白質由于pET-40b質粒含有一個前導的DsbC蛋白，下游的融合蛋白質將被輸送到大腸桿菌細胞間質，所以可用滲透壓方法取得融合蛋白粗抽提液。由于表達各種融合蛋白的質粒系統(tǒng)是相同的，所以可采用相同的方法分離純化所需蛋白質。
首先把表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)，進行前培養(yǎng)，然后加入IPTG進行誘導，收集少量菌體，加入0.5ml緩沖液(0.5M蔗糖，pH8.0)并混合，冰上靜置10分鐘，再加入0.75ml 5倍稀釋的緩沖液，冰上靜置30分鐘，然后離心，得到上清液。
由于融合蛋白與DsbC蛋白共表達即它與DsbC連在一起的，所以用蛋白酶Enterokinase(Novagen公司，美國)處理，從而將DsbC除去。
純化方法采用美國Novagen公司系統(tǒng)，加入等量Binding Buffer到上清液，然后上樣到His Bind Column，先用Wash Buffer洗，然后用Elute Buffer將融合蛋白洗脫下來，再對20mM磷酸緩沖液(pH7.0)進行透析，這樣就得到了純化的融合蛋白。
實施例9、融合蛋白質體外抑制腫瘤細胞生長先將健康人外周血單個核細胞PBMC和人乳腺癌細胞株MCF-7、人前列腺癌細胞株DU145、人黑色素瘤細胞株NEL-M1和人非小細胞肺癌細胞株A549的濃度調整至大約2×104-4×104細胞/ml，將腫瘤細胞稀釋5倍并接種于96孔培養(yǎng)板，然后再加入沒有稀釋的PBMC，這樣PBMC與腫瘤細胞Hep2的效靶比為5∶1，這樣含有兩種細胞的96孔培養(yǎng)板制做兩份。最后分別加入經過除菌過濾的GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白，使終濃度分別為0.00，0.05，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00μg/ml。將96孔培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48小時。
另外在含有腫瘤細胞株的96孔培養(yǎng)板中分別只加入GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白作為對照實驗。
在效靶比5∶1的情況下，各種融合蛋白的濃度達到3μg/ml時就顯示出對于腫瘤細胞的最大抑制率，圖2表示了各種融合蛋白抑制腫瘤細胞的效果，這個結果說明了GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白可以激活免疫細胞。
而在單獨加入PBMC、或各種融合蛋白的情況下，沒有觀察到腫瘤細胞被抑制的現象。
序列表<110>孫嘉琳<120>癌靶向超抗原融合蛋白質及其生產方法<150>
<151>
<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>888<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(888)<223>融合蛋白的編碼序列<400>1tatgcagatg ccatcttcac caacagctac cggaaggtgc tgggccagct gtccgcccgc 60aagctgctcc aggacatcat gagcaggcag cagggagaga gcaaccaaga gcgaggagca120agggcacggc ttgtcgacaa gcttggcgga ggtggctccg gcggaggtgg ctctggcggt180ggcggatcga gcgagaaaag cgaagaaata aatgaaaaag atttgcgaaa aaagtctgaa240ttgcagggaa cagctttagg caatcttaaa caaatctatt attacaatga aaaagctaaa300actgaaaata aagagagtca cgatcaattt ttacagcata ctatattgtt taaaggcttt360tttacagatc attcgtggta taacgattta ttagtagatt ttgattcaaa ggatattgtt420gataaatata aagggaaaaa agtagacttg tatggtgctt attatggtta tcaatgtgcg480ggtggtacac caaacaaaac agcttgtatg tatggtggtg taacgttaca tgataataat540cgattgaccg aagagaaaaa agtgccgatc aatttatggc tagacggtaa acaaaataca600gtacctttgg aaacggttaa aacgaataag aaaaatgtaa ctgttcagga gttggatctt660caagcaagac gttatttaca ggaaaaatat aatttatata actctgatgt ttttgatggg720aaggttcaga ggggattaat cgtgtttcat acttctacag aaccttcggt taattacgat780ttatttggtg ctcaaggaca gtattcaaat acactattaa gaatatatag agataataaa840acgattaact ctgaaaacat gcatattgat atatatttat atacaagt 888<210>2<211>296<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(296)<223>融合蛋白
<400>2Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu Val Asp Lys Leu35 40 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser50 55 60Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu65 70 75 80Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn85 90 95Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln100 105 110His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn115 120 125Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys130 135 140Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala145 150 155 160Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu165 170 175His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu180 185 190Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr195 200 205Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg210 215 220Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly225 230 235 240Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser245 250 255Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu260 265 270Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His275 280 285Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser290 295<210>3<211>786<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(786)<223>融合蛋白的編碼序列<400>3
