專利名稱：一種海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物抗病基因的篩選、分離、基因轉(zhuǎn)移及其功能研究的生物高新技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及海島棉一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因及其功能研究，與該基因在培育抗黃萎病植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃萎病是威脅棉花生產(chǎn)的重要病害之一，因連年發(fā)生，防治困難，現(xiàn)已成為影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要障礙。據(jù)統(tǒng)計，目前我國棉花黃萎病的發(fā)病面積已達整個棉田的一半以上。培育抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟的手段。經(jīng)研究，海島棉等棉種中具有高抗黃萎病基因，但實踐證明利用普通雜交育種手段難以獲得穩(wěn)定的高抗病且豐產(chǎn)的品種?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)的方法為抗病基因的分離和轉(zhuǎn)基因提供了便利，目前國內(nèi)外已分離、獲得了一些抗病相關(guān)基因，同時也利用了一些抗真菌基因?qū)γ藁ㄟM行了轉(zhuǎn)基因研究。
國內(nèi)外已有將抗真菌基因轉(zhuǎn)化到棉花中的報道，轉(zhuǎn)化的基因包括幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶(GO)、天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungalprotein，簡稱GAFP)等基因。對研究結(jié)果進行分析，陸地棉在轉(zhuǎn)化上述基因后，轉(zhuǎn)基因植株的黃萎病抗性可以得到一定程度的提高，甚至出現(xiàn)高抗植株或品系，但尚未見到定型的高抗黃萎病品種推廣。此外這些基因均屬于廣譜抗菌基因，并非專門針對黃萎病菌的抗性基因，也并非來自抗病的棉花自身。
劉慧君等通過對轉(zhuǎn)葡萄糖氧化酶(GO)基因棉株系B99261(IV、VIII代)和B99267(VIII、IV代)與受體新陸早7號及耐黃萎病對照中棉所12的農(nóng)藝性狀及抗病性進行比較。結(jié)果轉(zhuǎn)基因棉花株型變矮，果柄變長，單株成鈴數(shù)和纖維品質(zhì)有明顯提高。B99261對苗期炭疽病、立枯病及鈴疫病抗性均有顯著提高，但不抗紅腐??；B99267對棉鈴疫病的抗性也顯著增強。這兩個品系對枯萎病和黃萎病的抗性均有顯著提高，其中第四代B99261抗黃萎病性能最好，達到抗病水平(劉慧君，簡桂良，鄒亞飛。GO基因?qū)雽γ藁ㄞr(nóng)藝性狀及抗病性的影響，分子植物育種，2003年，第1卷，第5/6期，第669-672頁)。
劉桂珍等通過激光微束穿刺法將β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因雙價植物表達載體pBLGC導(dǎo)入棉花幼胚，轉(zhuǎn)化一代棉花幼苗，并用蘸根法進行抗黃萎病篩選，將存活的苗移入病圃進行了卡那霉素(Kan 1％)抗性測定。結(jié)果在移栽的29株幼苗中，有9株表現(xiàn)出明顯的Kan抗性，對9株抗Kan植株進行了PCR檢測，其中7株表現(xiàn)為陽性。病圃中的T1代轉(zhuǎn)基因植株在經(jīng)歷了黃萎病發(fā)病高峰期后，7株P(guān)CR陽性植株明顯抗病，并已正常開花結(jié)鈴，其它T1代植株及對照植株全部因后期發(fā)病死亡。初步證明外源基因已整合到棉花基因組中，且使轉(zhuǎn)基因植株對黃萎病表現(xiàn)出一定的抗性(劉桂珍，藍海燕，田穎川，李樹誠，樂錦華，王蘭嵐，陳正華，利用激光微束穿刺法獲得抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花的研究，中國激光，27(3)279-283)。樂錦華等用花粉管通道法將菜豆幾丁質(zhì)酶基因與煙草β-1，3-葡聚糖酶基因雙價植物表達載體pBLGC導(dǎo)入新疆棉花主栽品種(系)系550、822、1304、石遠321。通過卡那霉素抗性檢測、PCR、Southern雜交驗證和抗黃萎病、枯萎病性篩選，得到抗病性良好且遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因棉花。經(jīng)過6年10個世代的選育，育成抗枯萎病、抗(耐)黃萎病的轉(zhuǎn)基因抗病新品系(樂錦華，祝建波，崔百明，朱新霞，王愛英，陳正華，劉桂，李國英，簡桂良，吳剛，利用目的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)培育棉花抗病新品種，石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，第6卷第3期2002年9月)。
