專利名稱：人高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以人高密度脂蛋白受體(CLA-1)為靶點(diǎn)的CLA-1活性調(diào)節(jié)劑體外高通量篩選模型，本發(fā)明還涉及一種利用所述篩選模型篩選人高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑的方法，以及利用所述模型篩選獲得的人高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑，尤其是人高密度脂蛋白受體激動(dòng)劑和人高密度脂蛋白受體拮抗劑。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病是危害人類健康的常見疾病之一。雖然許多資料表明血漿中高密度脂蛋白(HDL)水平的升高對(duì)降低膽固醇是有利的，但到目前為止仍沒有選擇性的針對(duì)HDL的治療方法。
高密度脂蛋白受體確認(rèn)較晚，1996年，Krieger等(Acton，S.Rigotti，A.Landschulz，KT.Xu，S.Hobbs，HH.Krieger，M.(1996).Identification of scavenger receptor SR-B I as a high densitylipoprotein receptor.Science 271(5248)518-520)發(fā)現(xiàn)B類I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I，SR-B I)是當(dāng)時(shí)已闡明一級(jí)結(jié)構(gòu)的脂蛋白受體中唯一能真正介導(dǎo)細(xì)胞與高密度脂蛋白作用的膜受體，因此SR-B I又稱為HDL-R。人的SR-B I也已經(jīng)被克隆出來(lái)，取名為CLA-1(CD36 and LIMPII analogous-1)。
HDL受體的確立，引起了人們的極大的興趣。Trigatti B，RayburnH，Vinals M，等人，Proc Nat Acad Sci USA.1999，96(16)9322-9327，和Braun A，Trigatti BL，Post MJ等人，CircRes.2002，90(3)244-245使用apoE單一缺陷和apoE與SR-B I雙缺陷小鼠研究SR-B I對(duì)血漿膽固醇和AS的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在給予正常飲食的情況下與apoE單一缺陷小鼠相比，apoE與SR-B I雙缺陷小鼠血漿總膽固醇明顯升高，膽汁排除明顯減少；喂養(yǎng)9周后apoE和SR-B I雙缺陷小鼠全部死亡。解剖結(jié)果顯示，apoE和SR-B I雙缺陷小鼠主動(dòng)脈竇和冠狀動(dòng)脈壁損傷明顯，而apoE單一缺陷小鼠未觀察到損傷。
把載有編碼SR-B I基因的腺病毒整合到純合子LDL-R缺陷小鼠，使之誘導(dǎo)SR-B I過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SR-B I過量表達(dá)能減少粥樣硬化斑塊面積，預(yù)防AS的形成(Ueda Y，Royer L，Gong E，等人，J Biol Chem.1999，274(11)7165-7171)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)SR-B I能參與快速清除氧化性LDL-CE(Low density lipoprotein cholesterol ester)，并繼發(fā)性引起LDL中氧化脂質(zhì)減少，從而也可防止AS的形成(AndersenJM，Dietschy JM.，J Biol Chem.1981，256(14)7362-7370)。
由于其抗AS的作用，SR-B I被認(rèn)為是治療心血管疾病的新的分子靶標(biāo)。通過升高SR-B I的表達(dá)或提高SR-B I的活性來(lái)降低血漿膽固醇成為預(yù)防和治療AS極有前途的方向。因此，一方面可以利用基因治療手段在肝臟或動(dòng)脈壁過量表達(dá)SR-B I，以減輕AS損傷；另一方面，可在體外構(gòu)建高通量篩選模型，尋找SR-B I的活性調(diào)節(jié)劑(包括激動(dòng)劑或拮抗劑)或SR-B I基因表達(dá)的上調(diào)劑或下調(diào)劑，將有可能獲得可以調(diào)節(jié)HDL受體通路的活性化合物，為預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)AS的新型的先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明人我們用桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，在昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞膜上成功表達(dá)了人HDL受體CLA-1，首次成功建立CLA-1激動(dòng)劑的體外高通量篩選模型。