專利名稱：農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于處理農(nóng)牧業(yè)與食品加工廢棄物的發(fā)酵菌劑及其制造領(lǐng)域，尤其是屬于能加快物料發(fā)酵的菌劑和該菌劑的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國的畜禽規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)在近十幾年里得到迅速發(fā)展，尤其是集約化養(yǎng)殖程度很高的養(yǎng)豬業(yè)得到了長足的發(fā)展，但在提高生產(chǎn)水平的同時也造成了較嚴(yán)重的環(huán)境污染。此外，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中每年產(chǎn)生大量的農(nóng)作物秸稈等，以及農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物(如果皮、葉、渣、和食用菌渣等)，更加劇了農(nóng)村環(huán)境污染。這些畜禽糞便及農(nóng)業(yè)廢棄物既是污染源，又是很好的有機(jī)肥料資源，經(jīng)微生物好氧高溫發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)減量化(物料含水量、體積、重量減少)、無害化(消除有害物質(zhì)、殺滅寄生蟲、卵、病原微生物、草籽等)處理和資源化(有機(jī)肥料、營養(yǎng)基質(zhì)等)利用，是緩解農(nóng)業(yè)污染和可持續(xù)發(fā)展農(nóng)牧業(yè)的有效途徑之一。當(dāng)前農(nóng)村大部分有機(jī)廢棄物未經(jīng)處理就直接排放、堆棄或施入農(nóng)田，有少部分則采用傳統(tǒng)堆制自然發(fā)酵的辦法。但自然堆肥的發(fā)酵微生物菌群起始數(shù)量少、增殖慢，且往往不耐高溫，故堆肥發(fā)酵升溫緩慢，發(fā)酵周期長，通常需要2個月以上。由于發(fā)酵堆溫不高，發(fā)酵不充分，有害生物殺滅不徹底。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對以上的不足，從自然界定向分離選育出具有耐高溫，活力強(qiáng)、生長快等特性的微生物菌株；通過培養(yǎng)增殖后，制成并提供發(fā)酵用菌劑產(chǎn)品及其制備方法；同時也提供應(yīng)用該菌劑加速農(nóng)牧業(yè)與食品加工有機(jī)廢棄物發(fā)酵腐熟的技術(shù)。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。
使用的微生物本發(fā)明所述的菌劑是由以下三種菌種經(jīng)培養(yǎng)、增殖、配制而成。所用菌株是扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)ZJY2，灰藤黃鏈霉菌(Streptomyces griseoluteus)W1及蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ME1-2。于1997年從杭州、溫州及北京、沈陽、南京等不同地區(qū)采集牛糞、豬糞、雞糞和垃圾等高溫堆肥及土壤樣品，利用不同類菌種常規(guī)培養(yǎng)基從中定向分離出酵母菌、放線菌和芽孢桿菌共71株，并進(jìn)行菌株純化，進(jìn)而對菌株通過44℃斜面和50℃搖瓶進(jìn)行耐高溫培養(yǎng)和測定，從中篩選出耐高溫菌株如下扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2(以下簡稱為ZJY2菌株)，該菌株于1997年3月，用上述方法從浙江杭州分離而得。經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所依據(jù)下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對照《YEASTSCharacteridtics and Identification》的檢索表分析，確定該酵母菌為復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)中的扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。其主要不同點(diǎn)在于該菌株生長速度快，易培養(yǎng)，不易污染，培養(yǎng)基配制簡單，耐一定程度的高溫(40℃烘干不死亡)。該新菌株于2003年3月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNO.0909。
