專利名稱：農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑及其制備方法與使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組合物，尤其涉及一種含酶的固體組合物試劑，特別涉及一種機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用含酶的固體組合物試劑。
背景技術：
殘留農藥對人類健康的危害是食品安全問題中舉世矚目的熱點之一，世界范圍內由于有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留超標而引起的中毒事件屢有發(fā)生，其中有69.5％是由有機磷農藥所致。因此對食品、環(huán)境中農藥殘留進行監(jiān)測是一件非常重要的工作。目前對于有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測通常采用酶抑制法，利用酶被抑制的程度，借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量，或者通過顏色變化，或者通過酸度測量等方法，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速檢測。在上述酶催化動力學反應體系中，涉及了酶試劑、底物、顯色劑等，而酶試劑在檢測中具有關鍵性作用。一般而言，酶在室溫(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下儲存易于失活(酶在室溫保存不得超過2天，在冰箱冷藏不得超過1周)直接影響農藥殘毒檢測的準確性。在農副產品的產銷過程中，因酶試劑穩(wěn)定性得不到保證，從而影響測量的準確性，使得絕大多數(shù)的農產品在進入餐桌之前，食用的安全性難以得到保證，無公害農產品的品質得不到有效的控制。為了適應農藥殘毒現(xiàn)場檢測的需要，研究酶的固化技術，使固體酶能穩(wěn)定貯存，是一個有效解決問題的途徑。酶的固定化方法很多，如物理吸附法、離子結合法、包埋法、共價結合法、交聯(lián)法等。其中包埋、共價結合、共價交聯(lián)三種方法雖結合力強、但酶活損失較多；吸附法制備簡單，成本低，但結合差，在受到離子強度、pH變化影響后，酶會從載體上游離下來。目前已有的固體酶試劑還不能滿足有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑及其制備方法與使用方法。本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑可在室溫下(20～25℃)穩(wěn)定儲存20天以上，從而克服了已有固體酶試劑存在的缺點，又克服了酶溶液于在-20℃下冷凍儲存由于多次溶凍所帶來的酶活顯著降低的弊病，有效解決了目前有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測存在的問題。
本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑的組分及配比為膽堿酯酶活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶之一 5-50μL、緩沖溶液1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液 5-30mL、2)0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl緩沖溶液 20-50mL、載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP) 2-10g；本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測的固體酶試劑的組分及優(yōu)選配比為膽堿酯酶活度為1000units/mL的乙酰膽堿酶或丁酰膽堿酯酶之一10-30μL、緩沖溶液1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液 8-20mL、2)0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl緩沖溶液 25-40mL、載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP) 5-8g；進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測，酶試劑在檢測中具有關鍵性作用，一般而言，酶在室溫(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下儲存易于失活(酶在室溫保存不得超過2天，在冰箱冷藏不得超過1周)，直接影響農藥殘毒檢測的準確性。常見的酶試劑保存方法一般是將酶溶液進行分裝后于-20℃冷凍儲存的方式以增加酶的儲存周期。但該方法存在著多次溶凍所帶來的酶活性易于降低的問題，如果溶凍次數(shù)超過2次則酶活性降低顯著，使測量結果不穩(wěn)定，因此該方法也不便于實際應用。
為了便于現(xiàn)場快速、準確地檢測農藥殘毒，其分析用化學試劑必須在室溫下具有足夠的穩(wěn)定性、容易保存，反應條件溫和，反應完全，速度快，操作簡單，攜帶方便等特點，只有具備這些特點才能有效地檢測與控制食品中農藥殘毒、真正確保食用安全性。
本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑所選用的固相載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)與酶的結合力適中，通過物理吸附方式進行固體酶的制備，所制得的固體酶可在室溫(20～25℃)下穩(wěn)定儲存20天以上，可以滿足現(xiàn)場檢測農藥殘毒的需要；固體酶的基體對原酶的活性基本無影響，可保證檢測靈敏度；其水溶解性好，便于實驗操作；其成本低，制備方法簡單，便于推廣應。用本發(fā)明固體酶在低溫冷凍下儲存，多次溶凍對其活性影響較小，便于儲存更長時間(-20℃下冷凍可穩(wěn)定儲存2年以上)，決解了目前固體酶存在的結合力不強、酶活損失較多的問題。因此本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測的固體酶試劑配合使用底物試劑、顯色劑試劑及緩沖溶液試劑，可以滿足蔬菜、水果、環(huán)境水或糧食中農藥殘毒現(xiàn)場快速分析的需求并保證測試結果的準確性。
本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑的制備方法，其步驟如下1)酶溶液A的配制將所需的活度為1000units/mL的膽堿酯酶放入燒杯中，用所需的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入所需的0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液稀釋，得到酶溶液B；3)載體的溶解將所需的載體放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體溶解；置于0-4℃冰箱內反應1小時以上，使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉1.0g、2.0g、或6.0g放入2mL的安碚瓶中；抽成真空后封口，置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存。
