專利名稱：新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒遺傳操作領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，作為副粘病毒科的重要成員和模型病毒，得到深入研究。重組NDV作為活病毒疫苗載體具有非凡的優(yōu)點(diǎn)包括LaSota株在內(nèi)的NDV弱毒疫苗長期以來一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分證明；NDV遺傳相對(duì)穩(wěn)定，僅有一個(gè)血清型，毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性極??；復(fù)制過程在細(xì)胞漿內(nèi)完成，從RNA到RNA，不存在DNA階段及細(xì)胞基因組整合的可能；NDV弱毒疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免疫及細(xì)胞免疫的形成，形成更加全面、確實(shí)的免疫保護(hù)；可通過飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種方式給苗，使用極為方便；NDV具有高滴度的雞胚生長特性，生產(chǎn)成本極為低廉(1，7，8，11，12，13)。NDV為高度傳染性和高度致死性的家禽疫病原，我國每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百億羽份以上。NDV作為活病毒疫苗載體應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)意義十分巨大。
負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過程，其基本過程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動(dòng)子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板；②以基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板與啟動(dòng)病毒復(fù)制必須的轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能結(jié)構(gòu)蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達(dá)質(zhì)粒(T7啟動(dòng)子)一起，共轉(zhuǎn)染整合表達(dá)T7聚合酶的病毒復(fù)制許可細(xì)胞；③24-72小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲(rescue)病毒。對(duì)基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS系統(tǒng))可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒(1，2，3，4，5，6)。
NDV基因組全長15186核苷酸，與其它副粘病毒一樣，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄編碼單元(圖1A)。本研究將GFP蛋白克隆到P和M之間，來研究外源蛋白在NDV中的表達(dá)適當(dāng)位置。NDV和其它負(fù)鏈RNA病毒一樣，其最小感染單位是核糖核蛋白復(fù)合物，無蛋白包裹的RNA本身并無感染性。NDV的基因組RNA通過與NP、P、L蛋白一起組成核蛋白復(fù)合體，啟動(dòng)RNA的首輪轉(zhuǎn)錄及病毒蛋白的翻譯合成、產(chǎn)生感染性子代病毒(7，10)。根據(jù)這一原理，1999年歐洲學(xué)者率先建立了第一個(gè)高致病性NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)(reversegenetic system，RGS系統(tǒng))(2)。目前在歐、美至少有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用NDV的RGS技術(shù)在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方面開展激烈的競(jìng)爭(zhēng)性研究。2001-2002年，Palese.P.等相繼構(gòu)建表達(dá)H1亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDV B1株和表達(dá)H7亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDVB1株，免疫試驗(yàn)表明這兩種NDV活載體疫苗可分別在小鼠和禽類誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接種雞體內(nèi)的復(fù)制能力較差，因而誘導(dǎo)免疫雞形成有效免疫保護(hù)的能力也相對(duì)較弱，試驗(yàn)表明，表達(dá)H7亞型HA基因的NDV B1株對(duì)NDV及H7亞型高致病力禽流感致死性攻擊的存活保護(hù)分別僅為60％和40％，且不能阻止病毒在體內(nèi)的復(fù)制和排放(12)。