利用該模型篩選了4000多個(gè)樣品，成功獲得了具有陽(yáng)性活性的候選化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種以高密度脂蛋白受體CLA-1為靶點(diǎn)的CLA-1活性調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型，其包括1)經(jīng)重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染可在其細(xì)胞膜上表達(dá)CLA-1的重組昆蟲細(xì)胞Sf9；以及2)CLA-1熒光配基DiI-HDL，即1，1’-雙十八烷基-3，3，3，3’，3’-四甲基吲哚碳翁花青高氯酸鹽(1，1’-dioctadecyl-3-3-3’-3’-tetramethyllindocarbocyanine perchlorate)人高密度脂蛋白(以下縮寫為DiI-HDL)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的篩選模型中的重組昆蟲細(xì)胞Sf9是通過如下方法制備的在96孔板中每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5×104個(gè)于不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基，貼壁后按MOI為5的量接種重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1，感染后培養(yǎng)36-96小時(shí)，優(yōu)選為感染后72小時(shí)；其中所述CLA-1配基DiI-HDL的濃度為0.25-2μg/ml，優(yōu)選為1μg/ml。
在本發(fā)明中，所述高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑包括高密度脂蛋白受體激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的又一方面涉及一種利用所述篩選模型篩選以高密度脂蛋白受體CLA-1為靶點(diǎn)的CLA-1活性調(diào)節(jié)劑方法，包括1)在96孔板中每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5×104個(gè)于不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基，貼壁后按MOI為5的量接種重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1，感染后培養(yǎng)36-96小時(shí)，優(yōu)選為感染后培養(yǎng)72小時(shí)，得到對(duì)照組細(xì)胞；2)用不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基洗滌步驟1)中所獲得的表達(dá)CLA-1的對(duì)照組重組昆蟲細(xì)胞Sf9；3)向步驟2)中所獲得的重組昆蟲細(xì)胞Sf9中加入濃度為0.25-5μg/ml熒光CLA-1配基DiI-HDL50μl，隨后加入待測(cè)化合物或經(jīng)適當(dāng)稀釋的微生物發(fā)酵產(chǎn)物至50μl體系中，化合物終濃度為10μg/ml；4)將步驟3)所得混合物于27℃孵育4小時(shí)，吸棄上清，用pH7.2的PBS100μl洗滌2次后，加入100μl細(xì)胞裂解液，裂解20分鐘后，溶液轉(zhuǎn)移至黑色熒光板中，在激發(fā)光540nm/發(fā)射光590nm下，讀取樣品組熒光讀數(shù)。
5)所述樣品組熒光讀數(shù)與同樣經(jīng)上述步驟1)-4)處理的用Bacmid病毒感染昆蟲細(xì)胞的空白組(Mock group)熒光讀數(shù)相比，所得樣品組熒光讀數(shù)高于空白組的熒光讀數(shù)20％以上的樣品為激動(dòng)劑，低于空白組的熒光讀數(shù)20％以上的樣品為拮抗劑。
本發(fā)明的又一方面涉及所述篩選模型用于篩選高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑的用途。
本發(fā)明再一方面還涉及利用本發(fā)明所述的方法篩選得到的高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑，包括高密度脂蛋白受體的激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明所述篩選模型利用DiI-HDL為配基，以在昆蟲細(xì)胞Sf9的細(xì)胞膜上成功表達(dá)的CLA-1為靶點(diǎn)，建立了CLA-1的活性調(diào)節(jié)劑篩選模型，其特點(diǎn)在于與現(xiàn)有的體外配基受體結(jié)合模型相比較，作為篩選靶點(diǎn)人高密度脂蛋白受體在昆蟲細(xì)胞膜上表達(dá)，因此，受體與待測(cè)化合物的相互作用接近在人體細(xì)胞中的真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)避免了使用哺乳動(dòng)物表達(dá)所述受體的種種不便，更適合于高通量篩選。


圖1為表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-CLA-1的構(gòu)建示意圖。
圖2為重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1的構(gòu)建示意圖。
圖3為Bacmid轉(zhuǎn)座區(qū)。
圖4為10×10的倒置顯微鏡下，Bacmid和Bacmid-CLA-1成功轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞72小時(shí)后與正常昆蟲細(xì)胞相比，昆蟲細(xì)胞病變圖。其中A.Sf9；B.AcNPV感染的Sf9；C.用空白Bacmid病毒轉(zhuǎn)染的Sf9；D.用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的Sf9。
圖5顯示經(jīng)重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞Sf9表達(dá)CLA-1的量與表達(dá)時(shí)間的關(guān)系之Western印跡分析結(jié)果。其中1.野生Bacmid病毒感染4天的昆蟲細(xì)胞Sf9；2-6.重組Bacmid-CLA-1病毒分別感染1、2、3、4和5天的昆蟲細(xì)胞Sf9。