灰藤黃鏈霉菌W1(以下簡稱為W1菌株)，該菌株于1997年3月，用上述方法從浙江溫州分離而得。經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所，按《放線菌的分類和鑒定》，《鏈霉菌鑒定手冊》，《放線菌研究與應(yīng)用》，結(jié)合下述形態(tài)特征，細(xì)胞壁化學(xué)組分和培養(yǎng)特征及各項(xiàng)生理生化特征，W1菌株與灰藤黃鏈霉菌十分相似，故W1菌株定名為灰藤黃鏈霉菌(Streptomyces griseoluteus)。其主要不同點(diǎn)在于該菌株生長速度快，生長量大，耐高溫(50℃，5小時不死，溫度適宜時快速生長)，易培養(yǎng)。該新菌株于2004年1月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO.1086。
蠟狀芽孢桿菌ME1-2，該菌于1989年5月用上述方法從浙江紹興分離而得，經(jīng)浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定，根據(jù)碳源利用，酶反應(yīng)等特征，按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和R.E.Gordon等分類法，確定該菌株屬于芽孢桿菌屬的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，為已知菌種。報(bào)道文獻(xiàn)發(fā)表在《土壤肥料》1993年第2期，29～32頁，“多效菌菌種選育、鑒定及菌劑的研制”，作者何福恒、章錦秋、薛智勇等，《浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》1993年第5卷第2期，89～93頁，“多效菌及其制劑的主要特性”，作者何福恒、章錦秋、薛智勇等。公眾可以從該微生物菌種的持有人(專利發(fā)明人)處獲得該微生物菌種。
ZJY2菌株，W1菌株及ME1-2具有下述性質(zhì)1.ZJY2菌株菌落特征、細(xì)胞形態(tài)及理化性質(zhì)在麥芽汁和YEPD培養(yǎng)基平皿上，28℃恒溫靜止培養(yǎng)2～4天觀察，菌落表面呈暗-灰白色，中央凸起，表面粗糙。在麥芽汁液體培養(yǎng)基上，28℃振蕩培養(yǎng)24小時鏡檢觀察繁殖方式為雙邊或多邊芽殖。細(xì)胞卵形、橢圓形及臘長形，個別細(xì)胞為錐形。細(xì)胞大小為(2.0-2.5)×(3.3-12.5)μm。接種YEPD、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3天后產(chǎn)生子囊孢子，子囊球形-卵形。每個子囊含1～4個子囊孢子。該菌能弱發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不能發(fā)酵半乳糖、乳糖、棉籽糖、海藻糖等單糖及雙糖。能同化葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉籽糖、纖維二糖、糊精、可溶性淀粉、乙醇、蘚糖醇、甘油、硝酸鈉、琥珀酸、水楊苷等。不能同化乳糖、密二糖、菊糖、木糖、D-阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、甲醇、N-乙酰葡萄糖胺、衛(wèi)矛醇等。另外在含有10％NaCl和5％葡萄糖的培養(yǎng)基中也能正常生長。一般在37℃生長。經(jīng)耐高溫性測定，在45℃培養(yǎng)生長較好。
2.W1菌株菌落特征、細(xì)胞形態(tài)及理化性質(zhì)在高氏合成一號和蔗糖察氏瓊脂上28℃插片培養(yǎng)7～10天，鏡檢觀察顯示，菌株的基內(nèi)菌絲體無橫隔，不斷裂；氣生菌絲體生長豐茂，多分枝；孢子絲直形，有的有柔曲成叢狀；孢子多于10個。孢子卵圓形或短柱狀，表面光滑。
W1 菌株在7種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

