專利名稱：制備有義rna長(zhǎng)鏈的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生長(zhǎng)的有義(sense)RNA鏈的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組完整序列的完成提供了用于生物學(xué)研究的大量的DNA序列信息。人類基因組信息最顯著的應(yīng)用之一是微陣列技術(shù)。利用寡核苷酸或互補(bǔ)DNA(cDNA)的高密度陣列，可以從與疾病、癌癥、細(xì)胞循環(huán)、與環(huán)境接觸等有關(guān)的細(xì)胞活性產(chǎn)生大量的基因表達(dá)圖譜。
微陣列可以由cDNA、基因組DNA制得，最近發(fā)現(xiàn)可以由寡核苷酸引物制得。見例如Lockhart等，Nature 105827-836(2000)。先前，DNA片段被點(diǎn)在尼龍膜上，與放射性標(biāo)記的探針雜交以篩選不同表達(dá)的基因。近來，采用玻璃片作為DNA點(diǎn)陣的基質(zhì)，用熒光進(jìn)行更有效的檢測(cè)。研究顯示基于寡核苷酸的微陣列比基于cDNA的微陣列在靶序列設(shè)計(jì)和檢測(cè)方面有更好的特異性。
至少有三種方法被用于制備測(cè)量基因表達(dá)的標(biāo)記物質(zhì)。例如，RNA可直接用光生物素化方法標(biāo)記?；蛘撸粯?biāo)記的核苷酸可在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中摻入cDNA，或者被標(biāo)記的核苷酸可通過體外轉(zhuǎn)錄摻入反義RNA中。見例如Van Gelder等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871663-1667(1990)。
在此研究領(lǐng)域的一大困難是在制備用于陣列分析的標(biāo)記物質(zhì)時(shí)需要大量的RNA。見例如Wang等，Nature Biotech.18457-459(2000)。而大量的RNA不利于樣品的微陣列雜交分析。
現(xiàn)有的由少量起始材料制備RNA表達(dá)序列的技術(shù)擴(kuò)增反義RNA，并通過將啟動(dòng)子引物摻入mRNA的polyA尾部(3’端)或第一鏈cDNA的5’端。此方法限制了可獲得的RNA的質(zhì)量。從被摻入polyA尾部的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的一個(gè)問題是大量RNA序列不能以全長(zhǎng)形式出現(xiàn)，甚至完全沒有出現(xiàn)，原因是5’外顯子序列沒有被轉(zhuǎn)錄，部分原因是在合成cDNA的第一鏈之前，發(fā)生了內(nèi)含子剪切，并且3’未翻譯區(qū)的長(zhǎng)度是高度可變的，由幾百個(gè)堿基對(duì)至幾千個(gè)堿基。此外，由于大多數(shù)市售的合成寡核苷酸微陣列被設(shè)計(jì)為含有基因的編碼序列，在這樣的微陣列中從3’端擴(kuò)增的反義mRNA很可能無法充分地表述表達(dá)的序列。最終的結(jié)構(gòu)是在RNA群體中不能表示豐富的mRNA序列。本發(fā)明致力于解決這一問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供產(chǎn)生長(zhǎng)的有義RNA鏈(lsRNA)的方法。本發(fā)明的方法包括提供包含5’和3’末端的第一cDNA鏈；將包含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子引物摻入第一cDNA鏈的3’端；合成與第一cDNA鏈互補(bǔ)的第二cDNA鏈；由此將啟動(dòng)子引物摻入雙鏈cDNA；起始cDNA轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生長(zhǎng)的有義RNA鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，摻入啟動(dòng)子引物是連接所述啟動(dòng)子引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過逆轉(zhuǎn)錄摻入啟動(dòng)子引物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一cDNA鏈?zhǔn)菑姆蛛x自生物樣品的第一有義RNA鏈序列合成的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物樣品包含微克量級(jí)以下的總RNA。
在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件新來自選自T7、T3和SP6的啟動(dòng)子。在某些方面，此方法進(jìn)一步包括從有義RNA鏈合成第一cDNA鏈，并重復(fù)上述步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二cDNA鏈?zhǔn)峭ㄟ^PCR擴(kuò)增合成的。在另一實(shí)施方案中，第二cDNA鏈?zhǔn)峭ㄟ^引物延伸合成的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的長(zhǎng)的有義RNA鏈?zhǔn)侨L(zhǎng)RNA序列的轉(zhuǎn)錄物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1RNA分離按照標(biāo)準(zhǔn)的方法(例如用Life技術(shù)公司的Trizol試劑)，利用激光俘獲顯微術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織樣本分離總RNA。用無RNA酶的DNA酶處理總RNA，以去除DNA污染物。用乙醇沉淀總RNA，將其溶解于無核酸酶的水中。用寡(dT)纖維素層析或用Oligotex mRNA分離試劑盒(Qiagen)從總RNA分離poly(A)RNA。
第一cDNA鏈的合成在小的反應(yīng)體積(5μl)中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。簡(jiǎn)要地說，1μl的RNA與4μl的主混合物溶液混合。將混合物短暫地離心，在42℃下溫育60分鐘，在50℃下溫育30分鐘，然后在65℃下溫育10分鐘，使酶滅活。