圖6顯示不同DiI-AcLDL濃度對(duì)重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞Sf9結(jié)合熒光配基DiI-Ac-LDL的熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖7顯示不同DiI-HDL濃度對(duì)重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞Sf9結(jié)合熒光配基DiI-HDL的熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖8顯示重組病毒表達(dá)時(shí)間對(duì)重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞結(jié)合熒光配基DiI-Ac-LDL的熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖9顯示熒光配基DiI-Ac-LDL與重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞Sf9的孵育時(shí)間對(duì)的熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖10顯示重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)時(shí)間對(duì)熒光配基DiI-HDL結(jié)合重組昆蟲細(xì)胞Sf9的熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖11顯示熒光配基DiI-HDL與經(jīng)重組桿狀病毒感染的重組昆蟲細(xì)胞的孵育時(shí)間對(duì)熒光讀數(shù)的影響，其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組。
圖12顯示樣品H20對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的拮抗作用。其中圖12A顯示不同濃度下的樣品H20在對(duì)照組、空白組和樣品組的熒光讀數(shù)，圖12B顯示不同濃度的樣品H20的熒光讀數(shù)變化。其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，樣品組是指將樣品加入對(duì)照組中后的組。
圖13顯示樣品L34對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用。其中圖13A顯示不同濃度下的樣品L34在對(duì)照組、空白組和樣品組的熒光讀數(shù)，圖13B顯示不同濃度的樣品L34的熒光讀數(shù)變化。其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，樣品組是指將樣品加入對(duì)照組中后的組。
圖14樣品4776微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用。其中圖14A顯示不同稀釋度下的樣品4776在對(duì)照組、空白組和樣品組的熒光讀數(shù)，圖14B顯示不同稀釋度的樣品4776的熒光讀數(shù)變化。其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，樣品組是指將樣品加入對(duì)照組中后的組。
圖15顯示樣品6727微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用。其中圖15A顯示不同稀釋度下的樣品6727在對(duì)照組、空白組和樣品組的熒光讀數(shù)，圖15B顯示不同稀釋度的樣品6727的熒光讀數(shù)變化。其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，樣品組是指將樣品加入對(duì)照組中后的組。
圖16顯示樣品6792微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用。其中圖16A顯示不同稀釋度下的樣品6792在對(duì)照組、空白組和樣品組的熒光讀數(shù)，圖16B顯示不同稀釋度的樣品6792的熒光讀數(shù)變化。其中空白組是指用Bacmid轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，對(duì)照組是指用Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組成的組，樣品組是指將樣品加入對(duì)照組中后的組。
實(shí)施例實(shí)施例1重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1的制備以及CLA-1中昆蟲細(xì)胞Sf9中的成功表達(dá)1.CLA-1 cDNA的獲得1)總RNA的提取使用Promega的SV總RNA試劑盒，從人肝癌BEL-7402細(xì)胞(約1×106個(gè)細(xì)胞)提取總RNA。提取方法依試劑盒推薦步驟進(jìn)行。總RNA溶于100μl不含核酸酶的水中，-70℃保存。