本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑的使用方法1)配固體酶試劑每個裝有6.0g固體酶試劑的安碚瓶為一個試劑包，每次檢測用量為30mg；使用時，打開安碚瓶直接稱量使用或用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl或磷酸鹽緩沖溶液溶解后使用，每30mg固體酶試劑用4mL緩沖溶液溶解；于開口的安碚瓶中盛裝未用盡的固體酶試劑，應置于干燥器內，于室溫下20日內不失效；2)底物試劑將所需底物試劑用水稀釋；按每0.6g.底物稀釋至100mL刻度處稀釋，每個試劑包內裝10mL；底物為碘化硫代乙酰膽堿、溴化硫代乙酰膽堿、氯化硫代乙酰膽堿、碘化硫代丁酰膽堿、溴化硫代丁酰膽堿膽堿、氯化硫代丁酰膽堿、氯化乙酰膽堿、2，6-二氯靛酚乙酯、2，6-二溴靛酚乙酯、2，6-二氯靛酚丙酯或2，6-二溴靛酚丙酯之一；3)顯色劑試劑，僅酶催化動力學光度法測量時使用；按每0.8g顯色劑稀釋至100mL刻度處稀釋，每個試劑包內裝10mL；顯色劑為5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸(DTNB)；將上述3種試劑包各一個、分別用1個塑料洗瓶盛裝的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液及0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl緩沖溶液各500mL、3-5個塑料滴瓶放入檢測箱中；每個檢測箱中的試劑可檢測待測樣品為0.2～1.0g或待測樣品汁0.1～0.5mL的樣品200組；緩沖溶液使用時也可轉入塑料滴瓶中，方便取用。這樣，在進行現(xiàn)場檢測操作時，便不需要很多玻璃器皿，使得操作方便快捷，可靠性高。
4)檢測使用檢測箱中的試劑，利用酶被抑制的程度，借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量、通過顏色變化或者通過酸度測量方法之一，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
具體實施例方式
在檢測工作中，檢測試劑包中的試劑量可根據(jù)需要按比例擴大或縮小，避免浪費。磷酸鹽緩沖溶液及Tris-HCl緩沖溶液用于提取樣品或作空白提取液，需要量大，可適時補充。檢測時，可先加入酶液，然后加入樣品提取液(或空白提取液)，再加入顯色劑試劑(僅酶催化動力學光度法測量時使用)，最后加入底物，能達到最佳效果。
實施例11)酶溶液A的配制將5μL活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶放入燒杯中，加入0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液5mL，稀釋乙酰膽堿酯酶得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液20mL，稀釋酶溶液A，得到酶溶液B；3)載體的溶解取2.0g載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱內于0-4℃反應1小時以上使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干瓶，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中，每瓶裝1.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存；需要對機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測，按上述使用方法配試劑包，固體酶試劑直接使用，借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
實施例21)酶溶液A的配制將50μL活度為1000units/mL的丁酰膽堿酯酶；加入0.1M pH＝7..8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液30mL，稀釋酶溶液，得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH7＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液50mL，稀釋酶溶液A，得到酶溶液B；3)載體的溶解取10g載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于0-4℃冰箱內反應1小時以上，使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中；每瓶裝6.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存；需要對機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測，按上述使用方法配試劑包，用0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液溶解后使用，每30mg固體酶試劑的用4mL緩沖溶液溶解；借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
實施例31)液A的配制將10μL活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶放入燒杯中，加入0.1MpH＝7.8＝8.2的磷酸鹽緩沖溶液8mL，稀釋酶溶液，得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液25mL，稀釋酶溶液A，得到酶溶液B；3)載體的溶解取5.0g載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱內反應1.0小時以上使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時，；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中，每瓶裝1.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存需要對機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測，按上述使用方法配試劑包，固體酶試劑直接使用，借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
實施例41)酶溶液A的配制將30μL活度為1000units/mL的丁酰膽堿酯酶；加入0.1M pH＝7..8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液20mL，稀釋酶溶液，得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH7＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液40mL，稀釋酶溶液A，得到酶溶液B；3)載體的溶解取10g載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于0-4℃冰箱內反應1小時以上，使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴(中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中；每瓶裝6.0g，抽真空密封，置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存；需要對機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測，按上述使用方法配試劑包，固體酶試劑直接使用，通過顏色變化，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
