專利名稱：一種利用可燃性氣體傳感器發(fā)酵培養(yǎng)食酸戴爾福特菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種利用可燃性氣體傳感器發(fā)酵培養(yǎng)食酸戴爾福特菌的方法。對于篩選出的1株能夠降解微囊藻毒素(Microcystins，簡稱MCs)的食酸戴爾福特菌Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)，通過可燃性氣體傳感器使發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度恒定控制在0.1～10.0g/L范圍內(nèi)的任何一個濃度的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，可以獲得高細胞濃度的食酸戴爾福特菌USTB02液。將發(fā)酵培養(yǎng)的菌液或提取的酶作為一種生物催化劑，可以用于MCs的高效去除。
食酸戴爾福特菌USTB02降解MCs的活性不需要采用MCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，生長于其它含碳、含氮有機物的食酸戴爾福特菌USTB02同樣可以保持降解MCs的能力，因此如何高效培養(yǎng)出食酸戴爾福特菌USTB02至關(guān)重要。
背景技術(shù)：
藍藻水華污染所帶來的主要危害是在有毒藍藻細胞破裂后向水體中釋放多種不同類型的藻毒素，其中MCs是一類在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類。研究結(jié)果顯示，MCs的主要靶器官是肝臟，能夠促發(fā)肝臟腫瘤的發(fā)生。
雖然微生物降解是去除MCs的一種非常有前途的方法，但MCs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵具有相當?shù)姆€(wěn)定性，一般的多肽分解酶不能對MCs進行分解，只有一些特殊的微生物菌種才具備對MCs的降解能力，這也是MCs在天然水體中能夠存在很長時間的一個重要原因。在純菌種降解去除MCs方面，國外學者發(fā)現(xiàn)從天然水體中分離出的銅綠假單胞菌和鞘氨醇單胞菌對MC-LR和RR這2種類型的MCs有降解能力，其中鞘氨醇單胞菌對MC-RR和LR的降解速率分別達到每天13.0和5.4mg/L，這是目前國外報道的最大的MCs生物降解速率。國內(nèi)學者閆海從云南滇池底泥中分離出了一株日平均降解MC-RR和MC-LR的速率達到16.7和9.4mg/L的微生物純菌種Ralstoniasolanacearum，并研究了此菌種對MC-RR和LR的降解途徑，發(fā)現(xiàn)至少有兩種酶參與了MC-RR和LR的催化降解過程。
更進一步研究顯示，我們從天然水體中篩選出的食酸戴爾福特菌USTB02對MCs具備更強的降解能力，它能在2天內(nèi)將初始濃度分別為90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分別達到45.1mg/L和19.8mg/L。進一步研究顯示食酸戴爾福特菌酶對MCs仍然具有催化降解能力，且降解速率更迅速，能在7小時內(nèi)分別將30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。食酸戴爾福特菌是目前發(fā)現(xiàn)的除鞘氨醇單胞菌屬、銅綠假單胞菌屬和Ralstonia solanacearum菌外能夠降解MCs的又一新菌種，國內(nèi)外均未見有此菌種降解MCs的文獻報道。因此如何高效培養(yǎng)出超高細胞濃度的食酸戴爾福特菌USTB02在解決水體中MCs的去除問題方面具有非常重要的意義和價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用可燃性氣體傳感器發(fā)酵培養(yǎng)食酸戴爾福特菌USTB02的方法，培養(yǎng)出超高細胞濃度食酸戴爾福特菌USTB02作為一種能夠高效去除MCs的生物催化劑。
本發(fā)明在成功篩選出1株能夠高效降解MCs的微生物純菌種食酸戴爾福特菌USTB02 Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日)的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中應(yīng)用乙醇作為食酸戴爾福特菌USTB02生長的唯一碳源，并且采用可燃性氣體傳感器對發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的乙醇濃度進行恒定控制，能夠培養(yǎng)出超高細胞濃度的食酸戴爾福特菌USTB02。
1、微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成如下(1000mL去離子水中)MgSO4·7H2O 0.05～0.5g，KH2PO40.25～0.5g，K2HPO42.0～5.0g，NaCl 0.5～2.5g，CaCl2 5.0～10.0mg，F(xiàn)eSO40.5～2.5mg，ZnCl20.5～2.5mg，MnCl2·4H2O 0.5～2.5mg，CuCl20.05～0.25mg，酵母粉5.0～20.0g為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另外在發(fā)酵罐中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)120～130℃高溫和0.10～0.15MPa高壓蒸汽滅菌15～20分鐘。接種食酸戴爾福特菌USTB02后，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過可燃性氣體傳感器自動流加乙醇并保持培養(yǎng)基中的乙醇濃度在0.1～20.0g/L范圍。
2、食酸戴爾福特菌USTB02發(fā)酵培養(yǎng)接種1～50mL食酸戴爾福特菌USTB02液于5升發(fā)酵罐內(nèi)的0.5～2L微生物液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度25～35℃，培養(yǎng)基中溶解氧40％～80％飽和溶解氧，通過流加NaOH溶液保持培養(yǎng)基的pH在6.0～8.0范圍。在乙醇作為微生物唯一碳源時，利用可燃性氣體傳感器全自動流加乙醇并始終保持乙醇在培養(yǎng)基中的濃度為0.1～20.0g/L。