2)RT-PCR擴(kuò)增編碼目的蛋白的基因以步驟1)中所得總RNA為模板、Oligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)人的CLA-1 cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼人CLA-1片段的引物。在5’和3’引物末端引入BglII酶切位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基。引物序列如下P15’端引物5’-AAAGATCTAGACATGGGCTGCTCCGC-3’P23’端引物5’-CCAGATCTGACCCTACAGTTTTGCTTCC-3’以上述逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃，5min；94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，1min 40sec(3個(gè)循環(huán))；94℃ 30sec，62℃，30sec，72℃，2min(30個(gè)循環(huán))；72℃ 5min。瓊脂糖回收PCR產(chǎn)物，其3’端加dATP，與克隆載體pGEM-T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。提取的質(zhì)粒經(jīng)BglII酶切鑒定后進(jìn)行DNA序列分析，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T-CLA-1。
DNA片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等均按文獻(xiàn)Sambrook JFritsch EF，Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Mannul)第二版，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989進(jìn)行。
結(jié)果獲得1.5Kb的CLA-1 cDNA片段，回收RT-PCR產(chǎn)物，與pGEM-T連接后，經(jīng)序列測(cè)定表明，該基因序列與Calvo，D.Vega，M.A.等人(Identification，primary structure，and distribution of CLA-1，a novel member of the CD36/LIMPII gene family，J.Biol.Chem.1993，268(25)，18929-18935)的報(bào)道一致。
2.轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac1-CLA-1的構(gòu)建及鑒定用BglII從重組質(zhì)粒pGEM-T-CLA-1上切下CLA-1 cDNA片段，經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化后，與用BamHI酶切的pFastBac1以3∶1進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。質(zhì)粒pFastBac1-CLA-1構(gòu)建策略見圖1。
選取重組子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析。CLA-1酶切圖譜分析表明，其在1050bp有個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，在重組載體pFastBac1多克隆位點(diǎn)也存在一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，如果CLA-1正向插入多角體啟動(dòng)子的下游，用EcoRI酶切應(yīng)產(chǎn)生500bp片段，反向插入應(yīng)產(chǎn)生1000bp的片段。將所得質(zhì)粒命名為pFastBac1-CLA-1。
3.重組Bacmid-CLA-1病毒的獲得用上述步驟1中獲得的重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFasBac1-CLA-1轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在助手質(zhì)粒(helper)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶作用下，攜帶轉(zhuǎn)座子的CLA-1基因片段轉(zhuǎn)座到穿梭質(zhì)粒(baculovirus shuttle vector)Bacmid的mini-attTn7位置，并導(dǎo)致LacZ基因插入失活。因此，在Bluo-gal和IPTG存在下，插入CLA-1的大腸桿菌菌落為白色，而未插入CLA-1的菌落為藍(lán)色。挑選白色菌落，重新涂含Blue-gal和IPTG平板，保證仍為白色。挑選白色菌落，搖瓶培養(yǎng)，提取Bacmid-CLA-1(參見圖2和圖3)。所得重組桿狀病毒直接轉(zhuǎn)染培養(yǎng)成單層的Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)，便可得到重組桿狀病毒(參見圖4)。
4.重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1感染昆蟲細(xì)胞Sf9成功表達(dá)CLA-1利用如上述構(gòu)建的第二代重組Bacmid-CLA-1病毒感染昆蟲細(xì)胞，分別在1、2、3、4和5天收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果見圖5。在70kD和85kD分別出現(xiàn)了2條帶，而且在重組病毒感染的第4天，表達(dá)量較大。