研究表明，NDV基因組在不同位點(diǎn)插入外源報(bào)告基因或免疫原基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性(11，12，13)。我們選擇我國自行培育、生產(chǎn)實(shí)踐廣泛應(yīng)用、免疫效果良好的的NDV LaSota弱毒疫苗株，建立了相應(yīng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，成功救獲了表達(dá)GFP重組病毒株。救獲病毒具有良好的雞胚生長特性，免疫新生SPF雛雞可誘導(dǎo)高水平的HI抗體反應(yīng)。本研究為進(jìn)一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV病毒相關(guān)基礎(chǔ)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含(1)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，BHK-21。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選所述新城疫LaSota弱毒疫苗株為購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)的新城疫LaSota疫苗株AV1615。
在上述反向遺傳操作系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。
在上述反向遺傳操作系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是包含外源標(biāo)簽基因GFP的質(zhì)粒pBRNFL-GFP3。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述反向遺傳操作系統(tǒng)在制備負(fù)鏈RNA病毒中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列被突變、缺失或被外源基因插入，以制備相應(yīng)的突變、缺失或重組的負(fù)鏈RNA病毒。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供利用上述反向遺傳操作系統(tǒng)制備負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括以下步驟(1)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(2)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲病毒。


圖1.從高保真RT-PCR產(chǎn)生的亞基因組重疊cDNA片段裝配全長NDV cDNA。將cDNA片段在共有的限制位點(diǎn)連接，并且在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中裝配，在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中將RBZ和T7終止子序列預(yù)先克隆在EcoRI和salI位點(diǎn)之間(詳見說明書)。(A)顯示親代NDV的整個(gè)全長基因組的第一個(gè)和最后一個(gè)核苷酸。(B)在頂部顯示含有GFP基因的NDV的cDNA克隆，在遺傳圖譜之下的水平線顯示單個(gè)cDNA的位置。
圖2.通過RT-PCR產(chǎn)生引入修飾酶位點(diǎn)的核苷酸變化，并通過使用PRISM試劑盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。加框的是通過PCR誘變?cè)趐BRN1-10中引入的一個(gè)核苷酸替代(由A突變?yōu)镚)。
圖3.rNDV蛋白表達(dá)的免疫熒光分析。用rLaSota-GFP感染匯合BHK-21細(xì)胞。(A)MOI為1時(shí)感染的細(xì)胞，(B)陰性對(duì)照。將感染的細(xì)胞固定，透化，和用雞抗-NDV抗血清探測(cè)，接著與FITC-偶聯(lián)的兔抗-雞IgG抗體溫育。在Leica DMIRES2熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。顯示感染后28小時(shí)的數(shù)據(jù)。
圖4.用rLasota-GFP感染的BHK-21細(xì)胞的綠色熒光。左邊是感染109pFU/ml rLasota-GFP的BHK-21細(xì)胞。右邊是正常BHK-21細(xì)胞。
圖5.EGFP在不同代次的重組病毒內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。用rLasota-GFP感染雞胚原代細(xì)胞(CEF)(獲自哈爾濱獸醫(yī)研究所)，24h后熒光顯微鏡觀察(A)第一代，(B)第三代，(C)第五代，(D)第七代，(E)第九代。
圖6.在含胚的雞蛋中rNDV/LaSota病毒的生長曲線。用1×104EID50rNDV/LaSota接種胚雞蛋，在不同時(shí)刻(接種后24，48，和72小時(shí))收集尿囊液。通過EID50測(cè)定胚雞蛋的病毒滴度。數(shù)值獲自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。Log滴度來源于平均病毒滴度。
圖7.pBTRT的質(zhì)粒圖譜。
圖8.pBTRT質(zhì)粒的DNA序列。第一個(gè)斜體部分T7啟動(dòng)子；帶下劃線部分核酶序列；第二個(gè)帶下劃線的斜體部分T7終止子。
圖9.pBRN-FL-GFP3的質(zhì)粒圖譜。
圖10.pBRN-FL-GFP3質(zhì)粒的DNA序列。第一個(gè)斜體部分T7啟動(dòng)子；帶下劃線部分核酶序列；第二個(gè)帶下劃線的斜體部分T7終止子。
具體實(shí)施例方式
下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