第一cDNA鏈的純化在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)之后，通過RNA酶處理去除RNA。然后將cDNA在92℃下加熱2分鐘，立即在冰上冷卻2分鐘，再短暫離心。向cDNA中加入一種混合物，每一毫升的混合物含有0.1單位的Rnase I，和0.2的單位的Rnase H。在37℃下溫育20分鐘以進(jìn)行RNA消化。然后加入2.5倍體積的冷乙醇(15μl)，用攪拌器(vortex)混合。在-80℃下或在干冰中保溫5分鐘后，在4℃，16000g下離心15分鐘，使cDNA沉淀。用70％冷乙醇洗滌沉淀物，在空氣中干燥，在蒸餾水中重新溶解。
T7啟動(dòng)子引物連接如下設(shè)計(jì)T7啟動(dòng)子對(duì)于用T4 DNA連接酶的雙鏈引物連接，使用以下兩種互補(bǔ)引物退火。所述引物含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列(下劃線)T7N6 (+)5’-NH2-CGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTA-TAGGCGCNNNNNN-NH2-3’T7-P-N (-)5’-P-GCGCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACT-GGCCGTGTTT-NH2-3’
引物T7N6在3’端含有簡(jiǎn)并序列。在引物合成時(shí)T7N6引物的兩個(gè)末端都被氨基封閉。引物T7-P-N在5’端含有用于連接的磷酸基團(tuán)，在3’端被氨基封閉。兩種引物在92℃下退火2分鐘，緩慢冷卻至室溫。用T4 RNA連接酶將T7啟動(dòng)子序列連接至3’cDNA末端。
實(shí)施例2通過引物延伸合成第二鏈用于引物延伸或PCR擴(kuò)增的引物包括T7PR-25’-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGG-3’此引物用于引物延伸或PCR擴(kuò)增以將單鏈的第一cDNA鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA。
設(shè)計(jì)另一引物T7PR-2-Bio來進(jìn)行引物延伸或PCR擴(kuò)增，以將單鏈的第一cDNA鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA。引物T7PR-2-Bio與T7PR-2相同，但含有5’生物素基團(tuán)，此引物產(chǎn)生帶有5’末端生物素標(biāo)記的雙鏈cDNA。
通過引物延伸來合成第二cDNA鏈。
實(shí)施例3用PCR合成第二鏈用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成第二cDNA鏈。為了避免過多擴(kuò)增造成樣品失真，只進(jìn)行有限次的PCR循環(huán)。PCR擴(kuò)增后，將十分之一的PCR產(chǎn)物在用溴乙錠染色的1×TAE緩沖液中，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。剩余的PCT產(chǎn)物用1μl的蛋白酶K在50℃下消化15分鐘，用酚/氯仿抽提。
實(shí)施例4本發(fā)明的有義mRNA鏈擴(kuò)增方法與商業(yè)上可獲得的反義mRNA擴(kuò)增方法的比較純化雙鏈cDNA。商業(yè)上可獲得的反義mRNA擴(kuò)增方法可用例如Ambion公司或Arcturus公司的試劑盒進(jìn)行。第一輪RNA擴(kuò)增用Arcturus公司的試劑盒，進(jìn)行大約8小時(shí)。對(duì)兩種市售試劑盒而言，第一和第二輪擴(kuò)增至少需要約2-3天。而本發(fā)明的方法僅需要大約8小時(shí)。在產(chǎn)生的mRNA的凝膠比較中，Ambion法或Arcturus法在第一輪的擴(kuò)增后產(chǎn)生的最長(zhǎng)反義mRNA鏈?zhǔn)谴蠹s1.5kb，在第二輪的擴(kuò)增后產(chǎn)生的最長(zhǎng)反義mRNA鏈?zhǔn)谴蠹s0.6kb。而本發(fā)明的方法在第二輪的擴(kuò)增后產(chǎn)生的最長(zhǎng)有義mRNA鏈?zhǔn)谴蠹s2.2kb。因此，本發(fā)明的方法比其他方法產(chǎn)生了長(zhǎng)得多的mRNA序列。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生長(zhǎng)的有義RNA鏈的方法，該方法包括提供包含5’和3’端的第一cDNA鏈；將包含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子引物摻入第一cDNA鏈的3’端；起始從cDNA的轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生長(zhǎng)的有義鏈。
2.權(quán)利要求1的方法，其中啟動(dòng)子引物是雙鏈的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中摻入啟動(dòng)子引物是通過T4DNA連接酶將所述啟動(dòng)子引物與第一cDNA鏈連接。
4.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括在起始從cDNA的轉(zhuǎn)錄之前，合成與第一cDNA鏈互補(bǔ)的第二cDNA鏈。
5.權(quán)利要求1的方法，其中啟動(dòng)子引物是單鏈的，所述方法進(jìn)一步包括在起始cDNA轉(zhuǎn)錄之前，合成與第一cDNA鏈互補(bǔ)的第二cDNA鏈，由此將啟動(dòng)子引物摻入雙鏈cDNA。
6.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括雙鏈cDNA的PCR擴(kuò)增。
7.權(quán)利要求1的方法，其中啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件是選自T7、T3和SP6的啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中引物是生物素標(biāo)記的。
9.權(quán)利要求5的方法，其中雙鏈cDNA是用磁珠純化的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種合成并擴(kuò)增有義RNA鏈的方法。本發(fā)明的方法包括合成探針，所述特征可用于探測(cè)寡核苷酸和cDNA微陣列，以及減法和標(biāo)準(zhǔn)化文庫(kù)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1896234SQ20051008304
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者許軍普, 秦曉華, 趙峰 申請(qǐng)人:北京雅康博生物科技有限公司