具體的，分別用Bacmid病毒、重組的Bacmid-CLA-1病毒感染單層昆蟲細(xì)胞Sf9，培養(yǎng)72小時(shí)，棄上清，細(xì)胞用pH7.2的PBS洗2次，加入昆蟲細(xì)胞裂解液(62.5mM Tris-Cl，pH 6.8，2％SDS，0.1μg/mlAprotin，100μg/ml PMSF)100μl裂解細(xì)胞，加入2×加樣緩沖液，水浴煮沸5分鐘，離心上樣經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5％脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)；用兔抗人的SR-B I/II多克隆抗體(1/5000)孵育1小時(shí)，用1×TBS洗膜3次，每次5分鐘；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的IgG(1/30000)孵育1小時(shí)，用1×TBS洗膜3次，每次5分鐘，加發(fā)光劑凝膠成像儀拍照。
上述結(jié)果表明，經(jīng)過本發(fā)明所述重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1感染的昆蟲細(xì)胞Sf9能夠成功表達(dá)CLA-1。
實(shí)施例2經(jīng)重組病毒Bacmid-CLA-1感染表達(dá)CLA-1的重組昆蟲細(xì)胞Sf9結(jié)合熒光配基的分析1.熒光配基結(jié)合基本分析方法如下述96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9，每孔細(xì)胞量在5×104，按MOI為5的量接種第二代重組病毒(對(duì)照組)，感染空載體的Sf9作為空白組(Mock group)。感染3天后，顯微鏡下觀察Sf9剛出現(xiàn)病變，吸棄培養(yǎng)基，用不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基(1L含Grace’s Medium(Gibco產(chǎn)品)46.3g)洗細(xì)胞，然后分別加入50μl DiI-AcLDL和DiI-HDL(用不含F(xiàn)BS但含有0.2％BSA的Grace培養(yǎng)基溶解)進(jìn)行試驗(yàn)。27℃孵育一定時(shí)間后，吸棄上清，用pH7.2的PBS洗板3次，加入100μl細(xì)胞裂解液，裂解20分鐘后，溶液轉(zhuǎn)移至黑色96孔熒光板中，應(yīng)用BMG Polarstar Galaxy多功能分析測(cè)試儀，在激發(fā)光540nm/發(fā)射光590nm下，讀取熒光讀數(shù)。
1)重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞結(jié)合DiI-AcLDL分析結(jié)果DiI-AcLDL濃度對(duì)熒光讀數(shù)的影響(參見圖6)。從圖6可以看出，對(duì)照組(感染重組Bacmid-CLA-1病毒的組)和空白組(感染Bacmid病毒組)所測(cè)熒光值隨著DiI-AcLDL的濃度的升高而升高。DiI-AcLDL濃度為0.5μg/ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比p＜0.05，而當(dāng)DiI-AcLDL濃度分別為1.0μg/ml、1.5μg/ml 2.0μg/ml、2.5μg/ml和3.0μg/ml時(shí)，對(duì)照組和空白組相比p＜0.01。
2)重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞結(jié)合DiI-HDL分析結(jié)果DiI-HDL濃度對(duì)熒光讀數(shù)的影響(參見圖7)。從圖7可以看出，隨著DiI-HDL濃度的升高，對(duì)照組與空白組的熒光值都升高，在不同濃度下兩組的熒光值p＜0.01，但對(duì)照組與空白組熒光數(shù)據(jù)中DiI-HDL濃度為0.5μg/ml時(shí)最大，所以建立模型時(shí)選擇DiI-HDL濃度為0.5μg/ml作為篩選時(shí)的濃度。
實(shí)施例3重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)CLA-1的時(shí)間與所述CLA-1結(jié)合熒光配基的熒光讀數(shù)的關(guān)系以DiI-AcLDL為熒光配基構(gòu)建的篩選模型中，重組病毒感染昆蟲細(xì)胞的時(shí)間與CLA-1表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖8。由圖8可以看出，對(duì)照組和空白組相比在重組病毒感染72小時(shí)后，其結(jié)合DiI-AcLDL達(dá)到最高峰。而且兩組之間熒光讀數(shù)p＜0.01。感染96小時(shí)，CLA-1表達(dá)量最高，但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)變得越來(lái)越差，有的不再貼壁，在第120小時(shí)，有的細(xì)胞出現(xiàn)裂解，此時(shí)昆蟲細(xì)胞結(jié)合熒光配基的能力很差，所以在模型的建立時(shí)選擇了感染三天作為篩選條件。
以DiI-HDL為熒光配基構(gòu)建的篩選模型中，重組病毒感染昆蟲細(xì)胞的時(shí)間與CLA-1表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖10。由圖10可以看出，在感染72小時(shí)后，對(duì)照組與空白組的熒光讀數(shù)以及兩組熒光讀數(shù)的比值都達(dá)到最高值，在不同濃度下兩組的熒光讀數(shù)p＜0.01。所以我們?cè)谀Ｐ偷慕r(shí)也選擇了感染72小時(shí)作為篩選條件。