經(jīng)細(xì)胞壁化學(xué)組分分析，菌株全細(xì)胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；無特征性糖(糖型C)。細(xì)胞壁化學(xué)組分屬于I型。能發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖，不發(fā)酵棉子糖、木糖、肌醇，液化明膠，能使牛奶胨化，但不凝固牛奶，淀粉水解陽性，能還原硝酸鹽，纖維素上不生長，不產(chǎn)生H2S和類黑色素。經(jīng)耐高溫性測定，在50℃高溫中生長良好，菌絲球干重達(dá)2.17g/60ml。
3.蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌落特征、細(xì)胞形態(tài)及理化性質(zhì)菌落特征為近圓形、平展，邊緣似鑲邊狀，不透明，蠟質(zhì)狀；細(xì)胞形態(tài)為革蘭氏陽性，直桿狀，細(xì)胞大小為(1.2～1.5)×(2.0～3.5)μm。幼齡菌石炭酸復(fù)紅染色，細(xì)胞具有不著色的小球。芽孢為橢圓形，孢囊不膨大，運(yùn)動周身鞭毛。能發(fā)酵葡萄糖、木糖、海藻糖、麥芽糖，不能發(fā)酵阿拉伯糖、甘露醇、乳糖，能在7％氯化鈉培養(yǎng)液中生長，能還原硝酸鹽，具有氨化作用，能利用檸檬酸鹽，吲哚試驗(yàn)、VP反應(yīng)為陰性，脲酶、接觸酶、卵磷脂酶測定為陽性，不利用丙二酸鹽，能水解淀粉，在PH5.7的營養(yǎng)肉湯上生長，水解纖維素不明顯，能厭氧生長，酪氨酸水解為陰性反應(yīng)。經(jīng)耐高溫性測定，在45℃培養(yǎng)生長較好。
菌株培養(yǎng)與發(fā)酵扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2以麥芽汁培養(yǎng)基為基礎(chǔ)加入少量無機(jī)鹽如鈣、鎂、磷等進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵，25～35℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120～220rpm。以此為菌種接種固體發(fā)酵曲盤制作固體母種，固曲原料為麩皮、菜餅和豆餅粉(比例100％～40％∶0～30％∶0～30％)及少量無機(jī)鹽等，含水量為50～65％，25-35℃培養(yǎng)16-26小時，再按0.5～5％的接種量接種于滅菌的麩皮、菜餅、米糠和豆餅粉(比例100％～10％∶0～30％∶0～30％∶0～30％)及少量無機(jī)鹽混合發(fā)酵固體培養(yǎng)基中，含水量為40～65％，拌勻堆放30min后經(jīng)0.01MPa滅菌60min，16-26小時通氣曲盤發(fā)酵或曲池或用固體發(fā)酵罐培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)，溫度控制在20～38℃，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)1億cfu/克以上即可，40～50℃干燥，粉碎。
灰藤黃鏈霉菌W1以可溶性淀粉2～6％、酵母粉0.1～1.0％、豆餅粉5～30％等為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入少量無機(jī)鹽如鈣、鎂、磷等進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵，pH調(diào)整為5～9，轉(zhuǎn)速120～220rpm，20～40℃培養(yǎng)36～48小時。以此為母種按1～10％的接種量接種于滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為麩皮、豆餅粉、礱糠(比例25～70％∶50～20％∶25～10％)及少量無機(jī)鹽如鈣、鎂、磷、鉀等，培養(yǎng)基含水量為50～65％，溫度控制在35～37℃，通氣培養(yǎng)48～72小時，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)0.5億/克以上即可，40～50℃干燥，粉碎。