實施例51)液A的配制將25μL活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶放入燒杯中，加入0.1MpH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液18mL，稀釋酶溶液，得到酶溶液A；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液28mL，稀釋酶溶液A，得到酶溶液B；3)載體的溶解取8.0g載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱內反應1小時以上使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中，每瓶裝2.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存；需要對機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測，按上述使用方法配試劑包，固體酶試劑用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液溶解后使用，每30mg固體酶試劑的用4mL緩沖溶液溶解；通過酸度測量，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
權利要求
1.一種有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑，其特征在于，其組分及配比為膽堿酯酶活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶之一 5-50μL、緩沖溶液1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液 5-30mL、2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液20-50mL、載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 2-10g。
2.一種如權利要求1所述有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑，其特征在于，其組分及配比為膽堿酯酶活度為1000units/mL的乙酰膽堿酶或丁酰膽堿酯酶之一10-30μL、緩沖溶液1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液 8-20mL、2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液25-40mL、載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 5-8g。
3.一種如權利要求2所述有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑，其特征在于，其組分及配比為膽堿酯酶活度為1000units/mL的乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶之一 10μL、緩沖溶液1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液 8mL、2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液25mL、載體聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 5g。
4.一種如權利要求1-3之一所述有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑的制備方法，其步驟如下1)酶溶液A的配制將所需的活度為1000units/mL的膽堿酯酶放入燒杯中，用所需的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，得到酶溶液A；；2)酶溶液B的配制向上述已配置好的酶溶液A中加入所需的0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl緩沖溶液稀釋，得到酶溶液B；3)載體的溶解將所需的載體加入上述已配置好的酶溶液B中，攪拌，使載體溶解；置于0-4℃冰箱內反應1小時以上，使酶與載體結合；4)凍干將上述酶與載體結合物轉移至凍干瓶中，將凍干瓶置于-20℃以下低溫乙醇浴中輕輕轉動凍干，使溶質盡量薄且均勻地涂布于瓶壁上，待溶液蒸發(fā)干后，牢固地固定凍干瓶于凍干機上10小時；取下內壁載有凍干粉的凍干瓶，小心地刮下凍干粉放入小玻璃瓶中；每瓶裝6.0g，抽真空密封，置于4℃冰箱中冷藏或于冷凍下保存。
5.一種如權利要求1-3之一所述有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑的使用方法，其步驟如下1)配固體酶試劑每個裝有6.0g固體酶試劑的小玻璃瓶為一個試劑包；每次檢測用量為30mg；使用時，打開安碚瓶直接稱量使用或用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl或磷酸鹽緩沖溶液溶解后使用，每30mg固體酶試劑用4mL緩沖溶液溶解；于開口的安碚瓶中盛裝未用盡的固體酶試劑，應置于干燥器內，于室溫下20日內不失效；2)底物試劑將所需底物試劑用水稀釋；按每0.6g.底物稀釋至100mL刻度處稀釋，每個試劑包內裝10mL；底物為碘化硫代乙酰膽堿、溴化硫代乙酰膽堿、氯化硫代乙酰膽堿、碘化硫代丁酰膽堿、溴化硫代丁酰膽堿膽堿、氯化硫代丁酰膽堿、氯化乙酰膽堿、2，6-二氯靛酚乙酯、2，6-二溴靛酚乙酯、2，6-二氯靛酚丙酯或2，6-二溴靛酚丙酯之一；3)顯色劑試劑，僅酶催化動力學光度法測量時使用；按每0.8g顯色劑稀釋至100mL刻度處稀釋，每個試劑包內裝10mL；顯色劑為5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸(DTNB)；將上述3種試劑包各一個、0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸鹽緩沖溶液及0.1M pH＝7.8-8.2Tris-HCl緩沖溶液各500mL分別用1個塑料洗瓶盛裝、3-5個塑料滴瓶放入檢測箱中；每個檢測箱中的試劑可檢測待測樣品為0.2～1.0g或待測樣品汁0.1～0.5mL的樣品200組；使用檢測箱中的試劑，利用酶被抑制的程度，借助農藥殘毒速測儀通過酶催化動力學光度法測量、通過顏色變化或者通過酸度測量方法之一，進行有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留毒性的快速篩選檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑及其制備方法與使用方法。本發(fā)明有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測用固體酶試劑由膽堿酯酶、緩沖溶液、載體組成。本發(fā)明固體酶試劑可在室溫下(20～25℃)穩(wěn)定儲存20天以上，解決了酶在室溫(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下儲存易于失活、酶溶液于在－20℃下冷凍儲存由于多次溶凍所帶來的酶活顯著降低、固體酶試劑合力差、酶活損失較多導致直接影響農藥殘毒檢測的準確性的問題。本發(fā)明固體酶成本低，制備方法簡單，便于推廣應用，其配合使用底物試劑、顯色劑試劑及緩沖溶液試劑，可以滿足蔬菜、水果、環(huán)境水或糧食中農藥殘毒現(xiàn)場快速分析的需求并保證測試結果的準確性。
文檔編號C12Q1/00GK1731155SQ20051008626
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權日2005年8月19日
發(fā)明者鄒明強, 王大寧, 陳彥長, 張曉華, 李錦豐, 齊小花 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院