專利名稱：一種牡丹胚狀體誘導方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術，具體地說是涉及一種牡丹胚狀體誘導方法。
背景技術：
從20世紀50年代Steward和Reinert首次發(fā)現(xiàn)可以從胡蘿卜的體細胞離體培養(yǎng)物誘導產生體細胞胚(胚狀體)并形成再生植株以來，人們在大量植物的組織培養(yǎng)、單細胞懸浮培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細胞胚胎的發(fā)生或花粉胚胎的發(fā)生。據(jù)不完全統(tǒng)計，40多個科150種以上的植物都已能夠通過體細胞胚胎發(fā)生途徑從植物組織培養(yǎng)物誘導胚狀體發(fā)生(朱至清編著.植物細胞工程.2003，北京化學工業(yè)出版社)，其中包括被子植物幾乎所有重要的科和一些裸子植物。越來越多的研究表明，在植物離體培養(yǎng)中，通過體細胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株已是及其普遍的現(xiàn)象，并認為該發(fā)生途徑是植物體細胞在離體條件下的一個基本發(fā)育途徑(崔凱榮，戴若蘭主編.植物體細胞胚發(fā)生的分子生物學.2000，北京科學出版社)，即植物體細胞可能具有潛在的、象有性生殖過程產生合子胚一樣的全能性，這種全能性可以在適宜的培養(yǎng)條件下被誘導出來。在植物組織培養(yǎng)中，誘導體細胞胚胎發(fā)生和誘導器官分化相比具有顯著的特點①胚狀體在形態(tài)上具有兩極性，其發(fā)育過程與合子胚的相似，就象一顆種子。胚狀體一旦形成后，大多數(shù)可以生長為小植株，成苗率高，為此人們將發(fā)育一定時期的胚狀體制作成人工種子，以達到快速繁殖優(yōu)良種質的目的。②胚狀體與母體植株間存在生理隔離現(xiàn)象。它一開始便是一個植物體的雛形，在適宜條件下很容易長成一個獨立的植株。③胚狀體的遺傳性相對穩(wěn)定，不太容易發(fā)生變異，因此，由它形成的植株能夠保持優(yōu)良種質的遺傳性。④胚狀體具有重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性，是細胞全能性表達最完全的一種方式。為此深入研究體細胞胚胎發(fā)生與發(fā)育的機制對于揭示細胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生與合子胚發(fā)育等重大理論問題的機制以及真核細胞中基因表達和調節(jié)控制等具有十分重要的意義，也為植物品種改良、轉基因受體和突變體篩選等提供了良好的無性繁殖實驗體系。芍藥屬植物的胚胎發(fā)生是被子植物中獨一無二的，因為它的合子在最初的核分裂過程中不形成細胞壁，而形成一個游離核原胚，因此，有關它們胚胎的發(fā)生與發(fā)育問題始終是學者們研究的熱點。
牡丹是起源于我國的傳統(tǒng)名花，不僅在國內花卉市場中占有重要地位，同時也是我國重要的出口花卉，在國際市場享譽很高。但它的繁殖與育種都比較困難，目前主要的繁殖方法都為無性繁殖，生產采用分株和嫁接，一般一株商品種苗的生產至少需要3年時間，而且生產門路窄、質量差、產品規(guī)格不一致，不能滿足國內外市場需求；而有性繁殖——播種繁殖，由于繁殖系數(shù)大，生產上多用于選育優(yōu)良新品種與培育砧木，或培育藥用牡丹栽培，但牡丹種子上下胚軸都有休眠現(xiàn)象，自然狀態(tài)下僅種子萌發(fā)就要1～2年，且萌發(fā)率較低、變化大，很難獲得整齊一致的幼苗(Zilis MR et al.1976)。GA3處理雖能打破部分牡丹種子上下胚軸的休眠，使萌發(fā)時間稍有縮短(景新明等，1995)，但處理苗多數(shù)有些畸形發(fā)育，各品種還需尋找較適宜的使用濃度。我國雖然已有近千個牡丹品種，但絕大多數(shù)都是采用傳統(tǒng)的播種方式進行多年的實生苗選育而來，遠緣雜交育種在我國才剛剛起步。而牡丹遠緣雜交育種在國外已有一百多年的歷史，特別是歐美、日本等國在眾多園藝愛好者與育種家們的努力下也已選育出上千個品質優(yōu)良園藝新品種，可以說我國的牡丹育種水平已遠遠落后了。但無論是我國的播種實生選育，還是國外的遠緣雜交育種，二者的育種周期都很長，一個良好新品種的產生至少需要10年以上。因此，對牡丹而言，其繁殖與育種的周期都較長，急需要快速、可靠的方法來改善，特別是在我國育種水平落后的情況下，要趕超他人就必須采取新技術以輔助育種。在水稻、小麥、玉米、棉花、大豆、油菜等作物中該技術的成功利用也預示了牡丹胚狀體誘導及成苗技術的應用潛力，誘導率及成苗率越高、越普遍應用的市場潛力越大。
胚狀體發(fā)生雖然在多種植物中均已觀察到，但在觀賞植物中僅見有少數(shù)誘導成功的報道，如一品紅、水晶掌、長壽花、朱頂紅、麗格海棠、萱草、非洲紫羅蘭、風信子、水仙、唐菖蒲、蘇鐵、芍藥、金花茶、月季(李美茹等，2003)等，在木本花卉上誘導成功的更少。芍藥屬植物具有多核或多細胞花粉(胚)的現(xiàn)象說明其具有較明顯的胚狀體發(fā)生潛力，在芍藥中已報道從花藥、花粉及合子胚培養(yǎng)中獲得胚狀體(Zenkteler M et al.1975)，但胚狀體苗都不足以健壯至出瓶馴化(Brukhin V.B et al.1994)；而在黃牡丹與牡丹中獲得的少量花粉胚，僅由30多個細胞組成，且始終包被花藥外壁，沒完成器官分化，至今沒有從牡丹中獲得完整胚狀體及胚狀體苗的報道。

發(fā)明內容
(一)、要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一種從牡丹離體培養(yǎng)的幼胚中誘導出胚狀體，并順利培養(yǎng)成苗的可靠方法。