蠟狀芽孢桿菌ME1-2先用牛肉膏蛋白胨斜面菌種接種搖瓶制作液體種子，液體搖瓶培養(yǎng)基以牛肉膏蛋白胨為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入少量無機(jī)鹽如鈣、鎂、磷、鉀等制備而成，調(diào)整pH 7.0～7.8，轉(zhuǎn)速120～220rpm，28℃～35℃培養(yǎng)8至16小時。以此為母種按5～10％的接種量接種于液體發(fā)酵罐培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)，液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基為玉米粉0.1～0.6％、酵母粉0.1～0.5％、豆餅粉0.1～0.6％，葡萄糖或蔗糖0.1～0.3％及少量無機(jī)鹽組成，余量為水，溫度控制在25～35℃，通氣培養(yǎng)18-30小時，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)1億cfu/克以上即可，用麩皮按1∶1(v/w)吸附，混勻，40～45℃干燥，粉碎。
菌劑的制備上述三種菌經(jīng)分別培養(yǎng)發(fā)酵粉碎后即為單種菌劑，將三種或任二種按10～1∶0～3∶0～6的重量份數(shù)比例進(jìn)行復(fù)合即為復(fù)合菌劑，根據(jù)不同菌劑組合對豬糞堆肥發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果可看出，將ZJY2，W1和蠟狀芽孢桿菌ME1-2三種菌劑按4∶3∶3的重量份數(shù)比例進(jìn)行復(fù)合，該優(yōu)選比例復(fù)合的菌劑對豬糞堆肥發(fā)酵溫度和脫水效果最好(見圖1)。上述復(fù)合菌劑或單種菌劑的菌數(shù)均應(yīng)控制在0.5億cfu/克以上，含水率應(yīng)控制在8～14％之間。包裝固體粉劑可用防潮編織袋或塑料袋，液體菌劑可用密封容器或袋裝。
本發(fā)明菌劑經(jīng)試驗(yàn)，在室溫下貯存6個月，菌數(shù)為12.17×108cfu/g，存活率高達(dá)84.11％；貯存9個月的菌數(shù)為9.53×108cfu/g，存活率65.86％；貯存1年后的菌數(shù)仍達(dá)2.27×108cfu/g，存活率為18.65％。
本發(fā)明菌劑經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院省實(shí)驗(yàn)動物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室依據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價程序》檢驗(yàn)，菌劑對ICR小鼠經(jīng)口飼喂最大耐受量大于40.0g/kg，實(shí)驗(yàn)期間，小鼠無毒性反應(yīng)及死亡，且體重增加，屬實(shí)際無毒。ME1-2菌劑對實(shí)驗(yàn)動物NIH小鼠(雌、雄分組)采用“寇氏法”經(jīng)口灌胃急性毒性實(shí)驗(yàn)，雌、雄小鼠LD50＞20g/kg，屬基本無毒。故本發(fā)明菌劑有可能用做食品或飼料添加劑。
對小鼠經(jīng)口給藥最大耐受量的實(shí)驗(yàn)記錄

菌劑在堆肥發(fā)酵中的應(yīng)用根據(jù)我國，尤其是南方地區(qū)豬的規(guī)模養(yǎng)殖場最多，飼養(yǎng)量最大，而豬糞含水率高(70～90％)，粘糊，透氣性差，C/N比低，自然發(fā)酵難的特點(diǎn)，本發(fā)明菌劑以鮮豬糞發(fā)酵試驗(yàn)為主，提出了具體應(yīng)用方法。
(1)通過添加調(diào)理劑，如木屑，礱糠，中藥渣，香菇渣等，把豬糞的含水率從70～90％降調(diào)至55～65％，添加量一般為畜禽糞便等廢棄物總量的5～30％左右，優(yōu)選添加量為10～15％；(2)菌劑接種量以發(fā)酵物料(即廢棄物添加調(diào)理劑后的混合物)重的1‰～5‰為宜，優(yōu)選為2‰；菌種添加后翻拌均勻，堆肥高度一般以80～100公分為宜，利于好氧發(fā)酵與水分蒸發(fā)；(3)定期翻堆，通氣；1～3天左右翻堆一次，既增氧通氣，促進(jìn)堆肥發(fā)酵，尤其是在前期可明顯提高堆肥溫度上升；又加速堆肥水分蒸發(fā)，達(dá)到減量化；并周期性地使堆肥中心溫度下降，使外圍淺層的正常菌種隨著物料進(jìn)入內(nèi)層，加快新一輪好氧高溫發(fā)酵，從而加快整個堆肥的發(fā)酵腐熟進(jìn)程。
(4)堆肥發(fā)酵腐熟標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量檢測堆肥在55～60℃以上連續(xù)發(fā)酵15～20天時，用發(fā)酵產(chǎn)物與清水按1∶10浸泡1天，觀察浸提液呈咖啡色，同時堆溫開始下降，則表明生物發(fā)酵物料已進(jìn)入腐熟階段，再延續(xù)發(fā)酵3～5天后，經(jīng)曬干或烘干粉碎，含水量控制在20％以下，即成有機(jī)肥產(chǎn)品。要求該產(chǎn)品中大腸桿菌數(shù)＜105個/kg，蛔蟲卵數(shù)死亡率＞95％，達(dá)到無害化要求(畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)GB18596-2001)，產(chǎn)品質(zhì)量符合國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY525-2002)。