天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein簡稱GAFP)是從我國傳統(tǒng)中藥天麻(Gastrodia elata Bl.)中分離到的一種具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì)，它對許多植物真菌病害包括棉花枯萎病、黃萎病等的致病菌具有很強的離體抑制作用，因此在植物抗真菌病的基因工程改造中有很重要的應(yīng)用價值。王義琴等通過花粉管通道法，將編碼GAFP的基因gafp轉(zhuǎn)入3個新疆彩色棉品種中，通過田間抗病篩選和分子檢測，得到了高抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因植株，兩株Southern雜交陽性植株LB-5-8和ZB-1-49對黃萎病表現(xiàn)整株免疫。RT-PCR結(jié)果顯示，LB-5-8和ZB-1-49中均有g(shù)afp的正確轉(zhuǎn)錄；離體的抑菌實驗也表明，它們的蛋白粗提物對棉花黃萎病致病菌具有明顯的抑制作用，表明gafp在轉(zhuǎn)基因植株中正確表達，翻譯產(chǎn)物具有活性。經(jīng)過進一步選育和擴繁，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因彩色棉后代具有穩(wěn)定的、較強的抗黃萎病能力，該研究為通過植物抗病基因工程的方法為控制棉花黃萎病提供了一條新的途徑(王義琴，陳大軍，危曉薇，吳明剛，王冬梅，姚正培，黃全生，劉豐疆，美麗古利，李仁敬，孫勇如，天麻抗真菌蛋白基因(gafp)轉(zhuǎn)化彩色棉的研究，植物學(xué)通報2003，20(6)703-712)。
吳家和等通過根癌桿菌介導(dǎo)法，將維管束特異性啟動子(來自鴨跖草黃斑駁病毒，ComYMV)驅(qū)動的幾丁質(zhì)酶和CaMV 35S啟動子驅(qū)動的β-1，3-葡聚糖酶嵌合雙價基因，導(dǎo)入陸地棉品種冀合321和中棉所35。利用卡那霉素涂抹法對轉(zhuǎn)基因株的卡那霉素抗性進行初步鑒定，再經(jīng)PCR和Southern雜交確證，結(jié)果雙價抗病基因分別以1-2個拷貝整合到棉花基因組內(nèi)。對轉(zhuǎn)基因株系T3幼苗進行無底塑缽菌液澆根法鑒定和大田病圃鑒定，結(jié)果7個轉(zhuǎn)化株系均表現(xiàn)不同程度的抗或耐黃萎病性，苗期鑒定結(jié)果和大田病圃調(diào)查結(jié)果基本一致；其中D9910、D9915和D9919等3個轉(zhuǎn)基因純合系的大田病情指數(shù)分別為6.5、9.4和9.5，均達到高抗水平。對以上3個高抗黃萎病的純合系進行遺傳分析，結(jié)果這3個抗病純合系的卡那霉素抗性符合一對顯性基因分離規(guī)律，結(jié)合分子雜交驗證結(jié)果，可以認(rèn)為這3個轉(zhuǎn)基因株均含有一個拷貝的雙抗病基因。
高等植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(lipid transfer proteins，LTP)是一類小分子量(約9kDa)的堿性蛋白質(zhì)，現(xiàn)已從玉米幼苗、菠菜葉、蓖麻、大麥、洋蔥、棉花及擬南芥等多種植物中純化出了LTP，且編碼LTP的cDNA及基因也已從不同植物中克隆得到。LTP能夠在生物膜之間轉(zhuǎn)運磷脂，因而認(rèn)為LTP參與了細(xì)胞內(nèi)生物膜的形成。經(jīng)研究又發(fā)現(xiàn)LTP具有信號肽，可從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，位于細(xì)胞壁上，因而又對其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運脂質(zhì)能力產(chǎn)生疑問。據(jù)報道在植物受到病原菌侵染情況下，類LTP可能通過一個脂依賴分子而促進了長距離運輸(Ana M.Maldonado，Nature 41926，September，2002)。另有證據(jù)表明LTP參與了角質(zhì)與臘質(zhì)的形成、植物的抗病反應(yīng)和植物對環(huán)境變化(溫度、鹽、干旱協(xié)迫)的適應(yīng)。另外從棉花中分離獲得LTP基因，并進行研究的報道只是將該基因的功能與纖維的發(fā)育聯(lián)系在一起，而從海島棉葉片中分離獲得LTP基因，且轉(zhuǎn)化該基因到陸地棉中，并獲得高抗黃萎病植株尚未見報道。