實(shí)施例1 新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建細(xì)胞和病毒BHK-21細(xì)胞(乳倉鼠腎細(xì)胞ATCC CCL-10)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(Hyclone)及1μg/m1 G418的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基)；NDV Lasota疫苗株AV1615(購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。接種9-10日齡SPF雞胚尿囊腔擴(kuò)增后-70℃凍存?zhèn)溆茫浑u抗NDV高免性血清由本研究室制備(Chu，H.P.，G.Snell，D.J.Alexander，和G.C.Schild.1982.Avian Pathol 11227-234)；SPF雞胚及SPF雞雛均由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建基因組RNA轉(zhuǎn)錄載體pBTRT以低拷貝克隆載體pBR322(Invitrogen)為骨架并在EcoRI/salI位點(diǎn)插入T7啟動(dòng)子(T7promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(T7terminal)，由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建?？寺≡赥7啟動(dòng)子和核酶之間的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于Rib的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3′末端與克隆的DNA片斷精確一致。
NDV LaSota株基因組全長cDNA的構(gòu)建為建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，必須首先構(gòu)建相應(yīng)基因組的全長cDNA克隆，作為基因組負(fù)鏈RNA轉(zhuǎn)錄模板，為此構(gòu)建了覆蓋整個(gè)基因組的十個(gè)cDNA克隆片段，利用各個(gè)片斷間重疊部分的酶切位點(diǎn)，在低拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pBTRT連接組裝獲得了15186nt的完整cDNA克隆，序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400，并將GFP基因(GenBank AAZ16159.1)克隆到P，M之間。在全長cDNA片段5’末端前綴T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，在cDNA片斷后連有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。構(gòu)建完成的質(zhì)粒命名為pBRN-FL-GFP。為避免Xba位點(diǎn)的甲基化，通過PCR基因組將基因組cDNA中F蛋白編碼區(qū)第6178位堿基由T同義突變?yōu)镃，并作為拯救病毒的分子標(biāo)記。與其他研究者一樣，我們同時(shí)在T7聚合酶啟動(dòng)子于基因組cDNA的5’末端引入兩個(gè)多余的G，這可能有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救。具體如下NDV Lasota疫苗株病毒雞胚接種尿囊液經(jīng)常規(guī)方法(動(dòng)物病毒學(xué)，第二版)提取基因組RNA；整個(gè)基因組分為末端部分重疊的10個(gè)片段(F1-F10)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位點(diǎn)并經(jīng)序列分析確證與病毒基因組RNA序列完全一致；序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400。為引入特異的分子遺傳標(biāo)簽，選擇Lasota疫苗株基因組cDNA 6172bp處存在一甲基化的XbaI位點(diǎn)，序列為TCTAGATCA，利用PCR手段將其突變?yōu)門CTAGACCA，使其不再受甲基化酶識(shí)別，因而能夠被限制性內(nèi)切酶XbaI所識(shí)別；利用相鄰片段重疊部分存在的限制酶切位點(diǎn)連接成組裝完整的NDV基因組cDNA(圖1A)，并將GFP基因克隆到P，M之間的PmeI位點(diǎn)，并在前裝上基因終止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在轉(zhuǎn)錄載體pBTRT上，構(gòu)建成含有GFP基因病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-FL-GFP3(圖1B)；表達(dá)核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)cDNA分別緊接著克隆在pBluescriptII(+/-)質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)成轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