除豬糞外的其余畜禽糞便及農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物，應(yīng)根據(jù)其含水量高低，通氣性好壞，對上述辦法作適當(dāng)調(diào)整，如發(fā)酵物料含水率低于60％，則不需要添加調(diào)理劑等，均能取得較好的發(fā)酵腐熟效果。
本發(fā)明的有益效果一、本發(fā)明菌劑應(yīng)用于畜禽糞便及農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物堆肥處理后，前期表現(xiàn)發(fā)酵升溫快，起始5天即能達(dá)到55～65℃以上，堆肥10天溫度已接近峰值70℃，15天內(nèi)比不接菌的堆肥提高5～11℃；中后期能保持較高的發(fā)酵溫度，平均溫度較對照(自然發(fā)酵)高8～10℃，從而加快了整個發(fā)酵腐熟進(jìn)程，發(fā)酵腐熟期由對照的2個月以上縮短為20天至30天，大大提高了加工場地設(shè)備的利用率，降低了生產(chǎn)成本。發(fā)酵堆物料升溫、發(fā)酵腐熟過程受氣候因素的影響，夏季周期更短，冬季延長。二、由于發(fā)酵增溫快，維持溫度高，一般10天左右即能使堆肥中的大腸桿菌數(shù)及蛔蟲卵數(shù)等達(dá)到無害化要求，雜草種子死亡。三、堆制物料發(fā)酵溫度高，也加快了發(fā)酵物料水分的蒸發(fā)。一般發(fā)酵20～30天內(nèi)，即可使物料起始含水率下降30％左右，達(dá)到減量化要求，同時也取得了較好的除臭效果。四、菌劑發(fā)酵有機(jī)肥使用安全效果良好。本發(fā)明采用黃瓜種子的發(fā)芽指數(shù)試驗(yàn)顯示，豬糞堆肥發(fā)酵至20～30天，其發(fā)芽指數(shù)(GI％)值均在70％以上，表明對植物已經(jīng)安全；施肥后經(jīng)對土壤養(yǎng)分釋放測定，表現(xiàn)較為平穩(wěn)，保肥性好，并能活化根際土壤和提高土壤肥力，土壤中細(xì)菌、放線菌、芽孢桿菌、真菌等均大量增加，改善了土壤環(huán)境和團(tuán)粒結(jié)構(gòu)；經(jīng)作物應(yīng)用試驗(yàn)明確，該有機(jī)肥對蔬菜、瓜類、甘蔗、柑桔、草莓等均有提高產(chǎn)量，增加維生素C、糖分等含量，降低瓜果蔬菜可食部分的硝酸鹽含量，利于人體健康。五、有較好的經(jīng)濟(jì)及社會效益，經(jīng)測算，該發(fā)酵有機(jī)肥生產(chǎn)與銷售成本約250元/噸，市場價可達(dá)350元/噸左右。因此，本發(fā)明既能變廢為寶，適用于規(guī)?；笄菽翀黾S便及農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的發(fā)酵處理，并能形成發(fā)酵菌劑及商品有機(jī)肥的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，提高農(nóng)業(yè)效益。


圖1不同菌種組合對豬糞堆肥發(fā)酵溫度和含水率的影響示意2接種菌劑對堆肥溫度和發(fā)芽指數(shù)的影響示意3菌劑不同接種量對豬糞堆肥發(fā)酵溫度和脫水效果影響示意圖具體實(shí)施方式
通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
一、粉劑制造例1、扣囊復(fù)膜孢酵母菌株ZJY2菌劑的制備扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2液體搖瓶培養(yǎng)基麥芽汁(10°Bx)1000ml，葡萄糖18克，pH自然。以此為培養(yǎng)基加入20克瓊脂即制備成固體母種斜面進(jìn)行接種培養(yǎng)，按無菌操作方法取斜面母種一環(huán)接種于酵母液體搖瓶(裝60ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶)培養(yǎng)基中，28℃，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)18小時，菌數(shù)達(dá)0.5×108cfu/ml以上即可?？