實(shí)施例4熒光配基與重組昆蟲細(xì)胞的孵育時(shí)間對(duì)熒光讀數(shù)的影響以DiI-AcLDL為熒光配基構(gòu)建的篩選模型中，我們選擇DiI-AcLDL濃度為1.5μg/ml，其他條件不變，但孵育時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12小時(shí)，結(jié)果見圖9A和9B。孵育2、4小時(shí)，對(duì)照組和空白組相比p＞0.05，兩組之間無(wú)明顯差異。孵育6、8、10、12小時(shí)，對(duì)照組和空白組相比p＜0.01，兩組之間有明顯差異。孵育12小時(shí)后熒光讀數(shù)增加不明顯。
以DiI-HDL為熒光配基構(gòu)建的篩選模型中，我們選擇DiI-HDL的濃度為0.5μg/ml，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組與對(duì)照組所測(cè)熒光讀數(shù)均升高，但孵育6小時(shí)和10小時(shí)，熒光讀數(shù)的升高不再明顯(參見圖11)。而且對(duì)照組與空白組熒光讀數(shù)的比值在孵育6小時(shí)時(shí)達(dá)到了最高值。在不同的孵育時(shí)間，對(duì)照組和空白組熒光讀數(shù)的差別p＜0.01。所以在模型的應(yīng)用時(shí)選擇孵育6小時(shí)為篩選條件。
實(shí)施例5應(yīng)用本發(fā)明所述篩選模型對(duì)不同來(lái)源的候選化合物和微生物發(fā)酵產(chǎn)物的樣品的篩選結(jié)果利用上述構(gòu)建的篩選模型，以DiI-HDL為熒光配基，分別對(duì)4000個(gè)不同樣品進(jìn)行篩選研究，其中包括3600個(gè)微生物發(fā)酵提取物，400個(gè)純化合物。為了節(jié)約的用量，每5個(gè)樣品混合來(lái)進(jìn)行初篩，純化合物的初篩濃度為4μg/ml，發(fā)酵液提取物是500倍稀釋，經(jīng)過初篩篩選出部分活性成分，陽(yáng)性率2％。
經(jīng)復(fù)篩后確定了顯示陽(yáng)性活性樣品樣品H20及L34是喹諾酮類的純化合物，樣品4776、6727和6792是微生物的發(fā)酵提取物。其中樣品H20在篩選模型中能夠使熒光讀數(shù)降低20％以上，初步認(rèn)定為受體拮抗劑。樣品L34和微生物4776，6727及6792的發(fā)酵提取物使熒光讀數(shù)升高20％以上，初步認(rèn)定為受體激動(dòng)劑。
分別對(duì)樣品H20，L34，4776，6727和6792的不同濃度對(duì)熒光配基與昆蟲細(xì)胞表達(dá)的高密度脂蛋白受體結(jié)合活性的影響進(jìn)行了研究，觀察濃度與熒光讀數(shù)的關(guān)系，結(jié)果如下1.樣品H20對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的拮抗作用(參見圖12)由圖12可以看出，樣品H20可以使受體與熒光配基的結(jié)合降低，而且隨著濃度的升高，其降低熒光值的作用增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，熒光讀數(shù)由起始的4000下降到1500左右，降低幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于20％，可以初步認(rèn)定所述樣品具有受體拮抗劑的作用。
2.樣品L34對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用(參見圖13)由圖13可以看出，樣品L34可以使受體與熒光配基的結(jié)合升高，而且隨著濃度的升高，其升高熒光值的作用增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，熒光讀數(shù)由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于20％，可以初步認(rèn)定所述樣品具有受體激動(dòng)劑的作用。
3.樣品4776微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用(參見圖14)由圖14可以看出，樣品4776微生物發(fā)酵提取物可以使受體與熒光配基的結(jié)合升高，而且隨著稀釋倍數(shù)的降低(即濃度的升高)，其升高熒光值的作用增強(qiáng)。當(dāng)樣品的稀釋倍數(shù)由稀釋10000倍降低到僅稀釋200倍時(shí)，熒光讀數(shù)由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于20％，可以初步認(rèn)定所述樣品具有受體激動(dòng)劑的作用。
4.樣品6727微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用(參見圖15)由圖15可以看出，樣品6727微生物發(fā)酵提取物可以使受體與熒光配基的結(jié)合升高，而且隨著稀釋倍數(shù)的降低(即濃度的升高)，其升高熒光值的作用增強(qiáng)。當(dāng)樣品的稀釋倍數(shù)由稀釋10000倍降低到僅稀釋200倍時(shí)，熒光讀數(shù)由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于20％，可以初步認(rèn)定所述樣品具有受體激動(dòng)劑的作用。
5.樣品6792微生物發(fā)酵提取物對(duì)熒光配基與人高密度脂蛋白受體CLA-1結(jié)合的激動(dòng)作用(參見圖16)由圖16可以看出，樣品6792微生物發(fā)酵提取物是使受體與熒光配基的結(jié)合率升高，而且隨著稀釋倍數(shù)的降低(即濃度的升高)，其升高熒光值的作用增強(qiáng)。當(dāng)樣品的稀釋倍數(shù)由稀釋10000倍降低到僅稀釋200倍時(shí)，熒光讀數(shù)由起始的4000左右升高到16000左右，升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于20％，可以初步認(rèn)定所述樣品具有受體激動(dòng)劑的作用。