cagcactggt cctatggact gcgccctgga gtcgacaagc ttggcggagg tggctccggc 60ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgagc gagaaaagcg aagaaataaa tgaaaaagat120ttgcgaaaaa agtctgaatt gcagggaaca gctttaggca atcttaaaca aatctattat180tacaatgaaa aagctaaaac tgaaaataaa gagagtcacg atcaattttt acagcatact240atattgttta aaggcttttt tacagatcat tcgtggtata acgatttatt agtagatttt300gattcaaagg atattgttga taaatataaa gggaaaaaag tagacttgta tggtgcttat360tatggttatc aatgtgcggg tggtacacca aacaaaacag cttgtatgta tggtggtgta420acgttacatg ataataatcg attgaccgaa gagaaaaaag tgccgatcaa tttatggcta480gacggtaaac aaaatacagt acctttggaa acggttaaaa cgaataagaa aaatgtaact540gttcaggagt tggatcttca agcaagacgt tatttacagg aaaaatataa tttatataac600tctgatgttt ttgatgggaa ggttcagagg ggattaatcg tgtttcatac ttctacagaa660ccttcggtta attacgattt atttggtgct caaggacagt attcaaatac actattaaga720atatatagag ataataaaac gattaactct gaaaacatgc atattgatat atatttatat780acaagt 786<210>4<211>262<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(262)<223>融合蛋白<400>4Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Val Asp Lys Leu Gly Gly1 5 10 15Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys20 25 30Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln35 40 45Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys50 55 60Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr65 70 75 80Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu85 90 95Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys100 105 110Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly115 120 125Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp130 135 140Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu145 150 155 160Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys165 170 175Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu180 185 190Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val
195 200 205Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn210 215 220Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg225 230 235 240Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp245 250 255Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser260<210>5<211>795<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(795)<223>融合蛋白的編碼序列<400>5tcctactcca tggagcactt ccgctggggc aagccggtgg tcgacaagct tggcggaggt 60ggctccggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgagcg agaaaagcga agaaataaat120gaaaaagatt tgcgaaaaaa gtctgaattg cagggaacag ctttaggcaa tcttaaacaa180atctattatt acaatgaaaa agctaaaact gaaaataaag agagtcacga tcaattttta240cagcatacta tattgtttaa aggctttttt acagatcatt cgtggtataa cgatttatta300gtagattttg attcaaagga tattgttgat aaatataaag ggaaaaaagt agacttgtat360ggtgcttatt atggttatca atgtgcgggt ggtacaccaa acaaaacagc ttgtatgtat420ggtggtgtaa cgttacatga taataatcga ttgaccgaag agaaaaaagt gccgatcaat480ttatggctag acggtaaaca aaatacagta cctttggaaa cggttaaaac gaataagaaa540aatgtaactg ttcaggagtt ggatcttcaa gcaagacgtt atttacagga aaaatataat600ttatataact ctgatgtttt tgatgggaag gttcagaggg gattaatcgt gtttcatact660tctacagaac cttcggttaa ttacgattta tttggtgctcaag gacagta ttcaaataca720ctattaagaa tatatagaga taataaaacg attaactctg aaaacatgca tattgatata780tatttatata caagt 795<210>6<211>265<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(265)<223>融合蛋白<400>6Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Val Asp Lys1 5 10 15Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 25 30Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser
35 40 45Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr50 55 60Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu65 70 75 80Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr85 90 95Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr100 105 110Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys115 120 125Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr130 135 140Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn145 150 155 160Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys165 170 175Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg180 185 190Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp195 200 205Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro210 215 220Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr225 230 235 240Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met245 250 255His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser260 265<210>7<211>1353<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1353)<223>融合蛋白的編碼序列<400>7ttgcccatct gtcccggcgg ggctgcccga tgccaggtga cccttcgaga cctgtttgac 60cgcgccgtcg tcctgtccca ctacatccat aacctctcct cagaaatgtt cagcgaattc120gataaacggt atacccatgg ccgggggttc attaccaagg ccatcaacag ctgccacact180tcttcccttg ccacccccga agacaaggag caagcccaac agatgaatca aaaagacttt240ctgagcctga tagtcagcat attgcgatcc tggaatgagc ctctgtatca tctggtcacg300gaagtacgtg gtatgcaaga agccccggag gctatcctat ccaaagctgt agagattgag360gagcaaacca aacggcttct agagggcatg gagctgatag tcagccaggt tcatcctgaa420accaaagaaa atgagatcta ccctgtctgg tcgggacttc catccctgca gatggctgat480gaagagtctc gcctttctgc ttattataac ctgctccact gcctacgcag ggattcacat540aaaatcgaca attatctcaa gctcctgaag tgccgaatca tccacaacaa caactgcgtc600
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<221>misc_feature<222>(1)..(451)<223>融合蛋白<400>8Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg1 5 10 15Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu20 25 30Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg35 40 45Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala50 55 60Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe65 70 75 80Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr85 90 95His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile100 105 110Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu115 120 125Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn130 135 140Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp145 150 155 160Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg165 170 175Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg180 185 190Ile Ile His Asn Asn Asn Cys Val Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu210 215 220Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala225 230 235 240Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr245 250 255Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe260 265 270Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp275 280 285Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp290 295 300Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn305 310 315 320Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg325 330 335Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys340 345 350Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val355 360 365Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys370 375 380Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly385 390 395 400Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu405 410 415Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg420 425 430Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu435 440 445Tyr Thr Ser450<210>9<211>837<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(837)<223>融合蛋白的編碼序列<400>9gtcccgctgc ctgcgggcgg agggaccgtg ctgaccaaga tgtacccgcg cggcaaccac 60tgggcggtgg ggcacttaat ggtcgacaag cttggcggag gtggctccgg cggaggtggc120tctggcggtg gcggatcgag cgagaaaagc gaagaaataa atgaaaaaga tttgcgaaaa180aagtctgaat tgcagggaac agctttaggc aatcttaaac aaatctatta ttacaatgaa240aaagctaaaa ctgaaaataa agagagtcac gatcaatttt tacagcatac tatattgttt300aaaggctttt ttacagatca ttcgtggtat aacgatttat tagtagattt tgattcaaag360gatattgttg ataaatataa agggaaaaaa gtagacttgt atggtgctta ttatggttat420