LTP轉(zhuǎn)運脂質(zhì)活性的測定方法較為復(fù)雜，它需要兩種生物膜，即供體膜(donor)和受體膜(acceptor)。供體膜一般選用放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的磷脂經(jīng)超聲波處理形成的脂質(zhì)體(liposome)，受體膜則多選用線粒體或其它能通過離心與脂質(zhì)體分開的亞細(xì)胞成分。通過將受體膜與供體膜共培養(yǎng)后再將它們分離，測定受體膜中放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的磷脂含量來表示LTP轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的能力。在缺LTP時，生物膜間的磷脂轉(zhuǎn)移效率非常低或沒有。在動、植物L(fēng)TP轉(zhuǎn)運脂質(zhì)的試驗中，都發(fā)現(xiàn)磷脂在供體膜與受體膜之間的雙向交流，因而又將LTP稱為磷脂交換蛋白(phospholipids exchange protein，PLEP)，但現(xiàn)在公認(rèn)的命名仍為LTP。因為LTP是一類小分子的堿性蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的分離與純化是基于其生化特征進行的，即通過凝膠分子篩、離子交換層析、反向高壓液相色譜等技術(shù)進行分離。在純化過程中的LTP活性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)有多個LTP轉(zhuǎn)脂活性峰的出現(xiàn)，表明在植物中存在同工酶成分。
玉米、小麥、蓖麻和水稻LTP的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)已經(jīng)測定，另有一些植物的LTP的一級結(jié)構(gòu)也可通過其cDNA序列推導(dǎo)而得。LTP由91-95個氨基酸殘基組成，具有1個由21-27個氨基酸殘基組成的信號肽，還包含8個高度保守的半胱氨酸殘基組成4個二硫橋。其一級結(jié)構(gòu)在不同物種的同源性相差較大，植物L(fēng)TP氨基酸殘基序列的同源性在30％-70％之間。盡管存在這種多態(tài)性，但它們都具有LTP蛋白的結(jié)構(gòu)特點和特性。利用X射線晶體衍射和核磁共振(NMR)研究LTP的三維結(jié)構(gòu)，并繪制出LTP的三維結(jié)構(gòu)圖。這兩種方法皆以玉米LTP為基礎(chǔ)，它含93個氨基酸殘基，構(gòu)成4個α螺旋(α-helix)，靠近C端處形成4個二硫鍵，并具有一個內(nèi)陷的疏水腔(hydrophobic cavity)，LTP運輸磷脂分子時就是磷脂分子的疏水脂肪鏈嵌入LTP的疏水腔內(nèi)。NMR的研究結(jié)果表明，LTP分子的疏水腔足以容下整個磷脂分子，但X射線晶體衍射研究結(jié)果表明只有?；湶迦隠TP分子的疏水腔，且一些特異的LTP，如?；o酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA-binding protein，ACBP)的三維空間結(jié)構(gòu)也與LTP相似。關(guān)于LTP如何在膜之間進行磷脂轉(zhuǎn)運的機制，現(xiàn)在比較公認(rèn)的模式是LTP與磷脂形成LTP磷脂復(fù)合體。磷脂分子的兩個?；溚琇TP的作用是一個強一個弱，當(dāng)LTP攜帶磷脂分子到達膜表面時，這種特性有利于進行磷脂的交換。然而用二硫蘇糖醇處理將LTP的α螺旋從40％降至25％時，則玉米的LTP轉(zhuǎn)脂活性被抑制，表明LTP的二硫鍵對維持其活性的重要性；加入NaCl等離子化合物也可抑制LTP的活性，這表明LTP與生物膜間的靜電平衡對維持LTP活性也很重要，且其活性具Ca2+依賴性。編碼LTP的基因或cDNA已從菠菜、蕃茄、大麥、胡蘿卜、擬南芥菜等中克隆到。大約有超過100個編碼與LTP類似的表達序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)被確認(rèn)。這些EST都被歸于一類暫時的同源序列，其序列可通過互聯(lián)網(wǎng)獲取。但目前仍有待確認(rèn)它們是否都具有LTP基因的功能。DNA印跡分析表明棉花、玉米、水稻等都存在LTP基因的多個拷貝，并分布在不同的染色體上。
LTP基因的表達有較強的發(fā)育和組織特異性，不同物種的LTP基因的表達特點不盡相同。但多數(shù)材料的營養(yǎng)器官的表達研究表明，根中經(jīng)常沒有LTP基因的表達，而LTP基因在幼嫩組織比老化組織中的表達要強，且在幼花序中的表達更強。原位雜交實驗結(jié)果表明玉米幼苗、胡蘿卜胚的LTP基因僅僅在表皮細(xì)胞中表達，具有較強的細(xì)胞類型特異性，而油菜的LTP基因在所有的上胚軸中皆有表達，而另一種LTP基因則在油菜的絨氈層細(xì)胞中特異表達。原位雜交實驗也證明擬南芥菜的AtLTP1基因與胚的起源相聯(lián)系，主要在表皮細(xì)胞中表達，認(rèn)為它可能與胚頂端組織的形成有關(guān)。并通過植物轉(zhuǎn)基因的方法，將LTP基因的啟動子同GUS基因結(jié)合，研究LTP基因表達的特異性。
LTP的向外分泌功能與體胚發(fā)生的聯(lián)系可解釋為它可能參與了幼胚外保護層的形成。最近的研究還表明LTP參與了植物的抗病反應(yīng)，是一種植物的抗病蛋白。純化的植物L(fēng)TP蛋白在體外可抑制細(xì)菌及真菌的生長。從玉米、菠菜、花椰菜、擬南芥中分離的LTP蛋白都表現(xiàn)不同程度的抗病功能，一種LTP蛋白還表現(xiàn)出受病原真菌的誘導(dǎo)表達。然而，LTP參與植物抗病的機制卻不明確，一種觀點認(rèn)為它可能作為一種極性蛋白質(zhì)影響了真菌的細(xì)胞膜。洋蔥的一種抗病蛋白與LTP有同源性，但它不表現(xiàn)有轉(zhuǎn)運脂質(zhì)的功能。還有研究表明，LTP的表達受環(huán)境因子影響，如溫度、鹽和干旱脅迫可誘導(dǎo)LTP基因的表達。NaCl、甘露醇、脫落酸(ABA)處理蕃茄可誘導(dǎo)LTP基因在莖的表達，大麥、棉花的LTP基因則可由低溫和ABA誘導(dǎo)表達。然而它們在逆境脅迫下的表達是否同植物的抗逆性有關(guān)則需進一步研究。