從全長cDNA克隆救獲感染性NDV(病毒拯救)為了從克隆的cDNA中拯救感染性NDV，首先以pBRN-FL-GFP3及表達(dá)NDV NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。NDV的融合蛋白F0必須裂解成F1和F2才具有感染性，對(duì)于Lasota弱毒株而言，BHK-21細(xì)胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)蛋白酶，所以此時(shí)應(yīng)換成無血清培養(yǎng)基并加入TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮.Sigma)(1μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種于9-11日齡的SPF雞胚。4天后收獲雞胚尿囊液，血凝(HA)試驗(yàn)結(jié)果陽性，不同雞胚的HA價(jià)介于28-11；NDV免疫血清血凝抑制(HI)試驗(yàn)分析同樣呈現(xiàn)陽性結(jié)果。收獲病毒陽性尿囊液作為救獲病毒rLasota-GFP的F1代。進(jìn)一步的RT-PCR及序列分析結(jié)果顯示，F(xiàn)1代救獲病毒基因組cDNA的6178位點(diǎn)堿基為C，而非原LaSota親本株的C，和預(yù)期完全相符(圖2)。結(jié)果表明，通過反遺傳操作技術(shù)，利用NDV LaSota疫苗株基因組cDNA克隆成功地救獲具有感染性的子代病毒rLaSota-GFP。更具體地，實(shí)驗(yàn)步驟如下BHK-21細(xì)胞接種于35mm六孔板內(nèi)生長達(dá)50-80％單層時(shí)，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pBRNFL-GFP3、pBSNP、pBSP和pBSL分別以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，采用CaP04轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogene)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后8-12小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5分鐘，加入完全DMEM過夜孵育，第二天換成無血清培養(yǎng)基，并加入TPCK(1μg/ml)繼續(xù)孵育2-3天后，收獲培養(yǎng)物上清，0.22um孔徑濾器過濾后接種9-11天的SPF胚尿囊腔；接種后的SPF胚繼續(xù)培養(yǎng)，3-5天，取雞胚尿囊液50μl進(jìn)行按常規(guī)進(jìn)行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)(Thayer SG，Nersessian BN，RivetzB，F(xiàn)letcher OJ.Comparison of serological tests for antibodies againstNewcastle disease virus and infectious bronchitis virus using ImmunoCombsolid-phase immunoassay，a commercial enzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibition assay.Avian Dis.1987 Jul-Sep；31(3)459-63.)。收獲HA及HI試驗(yàn)結(jié)果陽性尿囊液，-70℃凍存，并按常規(guī)方法分別于9-10日齡雞胚及雞胚成纖維細(xì)胞滴定每毫升EID50及PFU病毒含量(14)。命名為rLaSota-GFP。
實(shí)施例2 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)試驗(yàn)NDV LaSota疫苗株能一過性感染體外培養(yǎng)的薄弱動(dòng)物細(xì)胞。為證明rLaSota-GFP病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及病毒抗原表達(dá)，rLaSota-GFP尿囊毒以MOI為1的病毒量感染約70-80％的單層BHK-21細(xì)胞，感染后24小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)早期CPE(細(xì)胞病變)現(xiàn)象，立即以NDV高免SPF雞陽性血清為檢測(cè)抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，結(jié)果病毒感染細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖3A)，而SPF雞對(duì)照血清熒光染色則為陰性(圖3B)。更具體地，實(shí)驗(yàn)步驟如下雞胚接種尿囊病毒液rLaSota-GFP以DMEM適當(dāng)倍數(shù)稀釋，按MOI約為5、50μl體積感染生長于24孔板的BHK-21，37℃，孵育1h后用DMEM洗滌三遍，然后加入完全DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，24h后用95％乙醇固定細(xì)胞5min，PBST(含有0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗細(xì)胞后用SPF雞血清進(jìn)行封閉1小時(shí)后，以雞抗NDV高免血清和SPF血清作為一抗，以1∶100稀釋雞抗NDV高免性血清為一抗和相同稀釋倍數(shù)的SPF雞陰性血清為對(duì)照，作用30分鐘后PBST洗滌后，加入1∶160稀釋熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡(Leica DMIRES2)觀察結(jié)果。