(二)、技術方案本發(fā)明為一種牡丹胚狀體誘導方法，包括將外植體清潔處理、消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，移至胚狀體分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-70天，幼胚胚軸上產生出胚狀體，胚狀體器官分化完成后迅速將其分割、接種到胚狀體接種培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，再移至胚狀體繼代培養(yǎng)基，將生根胚狀體苗4℃冷藏60-90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，待胚狀體苗的根葉具發(fā)育良好、生長健壯時煉苗、上盆移栽。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，還包括分割下來的第一代胚狀體或次生胚狀體接種后迅速放入4℃冰箱冷藏90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，還包括在胚狀體繼代培養(yǎng)基反復繼代2-3次至生根后，將生根幼苗4℃冷藏60-90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，還包括將胚狀體繼代培養(yǎng)基上生根、抽芽成苗的胚狀體苗在4℃冷藏至煉苗。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，所述的外植體是幼胚或成熟胚。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，所述的啟動培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.5mg/L+IAA 0-1.0mg/L+2，4-D 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L+CH 0-500mg/L。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，所述的胚狀體分化培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+GA30-0.5mg/L+Vc 0-100mg/L。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，胚狀體接種培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-0.5mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
本發(fā)明所述的牡丹胚狀體誘導方法，胚狀體繼代培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+IBA0-2.0mg/L+Vc0-100mg/L。
本發(fā)明所述的方法，所述的1/2MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基大量元素減半、Ca2+加倍。
本發(fā)明所述的方法，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16-20h/d，光強1600～2000Lx。
本發(fā)明中，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16-20h/d，光強1600～2000Lx。
外植體獲得從健壯植株上采得牡丹心皮拿回實驗室，流水沖洗24h，經徹底刷洗清潔后剝出胚珠，拿到超凈臺上消毒。胚珠先用70％乙醇處理3min，滅菌蒸餾水洗3次后，再用0.2％NaClo處理15-20min，滅菌蒸餾水洗3次后，剝去種皮、破開胚乳、用解剖針挑出種胚接種。
培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件1/2MS(Ca2+加倍)，0.5-0.6％瓊脂，附加不同濃度的蔗糖及生長調節(jié)劑(PGR，見表1，表2)，PH5.8。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16-20h/d，光強1600-2000Lx。
(三)、有益效果本發(fā)明是提供一個有效的牡丹幼胚離體培養(yǎng)誘導胚狀體并將之順利培養(yǎng)成苗的方法。本研究中牡丹幼胚離體培養(yǎng)胚狀體的誘導率為10.83％，成苗率為5.1％，在特定的培養(yǎng)基上胚狀體誘導率達到了20.0％，這在目前多數(shù)花卉胚狀體的誘導中是比較少見的，如月季的胚狀體誘導歷經了近20年，但其誘導率也僅3％～33％左右。胚狀體途徑不僅是牡丹微繁潛在的非常有效的方法，而且對深入研究牡丹細胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生與合子胚發(fā)育等重大理論問題具有十分重要的意義，也為牡丹種質的長期保存、品種改良、轉基因受體和突變體篩選等提供了良好的實驗體系。
本發(fā)明方法適用于多種牡丹的離體幼胚、成熟胚?？梢詾檠芯磕档さ呐咛グl(fā)生提供替代系統(tǒng)，并為研究揭示牡丹細胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、個體發(fā)育等重大理論問題的機制開拓一個新的領域。該技術的推廣應用還能大大提高牡丹的增殖系數(shù)，為牡丹種質的長期保存、品種改良、遺傳轉化、基因工程育種和突變體篩選等提供了良好有效的無性繁殖實驗體系，極有可能改進傳統(tǒng)的育種方式，縮短育種周期，在牡丹育種領域發(fā)揮巨大變革作用。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
培養(yǎng)基見表1和表2。