目前LTP基因的表達調(diào)控機理還不明確。特異性LTP是一類專一性不強的轉(zhuǎn)運磷脂的蛋白質(zhì)，對不同的磷脂皆具有轉(zhuǎn)運能力，但細(xì)胞內(nèi)還存在有對某類脂質(zhì)有特異結(jié)合的蛋白，如最近發(fā)現(xiàn)了2類這樣的蛋白質(zhì)一類是酰基輔酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA-binding protein，ACBP)，現(xiàn)已從擬南芥中分離、純化到ACBP，它是一種由92個氨基酸殘基組成，等電點為9的堿性蛋白質(zhì)，能與酰基輔酶A特異結(jié)合，但不同其它脂質(zhì)及?；Y(jié)合。其基本特性與LTP相似，但沒有信號肽及LTP的8個保守的半胱氨酸殘基，是一胞內(nèi)蛋白。棉花、水稻、擬南芥的ACBP的cDNA已經(jīng)克隆。另一類特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(specific lipid transfer protein，spLTP)是一類可溶性的LTP，它們已在動物、酵母中發(fā)現(xiàn)，其中能特異地轉(zhuǎn)運磷脂酰肌醇(PI)的稱為PI-TP(phosphatidylinositol-transfer protein)；能特異地轉(zhuǎn)運磷脂酰膽堿(PC)的LTP稱為PC-TP(phosphatidylcholine-transfer protein)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，名稱為AT7，來源于棉屬海島棉亞種(Gossypium barbadense)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有磷脂轉(zhuǎn)運作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由120個氨基酸殘基組成。
編碼海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白At7的基因(At7)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由592個堿基組成，其編碼序列為自5’端第80-442位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增At7中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗黃萎病植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育抗黃萎病植物的方法，是將所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，得到抗黃萎病的植物。
所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7可通過含有所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7的植物表達載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或pBI121等。使用At7構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛素(ubiquitin)基因啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
以pCAMBIA1301為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因的植物表達載體為pCAMBIA1301-At7。
攜帶有本發(fā)明At7的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是棉花、煙草、擬南芥、水稻、小麥、苜蓿、大豆、番茄、茄子及西瓜等各種易感染黃萎病(Verticilliumwilt)的植物。