3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的控制方法因為乙醇是揮發(fā)性化合物，在發(fā)酵培養(yǎng)通氣過程中，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度的減少將引起傳感器氣敏元件的電阻增加，從而導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端的輸出電壓減小，當輸出電壓減小到設(shè)定值1.40～1.70V時，繼電器通過控制電源插座開關(guān)打開蠕動泵向發(fā)酵罐內(nèi)流加乙醇。隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度也增加，這又使傳感器氣敏元件的電阻減少，又導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端輸出電壓的增大，當輸出電壓增大到設(shè)定值1.40～1.70V時，繼電器自動關(guān)閉流加乙醇的蠕動泵。采用此控制方法可成功地保持發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的恒定控制在0.1～20.0g/L范圍內(nèi)的任何一個濃度。
本發(fā)明的優(yōu)點在于盡管乙醇是支持食酸戴爾福特菌USTB02生長的最好碳源之一，但是由于乙醇既易溶于水也易溶于有機溶劑，如果培養(yǎng)基中的乙醇濃度超過1.0％(體積/體積)將導(dǎo)致食酸戴爾福特菌USTB02的生長速度下降。因此用可燃性氣體傳感器通過繼電器開關(guān)控制蠕動泵，自動流加乙醇作為食酸戴爾福特菌USTB02生長的唯一碳源，并始終保持在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的乙醇在0.1～20.0g/L之間的任何一個恒定濃度非常重要。采用此種控制方法，不僅可以保證食酸戴爾福特菌USTB02生長的碳源供給，而且可以對培養(yǎng)基中的乙醇濃度進行在線監(jiān)測與控制。
在培養(yǎng)基中控制乙醇濃度恒定的原理是在一定濃度范圍內(nèi)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的乙醇濃度與從發(fā)酵罐中流出空氣中乙醇濃度之間存在線性關(guān)系。發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度的減少將引起傳感器氣敏元件的電阻增加，這樣就使與氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端的輸出電壓減少，當串聯(lián)電阻輸出電壓減小到某一設(shè)定值時，繼電器通過控制插座開關(guān)打開蠕動泵向發(fā)酵罐內(nèi)流加乙醇。隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度也增加，這又使傳感器氣敏元件的電阻減少，又導(dǎo)致與氣敏元件串聯(lián)電阻輸出電壓的增大，當輸出電壓增大到同一設(shè)定值時，繼電器自動關(guān)閉流加乙醇的蠕動泵。采用這樣的方法可成功地保持發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的恒定?？扇夹詺怏w傳感器經(jīng)調(diào)試后可準確控制培養(yǎng)基中的乙醇恒定保持在0.1～20.0g/L范圍內(nèi)任何一個濃度。采用上述方法進行流加乙醇的控制，可以保持食酸戴爾福特菌USTB02的快速生長，并最終獲得非常高的細胞濃度。


圖1為可燃性氣體傳感器一微生物發(fā)酵罐控制系統(tǒng)示意圖。主要由發(fā)酵罐、可燃性氣體傳感器、繼電器和流加泵所組成。
圖2為本發(fā)明傳感器接線圖，顯示繼電器氣敏元件電阻跟輸出電壓的關(guān)系。傳感器外加電壓DC9V，串接電阻51歐。當傳感器氣敏元件電阻增大時，與之串接電阻兩端的輸出電壓隨之減?。环粗?，當傳感器氣敏元件電阻減小時，則串接電阻兩端的輸出電壓隨之增大。
具體實施例方式
1、食酸戴爾福特菌USTB02培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成如下(1000mL去離子水中)MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO40.5g，K2HPO45.0g，NaCl 1.5g，CaCl210.0mg，F(xiàn)eSO42.5mg，ZnCl22.5mg，MnCl2·4H2O 2.5mg，CuCl20.1mg，酵母粉10.0g為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在5升微生物發(fā)酵培養(yǎng)罐中配制2.0L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)125℃高溫和0.12MPa高壓蒸汽滅菌20分鐘后，開始通空氣冷卻，空氣流量為2.0升/分鐘，待培養(yǎng)基溫度冷卻至30℃后，接種20mL的食酸戴爾福特菌USTB02液開始進行發(fā)酵培養(yǎng)，開始攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)1天以后逐漸增大到500轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)條件是溫度30℃，培養(yǎng)基中溶解氧大于50％飽和溶解氧，pH 7.0。
2、食酸戴爾福特菌USTB02的發(fā)酵培養(yǎng)接種20mL食酸戴爾福特菌USTB02液于5升發(fā)酵罐內(nèi)的1L微生物液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度30℃，培養(yǎng)基中溶解氧60％飽和溶解氧，通過流加NaOH溶液保持培養(yǎng)基的pH在7.0范圍。在乙醇作為微生物唯一碳源時，利用可燃性氣體傳感器輸出電壓設(shè)定值為1.45V全自動流加乙醇并始終保持乙醇在培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L。培養(yǎng)3天后，食酸戴爾福特菌USTB02的光密度(OD680nm)可以從1.0左右增加到150.0，對應(yīng)細胞干重濃度為30.0g/L以上。