表1 培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑組合

表2 胚狀體接種及繼代培養(yǎng)基組合

*表1與表2中配方相同的培養(yǎng)基僅列1次。
實施例1 外植體的獲得從健壯植株上采得牡丹心皮拿回實驗室，流水沖洗24h，徹底刷洗清潔后剝出胚珠，拿到超凈臺上消毒。胚珠先用70％乙醇處理3min，滅菌蒸餾水洗3次后，再用0.2％NaClO處理15min，滅菌蒸餾水洗3次后，剝去種皮、破開胚乳，用解剖針挑出種胚接種。
實施例2(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-1上培養(yǎng)30天后，生根幼苗繼代(I)至J-2上，培養(yǎng)35天，待胚狀體完成器官分化，具有明顯的2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體接種至E-2上，培養(yǎng)30天后，再次繼代(I)至E-2上；
(3)35天后，將胚狀體苗繼代(II)至E’-1上；(4)將E’-1幼苗拿入冰箱4℃冷藏60天；(5)拿回培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)1個月后，少數(shù)胚狀體苗抽芽、生根成苗。
(7)挑出根葉良好的胚狀體苗開始煉苗。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16h/d，光強1600Lx。
實施例3(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-2上培養(yǎng)40天后，生根幼苗繼代(I)至J-1上，培養(yǎng)35天，待胚狀體完成器官分化，具有明顯的2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體接種至E-2上，培養(yǎng)35天后，再次繼代(I)至E-2上；(3)35天后，將胚狀體苗繼代(II)至E’-1上；(4)將E’-1幼苗拿入冰箱4℃冷藏90天；(5)拿回培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)1個月后，少數(shù)胚狀體苗抽芽、生根成苗。
(7)挑出根葉良好的胚狀體苗開始煉苗。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強2000Lx。
實施例4(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-3上培養(yǎng)35天后，生根幼苗繼代(I)至J-1上，培養(yǎng)15天，待胚狀體完成器官分化，具有明顯的2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體接種至E-4上，培養(yǎng)40天后，再次繼代(I)至E-4上；(3)30天后，將胚狀體苗繼代(II)至E’-4上；(4)35天后，將已生根、抽芽成苗的胚狀體苗繼代(III)至E’-2上；
(5)將E’-2幼苗放入4℃冰箱冷藏至煉苗；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16h/d，光強2000Lx。
實施例5(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-3上培養(yǎng)30天后，生根幼苗繼代(I)至J-1上，培養(yǎng)35天，待胚狀體完成器官分化，具有明顯的2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體接種至E-4上，培養(yǎng)35天后，繼代(I)至E-5上；(3)35天后，將胚狀體苗繼代(II)至Q-3上；(4)35天后，將胚狀體苗繼代(III)至E’-3上；(5)將生根苗放入4℃冰箱冷藏60天，至芽抽出后拿回培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)挑出根葉良好的胚狀體苗煉苗。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強1600Lx。
實施例6(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-6上培養(yǎng)40天后，幼苗分二份分別繼代(I)至J-3和J-4上，繼代周期35天，待胚狀體完成器官分化，具有明顯的2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體分別接種至E-3與E’-2上；(3)35天后，將胚狀體苗繼代(I)至E’-2上；以35天為周期在E’-2繼代3次，至幼苗生根；(4)將生根幼苗放入4℃冰箱冷藏90天，至抽芽后拿回培養(yǎng)室；(5)35天后將生根、抽芽的胚狀體苗拿出培養(yǎng)室煉苗。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強2000Lx。
實施例7(1)離體胚在啟動培養(yǎng)基Q-4與Q-5上培養(yǎng)30天后，繼代(I)至J-3上，培養(yǎng)35天后，再次繼代(II)至J-3上，培養(yǎng)70天，待胚狀體完成器官分化后分割；
(2)分割胚狀體接種至E-6上；(3)35天后，將胚狀體苗繼代(I)至E’-5上；(4)35天后，將胚狀體苗繼代(II)至E’-2上，反復繼代1次，至幼苗生根；(5)將生根幼苗繼代至E-4上，反復繼代1次至抽芽；(6)35天后將生根、抽芽苗拿出培養(yǎng)室煉苗。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強2000Lx。