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<221>misc_feature<222>(1)..(279)<223>融合蛋白<400>10Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro1 5 10 15Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Val Asp Lys Leu Gly20 25 30Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu35 40 45Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu50 55 60Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu65 70 75 80Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His85 90 95Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp100 105 110Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly115 120 125Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly130 135 140Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His145 150 155 160Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp165 170 175Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn180 185 190Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr195 200 205Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys210 215 220Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val225 230 235 240Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu245 250 255
Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile260 265 270Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser275<210>11<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(57)<223>人工序列<400>11gtcgacaagc ttggcggagg tggctccggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcg57<210>12<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>連接肽<400>12Val Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly1 5 10 15Gly Gly Ser<210>13<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(76)<223>引物<400>13cgcggatccg aattcgcagc actggtccta tggactgcgc cctggagtcg acaagcttgg60cggaggtggc tccggc76<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>引物<400>14ccgctcgagt gcggccgcac ttgtatataa atatatatca atatgcat 48<210>15<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(85)<223>引物<400>15cgcggatccg aattcgtcct actccatgga gcacttccgc tggggcaagc cggtggtcga60caagcttggc ggaggtggct ccggc 8權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白含有a)促進癌細胞生長并與癌細胞過度表達受體相對應的配體、與癌細胞受體有親和力及有拮抗作用的人工篩選多肽或直接與癌細胞表面相互作用的多肽分子；b)能引起抗癌的免疫反應的超抗原。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的促進癌細胞生長并與癌細胞過度表達受體相對應的配體選自促胃液素釋放肽、生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素、促黑激素、促胃液素釋放肽、催乳激素、催乳激素釋放激素、生長激素、促卵泡激素、胎盤泌乳激素、絨毛膜促性腺激素、促腎上腺皮質激素釋放激素、表皮生長因子EGF家族、血管內皮細胞生長因子VEGF家族、堿性成纖維細胞生長因子bFGF及FGF家族、轉化生長因子TGF-α、白細胞介素-4、白細胞介素-2、白細胞介素-6、白細胞介素-13、肝素結合EGF樣生長因子、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子、胎盤生長因子、干細胞因子、白細胞介素-8、Ephrin家族、Heregulin、erbB配體、趨化因子、血管生成素、血小板生成素、凝血因子VII、尿激酶型纖溶酶原激活物、生長抑素、去唾液酸糖蛋白、低密度脂蛋白和轉鐵蛋白以及其它與癌癥或免疫疾病有關聯的配體，及其自然變異體和人為的變異體，以及能與癌細胞表面受體相互作用的人工多肽分子。
3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，該自然變異體和人為的變異體的氨基酸序列與所述配體有70％以上的相同性。
4.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的能起抗癌的免疫反應的超抗原選自金黃色葡萄球菌腸毒素、鏈球菌毒素、金黃色鏈球菌毒休克綜合征毒素、鏈球菌有絲分裂外毒素、鏈球菌超抗原、病毒蛋白及其自然和人為的變異體。
5.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌腸毒素選自SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SER、SET，所述鏈球菌毒素選自SPE-A、SPE-B、SPE-C、SPE-F、SPE-G、SPE-H、SPE-I、SPE-J、SPE-L、SPE-M。
6.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的促進癌細胞生長并與癌細胞過度表達受體相對應的配體選自促胃液素釋放肽、生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素、促黑激素和催乳激素。
7.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的能起抗癌的免疫反應的超抗原為金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA。
8.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述超抗原是SEA蛋白；所述配體選自促胃液素釋放肽、生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素、促黑激素和催乳激素。
9.一種重組載體，其特征在于含有編碼權利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列。
10.一種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞含有權利要求9所述的重組載體。
11.一種生產權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，培養(yǎng)權利要求10所述的宿主細胞，收集表達的權利要求1所述的融合蛋白。
12.權利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療癌癥或免疫疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種融合蛋白，含有a)促進癌細胞生長并與癌細胞過度表達受體相對應的配體、與癌細胞受體有親和力及有拮抗作用的人工篩選多肽或直接與癌細胞表面相互作用的多肽分子；b)能引起抗癌的免疫反應的超抗原。還公開了含有該融合蛋白的表達載體和宿主細胞，制備這種融合蛋白的方法，以及該融合蛋白用于制備治療癌癥或免疫反應的藥物的用途。
文檔編號C12N15/62GK1880336SQ20051007877
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月15日 優(yōu)先權日2005年6月15日
發(fā)明者孫嘉琳 申請人:孫嘉琳