發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述篩選模型利用DiI-HDL為配基，以在昆蟲細(xì)胞Sf9的細(xì)胞膜上成功表達(dá)的CLA-1為靶點(diǎn)，建立了CLA-1的活性調(diào)節(jié)劑篩選模型，其特點(diǎn)在于與現(xiàn)有的體外配基受體結(jié)合模型相比較，作為篩選靶點(diǎn)人高密度脂蛋白受體在昆蟲細(xì)胞膜上表達(dá)，因此，受體與待測(cè)化合物的相互作用接近在人體細(xì)胞中的真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)避免了使用哺乳動(dòng)物表達(dá)所述受體的種種不便，更適合于高通量篩選。
權(quán)利要求
1.一種以高密度脂蛋白受體CLA-1為靶點(diǎn)的CLA-1活性調(diào)節(jié)劑高通量篩選模型，其包括1)經(jīng)重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1轉(zhuǎn)染可在其細(xì)胞膜上表達(dá)CLA-1的重組昆蟲細(xì)胞Sf9；以及2)CLA-1熒光配基DiI-HDL。
2.權(quán)利要求1所述的篩選模型，其中1)所述重組昆蟲細(xì)胞Sf9是通過如下方法制備的在96孔板中每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5×104個(gè)于不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基，貼壁后按MOI為5的量接種重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1，感染后培養(yǎng)36-96小時(shí)，優(yōu)選為感染后72小時(shí)；2)所述CLA-1熒光配基DiI-HDL的濃度為0.25-2μg/ml，優(yōu)選為1μg/ml。
3.權(quán)利要求1所述的篩選模型，其中所述高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑包括高密度脂蛋白受體的拮抗劑和激動(dòng)劑。
4.一種利用權(quán)利要求1所述篩選模型篩選以高密度脂蛋白受體CLA-1為靶點(diǎn)的CLA-1活性調(diào)節(jié)劑方法，包括1)在96孔板中每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5×104個(gè)于不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基，貼壁后按MOI為5的量接種重組桿狀病毒Bacmid-CLA-1，感染后培養(yǎng)36-96小時(shí)，優(yōu)選為感染后72小時(shí)，得到對(duì)照組細(xì)胞；2)用不含F(xiàn)BS、抗生素的Grace培養(yǎng)基洗滌步驟1)中所獲得的表達(dá)CLA-1的對(duì)照組重組昆蟲細(xì)胞Sf9；3)向步驟2)中所獲得的重組昆蟲細(xì)胞Sf9中加入濃度為0.25-5μg/ml熒光CLA-1配基DiI-HDL50μl，隨后加入待測(cè)化合物或經(jīng)適當(dāng)稀釋的微生物發(fā)酵產(chǎn)物至50μl體系中，化合物終濃度為10μg/ml；4)將步驟3)所得混合物于27℃孵育4小時(shí)，吸棄上清，用pH7.2的PBS100μl洗滌2次后，加入100μl細(xì)胞裂解液，裂解20分鐘后，溶液轉(zhuǎn)移至黑色熒光板中，在激發(fā)光540nm/發(fā)射光590nm下，讀取樣品組熒光讀數(shù)；5)所述樣品組熒光讀數(shù)與同樣經(jīng)上述步驟1)-4)處理的用Bacmid病毒感染昆蟲細(xì)胞的空白組熒光讀數(shù)相比，所得熒光讀數(shù)高于空白組的熒光讀數(shù)20％以上的樣品為激動(dòng)劑，低于空白組的熒光讀數(shù)20％以上的樣品為拮抗劑。
5.權(quán)利要求1所述篩選模型用于篩選高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑的用途。
6.利用權(quán)利要求4所述的方法篩選的高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以人高密度脂蛋白受體(CLA－1)為靶點(diǎn)的CLA－1活性調(diào)節(jié)劑體外高通量篩選模型，本發(fā)明還涉及一種利用所述篩選模型篩選人高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑的方法，以及利用所述模型篩選獲得的人高密度脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)劑，尤其是人高密度脂蛋白受體激動(dòng)劑和人高密度脂蛋白受體拮抗劑。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1916182SQ20051009076
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月16日
發(fā)明者司書毅, 洪斌, 田德峰, 張忠兵, 王娟, 張?jiān)虑? 解云英, 姜威, 王麗非, 巫曄翔 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所