本發(fā)明提供了一種來源于海島棉的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白At7及其編碼基因At7，試驗證明At7的原核表達產(chǎn)物對棉花黃萎菌具有較強的抑菌活性。轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥及棉花對黃萎菌毒素均表現(xiàn)出較強的耐受能力。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)⒃诳裹S萎病植物(特別是棉花)的遺傳育種中發(fā)揮巨大作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為IPTG誘導(dǎo)1-4h At7蛋白的原核表達量的檢測結(jié)果圖2為At7原核表達產(chǎn)物At7對黃萎菌V991的抑制效果圖3為At7原核表達活菌(轉(zhuǎn)化有pET-28a-At7的大腸桿菌BL21)對黃萎菌V991的抑制效果圖3A為At7超表達載體pCAMBIA1301-At7的物理圖譜圖4為由At7轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織長出的幼芽圖5為At7轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株圖6為RT-PCR檢測目的基因At7在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果圖7為針刺法檢測黃萎菌毒素對At7轉(zhuǎn)基因煙草陽性株致萎反應(yīng)的結(jié)果圖8為將At7轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代的種子平鋪于含潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選圖9為At7轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性株和陰性株T1代的種子經(jīng)抗生素篩選后萌發(fā)后的植株圖10為At7轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測結(jié)果圖11為At7轉(zhuǎn)基因擬南芥對黃萎菌毒素的抗性檢測結(jié)果圖12為At7轉(zhuǎn)基因陽性植株對雜菌的抵御能力圖13為將pCAMBIA1301-At7轉(zhuǎn)化棉花后剛出土的棉花幼苗圖14為種植在病土中的At7轉(zhuǎn)基因棉花苗期發(fā)病的情況(箭頭所指為抗病植株)圖15為經(jīng)抗病性篩選后At7轉(zhuǎn)基因棉花的存活植株圖16為經(jīng)抗病性篩選后獲得的At7轉(zhuǎn)基因陽性植株的田間表現(xiàn)圖17為At7轉(zhuǎn)基因棉株的PCR鑒定結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生工合成。
實施例1海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7的克隆植物材料高抗黃萎病海島棉AXMN。
(1)先用無菌土對植物材料進行栽培，待棉苗長出1-2片真葉時，將棉苗取出并用清水清洗根系，然后分為2組，其中一組用強致病力黃萎菌V991毒素稀釋70倍液浸泡，在24小時之內(nèi)每隔6小時取樣一次，取樣時間分為6、12、18和24h 4個時間段(每次取出3株，將樣品用剪刀剪開，分為根和地上部分)，取樣后稱重，然后立即用液氮速凍，并置于-80℃冰箱暫存；另一組用清水浸泡，做相同處理。(2)將經(jīng)毒素處理6-24小時的樣品混合，用CTAB方法提取棉花地上部分葉片的總RNA，再用Promega公司的mRNA純化試劑盒純化出mRNA；對照亦用相同的方法處理。(3)用抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)方法得到毒素誘導(dǎo)海島棉特異表達片段10個，具體方法如下采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction試劑盒并按試劑盒的說明書進行操作，首先以上述經(jīng)毒素處理6、12、18和24小時的棉花地上部分葉片的mRNA為模板，以經(jīng)清水處理的為對照，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；再以第一鏈cDNA為模板，合成第二鏈cDNA，用限制性內(nèi)切酶Rsal酶切合成的cDNA，然后將經(jīng)毒素處理的cDNA酶切片段分別加兩種接頭，用過量的對照cDNA片段分別與兩種加不同接頭的cDNA片段退火(第一次雜交)，再將第一次雜交后的兩種產(chǎn)物進行第二次雜交，再以經(jīng)過第二次雜交后的產(chǎn)物為模板進行一次普通PCR和一次巢式PCR，將第二次PCR產(chǎn)物直接用PAGE分離，所得到的電泳帶即為海島棉經(jīng)黃萎菌毒素誘導(dǎo)而特異表達的基因片段，結(jié)果共得到10個片段，分別編號為At1-At10。