勰覐?fù)膜孢酵母固體發(fā)酵曲盤培養(yǎng)基以麩皮99％及少量無機(jī)鹽MgSO4、NaCl各0.05％，按料、水比1∶1(w/w)加水使物料含水量約為60％。以搖瓶培養(yǎng)的液體菌劑為菌種，按0.1％的接種量均勻接種于固體發(fā)酵料曲中(曲盤為木制，長寬高分別為60cm、45cm、6cm，固體培養(yǎng)基厚度3～5cm)，25℃培養(yǎng)，20小時，菌數(shù)達(dá)到2×108cfu/g即可，40～50℃干燥，粉碎制作固體母種。若采用規(guī)?；P發(fā)酵或曲池或固體發(fā)酵罐生產(chǎn)，其培養(yǎng)基同固體發(fā)酵曲盤培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按料水比拌勻堆放30min后，先經(jīng)0.1MPa滅菌60min，按3％的接種量接種于曲盤固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度控制在26℃，26小時曲盤通氣發(fā)酵或曲池或用固體發(fā)酵罐培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)1億cfu/克以上即可，40～50℃干燥，粉碎過40目篩，含水量約14％即為該菌粉劑產(chǎn)品。
2、灰藤黃鏈霉菌W1菌劑的制備
灰藤黃鏈霉菌W1液體搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉2.5％、酵母粉0.3％、豆餅粉5％為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入NaCl 2％、KH2PO40.05％、CaCO30.4％，pH調(diào)整為7.2。先以此為培養(yǎng)基加入2％瓊脂即制備成固體母種斜面進(jìn)行接種培養(yǎng)，按無菌操作方法取斜面母種用無菌水制取灰藤黃鏈霉菌菌懸液1ml接種于酵母液體搖瓶(裝100ml培養(yǎng)基/500ml三角瓶)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速160rpm，20～40℃培養(yǎng)48小時，菌劑發(fā)酵生物量(干重)達(dá)0.5g/100ml即可?；姨冱S鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基各原料重量百分比為麩皮68.06％、豆餅粉20％、礱糠10％及NaCl 1.5％、KH2PO40.04％、CaCO30.4％，另外再添加水，使培養(yǎng)基含水量為55％，以液體搖瓶培養(yǎng)菌劑為母種按1％的接種量接種于滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度控制在32℃，通氣培養(yǎng)72小時，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)0.5億/克以上即可，灰藤黃鏈霉菌規(guī)?；腆w發(fā)酵方法同前，50℃干燥，粉碎過40目篩，含水量約14％即為該菌粉劑產(chǎn)品。
3、蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌劑的制備蠟狀芽孢桿菌ME1-2液體搖瓶培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，調(diào)整pH 7.2。按無菌操作方法先用牛肉膏蛋白胨斜面菌種一環(huán)接種于液體搖瓶(裝60ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶)培養(yǎng)基中，28℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)16小時，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)1億cfu/克以上即可作為液體種子。液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基玉米粉1％、酵母粉1％、豆餅粉1％、糊精1％、MgSO4·7H2O 0.07％、KH2PO40.1％、CaCO30.5％、菜油0.3％，滅菌前pH調(diào)整至7.4～7.4，121℃滅菌2小時。以液體搖瓶培養(yǎng)菌劑為母種按5％的接種量接種于6噸液體發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度控制在28～30℃，通氣培養(yǎng)26小時，工廠化生產(chǎn)，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)10億cfu/克以上即可，用麩皮按1∶1(v/w)吸附，50℃干燥，粉碎過40目篩，含水量約14％即為該菌粉劑產(chǎn)品。