實(shí)施例3 GFP蛋白的表達(dá)尿囊毒rLaSota-GFP以MOI為1的病毒量感染約80％的單層BHK-21細(xì)胞，感染后24小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)早期CPE現(xiàn)象，出現(xiàn)病變后在熒光顯微鏡下(Leica DMIRES2)觀察結(jié)果。陽性樣品中有綠色熒光出現(xiàn)，野生型NDV作為陰性對(duì)照，結(jié)果為陰性(圖4)。
為證明rLaSota-EGFP病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及插入外源報(bào)告基因GFP在傳代過程中仍然能夠保持穩(wěn)定表達(dá)，rLaSota-EGFP雞胚尿囊腔接種連續(xù)傳代9次，各代次雞胚尿囊病毒液分別10倍連續(xù)梯度稀釋100ul體積接種24孔板培養(yǎng)雞胚原代細(xì)胞(CEF)，24h后熒光顯微鏡(LeicaDMIRES2)直接觀察結(jié)果(見圖5)，根據(jù)鏡下表達(dá)強(qiáng)陽性綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量，確定各代次rLaSota-EGFP每毫升蝕斑形成單位(PFU)介于109-1010之間(表1)。結(jié)果證明，rLaSota-EGFP病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及插入外源報(bào)告基因GFP在傳代過程中仍然能夠保持穩(wěn)定表達(dá)。
表1傳代中rNDV-EGFP的GFP的穩(wěn)定表達(dá)

實(shí)施例4 rNDV在雞胚的生長特性及致病特性為確定反向遺傳操作救獲rLaSota-GFP的雞胚生長特性及其對(duì)雞胚的致病性，rLaSota-GFP病毒F1代尿囊病毒液按1×104EID50接種SPF雞胚尿囊腔。1×104EID50接種后96小時(shí)內(nèi)完全不致死SPF雞胚。接種后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及96小時(shí)收獲尿囊液，HA滴度平均值分別為27.5、210.3、211.3和211.6，而每毫升尿囊液EID50則分別為10-8.54、10-8.635、10-10.085和10-9.43(圖6)。按照OIE標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定rLaSota和rLaSota-GFP腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)分別為為0.37和0.35。結(jié)果表明反向遺傳操作救獲病毒rLaSota-GFP仍然保持NDV LaSota疫苗親本株在雞胚的高滴度生長及低致死的生物學(xué)特性。
實(shí)施例5 誘導(dǎo)動(dòng)物保護(hù)性抗體的免疫效果為測(cè)定反向遺傳操作救獲rLaSota對(duì)SPF雞雛的免疫原性，雞胚擴(kuò)增尿囊毒2×106EID50劑量經(jīng)經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑人工免疫12羽七日齡白色來亨SPF雞雛(哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，另設(shè)非免疫組對(duì)照組8羽；免疫組和非免疫對(duì)照組分別飼養(yǎng)于空氣負(fù)壓過濾隔離器中。3周以后翅靜脈采血分離血清按常規(guī)檢測(cè)NDV特異HI抗體。另外，在免疫后21天用強(qiáng)毒F48E9(獲自哈爾濱獸醫(yī)研究所)以103EID50劑量經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑進(jìn)行攻擊，觀察兩周，統(tǒng)計(jì)發(fā)病與死亡情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果rLaSota尿囊病毒液F1代以2×106EID50劑量經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑人工免疫七日齡白色來亨SPF雞雛，免疫后觀察3周，期間免疫組所有雛雞無任何異常，飼料消耗及生長發(fā)育與非免疫對(duì)照組無明顯差異。免疫后3周檢測(cè)血清NDV特異HI抗體水平，全部介于27-29，平均為28.2(表2)。免疫組攻毒后未出現(xiàn)任何發(fā)病或死亡，完全保護(hù)(10/10)，同日齡非免疫對(duì)照組則全部發(fā)病死亡(0/4)(表3)。結(jié)果顯示，rLaSota-GFP一次免疫雛雞即可誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體反應(yīng)，具有良好的免疫原性，并且保留低致病性LaSota疫苗株良好的安全性。
本研究采用穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒(9，10)，感染BHK-21細(xì)胞在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄全長基因組負(fù)鏈RNA，同時(shí)表達(dá)啟動(dòng)病毒復(fù)制所需的NP、P和L蛋白，取得了很高病毒拯救的效率。另外，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入蛋白酶也是救獲病毒的必要條件。在雞胚尿囊液中存在特殊的蛋白酶，可以特異將弱毒株的F0裂解成F1和F2，釋放F1N端高度疏水的融合功能區(qū)域，是裝配病毒粒子獲得進(jìn)一步的感染能力，而用于轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中不存在相應(yīng)蛋白酶，因此我們加入乙?；鹊鞍酌?TPCK)來替代雞胚尿囊液，以促進(jìn)病毒粒子獲得感染性。相反，在不加胰酶進(jìn)行轉(zhuǎn)染的情況下，我們未能成功救獲病毒。