經(jīng)序列同源性比較將其中第7個序列確認(rèn)為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(LTP)基因，將該基因命名為At7，設(shè)計特異引物，PCR擴增其全長cDNA，引物序列如下引物1(上游引物)5’-GATATTAATTTGTAGATAAAGTTAATATTACG-3’；引物2(下游引物)5’-GACGACAATCAGCAATAGTAC-3’分別以上述經(jīng)黃萎菌V991毒素處理6、12、18和24小時的混合樣品的逆轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，PCR擴增海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7的全長cDNA，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；然后94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，共35個循環(huán)；最后72℃ 10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約592bp的目的片段，將其克隆到載體pGEM-T(Promega公司)中，篩選陽性克隆，進行測序，將含有At7cDNA序列的重組質(zhì)粒載體命名為At7-pGEM-T，測序結(jié)果表明At7具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由592個堿基組成，其編碼序列為自5’端第80-442位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
實施例2檢測At7原核表達產(chǎn)物對黃萎菌的抑菌效果一、At7的原核表達將實施例1獲得的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7的cDNA序列克隆入載體pET-28a(Novagen公司)中，將含有At7cDNA序列的重組載體命名為pET-28a-At7，然后將pET-28a-At7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選得到陽性重組子。挑取含有pET-28a-At7的單菌落，將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法，在37℃、1mmol/mL IPTG下誘導(dǎo)表達16h，以轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21為陰性對照，每隔1h取一次樣，對1h、2h、3h、4h取的樣品進行6％SDS-PAGE電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道Marker為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道1h、2h、3h、4h分別表示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1h、2h、3h、4h At7蛋白的原核表達量，泳道CK1、CK2、CK3、CK4分別表示IPTG誘導(dǎo)1h、2h、3h、4h的陰性對照)，結(jié)果在IPTG誘導(dǎo)4h時At7的表達量最高，表達的特異蛋白At7分子量為27.59kDa，在pH為9.8時溶于水，屬于堿性蛋白。
二、檢測At7原核表達產(chǎn)物At7對黃萎菌的抑菌效果取步驟一經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h的轉(zhuǎn)化有pET-28a-At7的大腸桿菌BL21菌液1.5mL，離心收集菌體，加入100μL TE溶液，用交替凍融法(在-70℃和室溫下反復(fù)5-6次)破碎菌體，分別吸取上清和沉淀蛋白進行黃萎菌V991的抑制試驗，以轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)的上清和沉淀蛋白為對照，方法為首先將黃萎菌接種于PDA培養(yǎng)基的中央，然后在黃萎菌的四周打4個孔，其中兩個分別加入誘導(dǎo)表達凍融產(chǎn)物的上清液100μL和一些難溶性蛋白。另外兩個孔分別加轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)的上清和沉淀蛋白，在28℃下放置5天觀察抑菌效果，結(jié)果如圖2所示(處理為At7所表達的蛋白對黃萎菌的抑制效果；CK為對照，顯示轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21的表達蛋白對黃萎菌不存在抑制作用)，表明At7原核表達產(chǎn)物At7對黃萎菌具有抑菌活性，尤其以沉淀蛋白的抑菌活性更高。為進一步鑒定轉(zhuǎn)化有pET-28a-At7的大腸桿菌BL2的抑菌活性，還用活菌進行了抑菌試驗，以轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21為對照，方法為與誘導(dǎo)蛋白相似，只是將上清和蛋白沉淀換為含有pET-28a-At7的大腸桿菌BL2和有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21，結(jié)果如圖3所示(At7-1和At7-2表示轉(zhuǎn)化有pET-28a-At7的大腸桿菌BL21，最初分別為接種的At7原核表達蛋白(交替凍融得到)，后由于凍融時部分菌存活而繁殖形成BL21菌落；CK1和CK2為對照)，與轉(zhuǎn)化有pET-28a空載體的大腸桿菌BL21對照相比，轉(zhuǎn)化有pET-28a-At7的大腸桿菌BL2對黃萎菌也具有顯著的抑菌活性。