4、復(fù)合菌劑的制備
上述三種菌劑按4∶3∶3(w/w/w)比例均勻混合，菌劑數(shù)量達(dá)0.5億/克以上，包裝即為三菌種復(fù)合菌劑。
采用上述制備扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2菌劑與蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌劑或灰藤黃鏈霉菌W1菌劑，兩種菌劑按7∶3(w/w)比例均勻混合，菌劑數(shù)量達(dá)0.5億/克以上，即成二菌種復(fù)合菌劑，包裝即可。
二、液劑制造例1、扣囊復(fù)膜孢酵母菌株ZJY2菌劑的制備扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2液體培養(yǎng)基麥芽汁(10°Bx)1000ml，葡萄糖18克，pH自然。先以此為培養(yǎng)基加入2％瓊脂即制備成固體母種斜面進(jìn)行接種培養(yǎng)，按無菌操作方法取斜面母種一環(huán)接種于酵母液體搖瓶(裝60ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶)培養(yǎng)基中，28℃，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)18小時，菌數(shù)達(dá)0.5×108cfu/ml以上，按無菌操作密封包裝即為該菌液劑產(chǎn)品。
2、灰藤黃鏈霉菌W1菌劑的制備灰藤黃鏈霉菌W1液體培養(yǎng)基可溶性淀粉2.5％、酵母粉0.3％、豆餅粉5％為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入NaCl 2％、KH2PO40.05％、CaCO30.4％，pH調(diào)整為7.2。先以此為培養(yǎng)基加入2％瓊脂即制備成固體母種斜面進(jìn)行接種培養(yǎng)，按無菌操作方法取斜面母種用無菌水制取灰藤黃鏈霉菌菌懸液1ml接種于酵母液體搖瓶(裝100ml培養(yǎng)基/500ml三角瓶)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速160rpm，20～40℃培養(yǎng)48小時，菌劑發(fā)酵生物量(干重)達(dá)0.5g/100ml，按無菌操作密封包裝即為該菌液劑產(chǎn)品。
3、蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌劑的制備按蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌劑粉劑方法生產(chǎn)，在發(fā)酵菌數(shù)達(dá)10億cfu/ml以上，不用麩皮吸附，直接按無菌操作密封包裝即為該菌液劑產(chǎn)品。
4、復(fù)合菌劑的制備上述三種菌劑按4∶3∶3(V/V/V)比例按無菌操作方法均勻混合，菌劑數(shù)量達(dá)0.5億/ml以上，密封包裝即為三菌種復(fù)合菌劑液劑產(chǎn)品。
采用上述制備扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY2菌劑與蠟狀芽孢桿菌ME1-2菌劑或灰藤黃鏈霉菌W1菌劑，兩種菌劑按7∶3(w/w)比例用無菌操作方法均勻混合，菌劑數(shù)量達(dá)10億cfu/ml以上，密封包裝即成二菌種復(fù)合菌劑液劑產(chǎn)品。
三、實(shí)驗(yàn)例本發(fā)明菌劑與日本酵素菌、北京“有機(jī)廢物發(fā)酵菌曲”、不接種對照，以鮮豬糞為原料加15％的礱糠及適量菌劑進(jìn)行堆肥發(fā)酵對比試驗(yàn)，結(jié)果見下表，試驗(yàn)地點(diǎn)在浙江蕭山市，時間2003年6月，酵素菌購于浙江綠寶酵素生物工程公司，“有機(jī)廢物發(fā)酵菌曲”購于北京市京圃園生物工程有限公司。