3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的控制方法在發(fā)酵培養(yǎng)通氣過程中，與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端的輸出電壓設(shè)定為1.45V。因為乙醇是揮發(fā)性化合物，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度的減少將引起傳感器氣敏元件電阻的增加，從而導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端的輸出電壓減小，當輸出電壓減小到設(shè)定值時，繼電器通過控制電源插座開關(guān)打開蠕動泵向發(fā)酵罐內(nèi)流加乙醇。隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度也增加，這又使傳感器氣敏元件的電阻減少，從而導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端輸出電壓的增大，當輸出電壓增大到設(shè)定值1.45V時，繼電器自動關(guān)閉流加乙醇的蠕動泵。采用此控制方法可成功地保持發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度恒定控制在1.0g/L。
權(quán)利要求
1.一種利用可燃性氣體傳感器發(fā)酵培養(yǎng)食酸戴爾福特菌的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)的具體工藝為a.微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成1000mL去離子水中，MgSO4·7H2O 0.05～0.5g，KH2PO40.25～0.5g，K2HPO42.0～5.0g，NaCl 0.5～2.5g，CaCl25.0～10.0mg，F(xiàn)eSO40.5～2.5mg，ZnCl20.5～2.5mg，MnCl2·4H2O 0.5～2.5mg，CuCl20.05～0.25mg，酵母粉5.0～20.0g為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另外在發(fā)酵罐中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)120～130℃高溫和0.10～0.15MPa高壓蒸汽滅菌15～20分鐘；接種食酸戴爾福特菌USTB02后，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過可燃性氣體傳感器自動流加乙醇并保持培養(yǎng)基中的乙醇濃度在0.1～20.0g/L范圍；b.食酸戴爾福特菌USTB02發(fā)酵培養(yǎng)接種1～50mL食酸戴爾福特菌USTB02液于5升發(fā)酵罐內(nèi)的0.5～2L微生物液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)條件溫度25～35℃，培養(yǎng)基中溶解氧40％～80％飽和溶解氧，通過流加NaOH溶液保持培養(yǎng)基的pH在6.0～8.0范圍；在乙醇作為食酸戴爾福特菌USTB02生長的唯一碳源時，利用可燃性氣體傳感器全自動流加乙醇并始終保持乙醇在培養(yǎng)基中的濃度為0.1～20.0g/L；c.發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的控制因為乙醇是揮發(fā)性化合物，在發(fā)酵培養(yǎng)通氣過程中，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度的減少將引起傳感器氣敏元件的電阻增加，從而導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端的輸出電壓減小，當輸出電壓減小到設(shè)定值1.40～1.70V時，繼電器通過控制電源插座開關(guān)打開蠕動泵向發(fā)酵罐內(nèi)流加乙醇；隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，發(fā)酵罐流出氣體中乙醇濃度也增加，這又使傳感器氣敏元件的電阻減少，又導(dǎo)致與傳感器氣敏元件串聯(lián)的電阻兩端輸出電壓的增大，當輸出電壓增大到設(shè)定值1.40～1.70V時，繼電器自動關(guān)閉流加乙醇的蠕動泵；采用此控制方法成功地保持發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度恒定控制在0.1～20.0g/L范圍內(nèi)的任何一個濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用可燃性氣體傳感器發(fā)酵培養(yǎng)食酸戴爾福特菌的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。對于篩選出的1株能夠降解微囊藻毒素的食酸戴爾福特菌Delftia acidovorans USTB02，CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日，通過與氣敏元件串聯(lián)電阻輸出電壓的設(shè)定進行開關(guān)控制，使發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度恒定控制在0.1～20.0g/L范圍內(nèi)的任何一個濃度的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，可以獲得高效降解MCs活性超高細胞濃度的食酸戴爾福特菌USTB02液。本發(fā)明的優(yōu)點在于將發(fā)酵的菌液或提取的酶作為一種生物催化劑，用于微囊藻毒素的高效去除。
文檔編號C12N1/38GK1782069SQ200510086720
公開日2006年6月7日 申請日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者徐中文, 張金燕, 孫建新, 閆海, 周潔, 何宏勝 申請人:廣東綠百多生物科技有限公司, 北京科技大學