實施例8(1)離體胚幼苗在啟動培養(yǎng)基Q-7上培養(yǎng)35天后，繼代(I)至J-1上，繼代時間70天，胚狀體完成器官分化，具有2片小子葉時分割；(2)將分割的胚狀體接種至E-1上，拿入冰箱4℃冷藏90天后拿回培養(yǎng)室；(3)培養(yǎng)35天后，再繼代(I)至E’-2上；(4)35天后將生根、抽芽苗拿出培養(yǎng)室煉苗。
(5)沒抽芽的胚狀體苗再繼代(I)至E’-2上，至生長抽芽后煉苗。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強2000Lx。
表3 胚狀體分化比率

胚狀體分割培養(yǎng)后的統(tǒng)計見表4。
表4 胚狀體培養(yǎng)成苗的綜合統(tǒng)計

權利要求
1.一種牡丹胚狀體誘導方法，其特征包括將外植體清潔處理、消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，移至胚狀體分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-70天，幼胚胚軸上產生出胚狀體，胚狀體器官分化完成后迅速將其分割、接種到胚狀體接種培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，再移至胚狀體繼代培養(yǎng)基，將生根胚狀體苗4℃冷藏60-90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，待胚狀體苗的根葉具發(fā)育良好、生長健壯時煉苗、上盆移栽。
2.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于還包括分割下來的第一代胚狀體或次生胚狀體接種后迅速放入4℃冰箱冷藏90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)。
3.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于還包括胚狀體在繼代培養(yǎng)基反復繼代2-3次至生根后，將生根幼苗4℃冷藏60-90天，再回培養(yǎng)室正常培養(yǎng)。
4.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于還包括將將繼代培養(yǎng)基上已生根、抽芽成苗胚狀體苗在4℃冷藏至煉苗。
5.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于所述的外植體是幼胚或成熟胚。
6.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于所述的啟動培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.5mg/L+IAA 0-1.0mg/L+2，4-D0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L+CH 0-500mg/L。
7.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于所述的胚狀體分化培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+GA30-0.5mg/L+Vc 0-100mg/L。
8.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于胚狀體接種培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-0.5mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
9.如權利要求1所述的牡丹胚狀體誘導方法，其特征在于胚狀體繼代培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-1.0mg/L+IAA 0-1.0mg/L+IBA0-2.0mg/L+Vc 0-100mg/L。
10.如權利要求6-9任一所述的方法，其特征在于所述的1/2MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基大量元素減半、Ca2+加倍。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16～20h/d，光強1600～2000Lx。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡丹胚狀體誘導方法將外植體清潔處理、消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30－40天，移至胚狀體分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15－70天，幼胚胚軸上產生出胚狀體。胚狀體器官分化完成后迅速將其分割、接種到胚狀體接種培養(yǎng)基培養(yǎng)30－40天，再移至胚狀體繼代培養(yǎng)基，將生根胚狀體苗4℃冷藏60－90天，再在培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，待根和葉發(fā)育良好、胚狀體苗健壯時煉苗、上盆并移栽。本發(fā)明提供了一種成功誘導牡丹體細胞胚發(fā)生并培育成苗的可靠方法，不僅為牡丹育種提供了一條新途徑，而且為研究牡丹的胚胎發(fā)生提供替代系統(tǒng)，為研究揭示牡丹細胞分化、形態(tài)發(fā)生以及個體發(fā)育等重大理論問題的機制開拓一個新的領域。
文檔編號C12N5/04GK1778169SQ20051008659
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權日2005年10月12日
發(fā)明者成仿云, 何貴梅 申請人:北京林業(yè)大學