表2.重組NDV的免疫原性a劑量，2×106EID50.b接種后.核酸序列號(hào).NDV LaSota疫苗株基因組全長cDNA序列(15186nt)GeneBank登錄號(hào)AY845400。

表3.重組LaSota NDV免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

*7日齡SPF雛雞，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼接種rLaSota(1×106EID50/只)。
**翅下靜脈采血，測(cè)定HI滴度，計(jì)算平均值。
***免疫后三周，用NDV強(qiáng)毒經(jīng)滴鼻和肌肉注射進(jìn)行攻毒(1×103EID50/只)本研究通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救的表達(dá)GFP弱毒疫苗可在接種雞胚內(nèi)達(dá)到與親本LaSota疫苗株相似的生長滴度，并且救獲病毒以103EID50劑量尿囊腔內(nèi)接種9-10日齡SPF雞胚，96小時(shí)不致死雞胚；接種后24、48、72及96小時(shí)尿囊液HA價(jià)分別為27.5、210.3、211.3和211.6，每毫升尿囊液EID50則分別為10-8.54、10-8.635、10-10.085和10-9.43；免疫7日齡SPF雛雞可誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體反應(yīng)，免疫后19天抗體血清HI抗體滴度介于28-9，充分顯示該本發(fā)明的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救的疫苗株作為活病毒載體疫苗應(yīng)該具備的高度安全、良好雞胚生長適應(yīng)性及含有外源基因時(shí)良好的免疫原性。重組NDV活病毒載體疫苗生產(chǎn)成本低廉、使用極為方便，可通過飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼給苗；由于呼吸道、消化道是NDV及其他多種重要疫病原的自然感染侵入途徑，重組NDV活毒疫苗可誘導(dǎo)高水平的粘膜免疫反應(yīng)，提供更為確實(shí)的有效免疫保護(hù)；NDV弱毒疫苗免疫在我國養(yǎng)禽業(yè)幾乎是所有新生雛雞必不可少的免疫程序，理所當(dāng)然成為最具吸引力的重組活病毒疫苗載體。
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權(quán)利要求
1.一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含(1)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的細(xì)胞系，如通過穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的牛痘病毒(VV-T7)提供T7聚合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述自我剪切的核酸酶是丁肝病毒核酶(Rib)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述新城疫LaSota弱毒疫苗株為AV1615。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是包含外源標(biāo)簽基因GFP的質(zhì)粒pBRNFL-GFP3，外源基因GFP通過P和M基因間人工引入的PmeI位點(diǎn)插入NDV病毒基因組。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
9.權(quán)利要求1或5的反向遺傳操作系統(tǒng)在制備負(fù)鏈RNA病毒中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列被突變、缺失或被外源基因插入，以制備相應(yīng)的突變、缺失或重組的負(fù)鏈RNA病毒。
11.一種利用權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的反向遺傳操作系統(tǒng)制備負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括以下步驟(1)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(2)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法制備的NDV LaSota疫苗株子代病毒rLaSota-GFP。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用，該系統(tǒng)包含轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的宿主細(xì)胞。通過上述反向遺傳操作系統(tǒng)，成功救獲了野生型病毒株，并且為進(jìn)一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV病毒相關(guān)基礎(chǔ)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1772909SQ20051009799
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者步志高, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所