四、應(yīng)用例1、畜禽廢棄物處理鮮豬糞(含水率約70％)添加調(diào)理劑礱糠15％，按3‰的接種量接種本發(fā)明發(fā)酵菌劑(三菌混合菌劑)，翻勻后，堆高80厘米，以不接種菌劑的作為對照。發(fā)酵糞肥的初始含水量為62.38％。每隔3天翻一次堆，每天記載高溫層的堆溫和5天取樣測定堆肥的發(fā)芽指數(shù)。結(jié)果顯示(見圖2)，堆肥從發(fā)芽指數(shù)(GI％)測定結(jié)果來看，接種發(fā)酵菌劑的在堆肥15天時已接近70％，而未接菌的要在堆肥25天時才接近70％，接種發(fā)酵菌劑的堆肥5天的堆溫已達(dá)到61℃，分別比未用菌劑和初始堆肥溫度增加了8℃和36℃，在堆肥發(fā)酵的前15天內(nèi)，接種的比不接種的堆肥發(fā)酵溫度提高8～11℃；堆肥脫水速度也較快，(見圖3)比對照降低11個百分點(diǎn)，經(jīng)發(fā)酵菌劑接種發(fā)酵所獲得的有機(jī)肥產(chǎn)品經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心測定，產(chǎn)品質(zhì)量、大腸桿菌數(shù)、蛔蟲卵死亡率全部符合國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在等成本情況下，在鮮食玉米田施用生物發(fā)酵有機(jī)肥比用菜餅增產(chǎn)5.7％；比對照增產(chǎn)10.8％，產(chǎn)量差異達(dá)極顯著水平；施用生物發(fā)酵有機(jī)肥的明前優(yōu)質(zhì)茶比菜餅增產(chǎn)18.5％，增收140元，普通春茶增產(chǎn)24.2％，增收76.5元，合計(jì)增收216.5元，差異達(dá)極顯著水平。
2、農(nóng)作物秸稈發(fā)酵處理將農(nóng)作物秸稈(或蔬菜加工廢棄物)曬干粉碎至3-5cm，加入20％糞尿廢水，0.3％的碳酸氫銨，按3‰的接種量接種本發(fā)明發(fā)酵菌劑(三菌混合菌劑)混勻，堆高100厘米，以不接種菌劑的作為對照。發(fā)酵秸稈物料的初始含水量為60.2％，每隔3天翻一次堆，每天記載高溫層的堆溫，接種發(fā)酵菌劑的堆肥5天的堆溫已達(dá)到58℃，分別比未用菌劑和初始堆肥溫度增加了6℃和13℃，在堆肥發(fā)酵的前12天內(nèi)，接種的比不接種的堆肥發(fā)酵溫度提高9℃；堆肥脫水速度也較快，比對照降低11個百分點(diǎn)，經(jīng)發(fā)酵菌劑接種發(fā)酵所獲得的有機(jī)肥產(chǎn)品經(jīng)測定，產(chǎn)品質(zhì)量符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在等成本情況下，施用生物發(fā)酵有機(jī)肥，在蔬菜番茄上施用生物發(fā)酵有機(jī)肥比用菜餅增產(chǎn)5.1％；比對照增產(chǎn)8.7％，每畝增收124.5元。
3、用于栽培基質(zhì)生產(chǎn)鮮豬糞(含水率約70％)40％、礱糠20％、香菇渣10％、蘑菇泥20％、中藥渣10％、，按3‰的接種量接種本發(fā)明發(fā)酵菌劑(三菌混合菌劑)，翻勻后，堆高80厘米，以不接種菌劑的作為對照。發(fā)酵基質(zhì)的初始含水量為55.6％。每隔3天翻一次堆，每天記載高溫層的堆溫和5天取樣測定堆肥的發(fā)芽指數(shù)。發(fā)酵基質(zhì)以發(fā)芽指數(shù)(GI％)測定結(jié)果來看，接種發(fā)酵菌劑的在堆肥14天時已接近70％，而未接菌的要在堆肥25天時才接近70％，接種發(fā)酵菌劑的堆肥5天的堆溫已達(dá)到60℃，發(fā)酵基質(zhì)比對照脫水速率快10.2％，25天后發(fā)酵基質(zhì)含水率為32.3％，此發(fā)酵物料再加入10％風(fēng)化煤混勻，作為蔬菜栽培基質(zhì)用作無土栽培，番茄長勢良好。
權(quán)利要求
1.灰藤黃鏈霉菌(Streptomyces griseoluteus)W1菌株，其菌株保藏號為CGMCCNO.1086。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于農(nóng)業(yè)廢棄物處理的發(fā)酵菌劑及其制備方法。本發(fā)明分離選育到活力強(qiáng)、生長快、耐高溫的扣囊復(fù)膜孢酵母ZJY
文檔編號C12R1/465GK1772880SQ20051009790
公開日2006年5月17日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者薛智勇, 王衛(wèi)平, 朱鳳香, 錢紅, 吳傳珍, 何福恒, 章錦秋 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院