實施例3檢測黃萎菌毒素對At7轉(zhuǎn)基因煙草陽性株的致萎反應(yīng)一、At7轉(zhuǎn)基因煙草的獲得1、At7煙草超表達載體的構(gòu)建將實施例1獲得的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因At7的cDNA序列用限制性內(nèi)切酶BglII和BstE II酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的含CaMV 35S啟動子的載體pCAMBIA1301(澳大利亞CAMBIA公司)連接，得到At7的超表達載體，命名為pCAMBIA1301-At7，其物理圖譜如圖3A所示。
2、At7轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及分子檢測將步驟1構(gòu)建的At7煙草超表達載體pCAMBIA1301-At7用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化煙草珊西煙，所用農(nóng)桿菌為GV3101，結(jié)果在轉(zhuǎn)化的葉段中有75.6％長出了愈傷組織、其中大部分分化出了綠色新芽(圖4)，移栽后最終成苗30株，轉(zhuǎn)基因陽性植株如圖5所示。對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株提取基因組DNA，用特異引物引物1和引物2進行PCR檢測，結(jié)果有23株檢測出了約600bp的目的基因。為檢測目的基因At7在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平，用RT-PCR的方法進行檢測，結(jié)果如圖6(泳道1-6表示不同的轉(zhuǎn)基因植株)所示，泳道1-3的目標(biāo)帶較亮，表明在所檢測的第5、6、7植株中At7具有較高的表達水平，而泳道4-6的目標(biāo)帶較暗，表明第8、9、13株At7的表達水平較低。
二、檢測黃萎菌毒素對At7轉(zhuǎn)基因煙草陽性株的致萎反應(yīng)對步驟一獲得的At7轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株用葉片針刺“接種”黃萎菌V991，每片葉子選四個不同位置，分別接種V991黃萎菌濾液的原液(位置1)、30倍稀釋液(位置2)、100倍稀釋液(位置3)和清水(位置4)，以野生型煙草葉片為對照，于接種后24、48和72h進行觀察，結(jié)果如圖7所示，At7轉(zhuǎn)化煙草后，黃萎菌V991毒素對葉片的致萎作用明顯降低，而對照則表現(xiàn)出明顯的枯斑癥狀，非轉(zhuǎn)基因煙草葉片在用V991黃萎菌濾液的原液、30倍稀釋液及100倍稀釋液處理后24h表現(xiàn)出明顯的枯斑癥狀，至72h整個葉片枯斑更加嚴(yán)重且葉片變黃；而對照只是在接種后48h時針刺部位才略顯枯斑，至72h在針刺部位顯出較小的干枯。
實施例4檢測At7轉(zhuǎn)基因擬南芥對黃萎菌毒素的抗性一、At7轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗生素篩選及分子檢測將實施例3構(gòu)建的At7超表達載體pCAMBIA1301-At7用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化擬南芥，所用農(nóng)桿菌為GV3101，將轉(zhuǎn)化后得到的T1代種子平鋪于含80μg/mL潮霉素的MS培養(yǎng)基上春化3天，然后放置在光照培養(yǎng)箱中生長7天，多數(shù)種子能萌發(fā)(圖8，箭頭所指為轉(zhuǎn)基因陽性植株的種子)，但轉(zhuǎn)基因陰性植株的根生長受阻，且子葉不能展開，而陽性轉(zhuǎn)基因植株葉色較深、平展，株高也較高，根粗且長(圖9所示，箭頭所指為轉(zhuǎn)基因陽性植株)。將陽性植株轉(zhuǎn)移到不含抗生素的MS培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長至4-5片真葉后移栽到土中，按株系收獲轉(zhuǎn)基因植株T2代的種子，結(jié)果共獲得41株T2代株系。再對經(jīng)抗生素篩選獲得的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株用PCR的方法進行分子檢測，提取陽性植株的基因組總DNA并以此為模板，在At7 cDNA特異引物引物1和引物2的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖10所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道5、6為陽性轉(zhuǎn)基因株系，泳道12、13為假陽性轉(zhuǎn)基因株系，泳道35為陽性對照，泳道14為陰性對照)，可擴增出約600bp目的片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，而假陽性植株未擴增出相應(yīng)大小的片段。
二、檢測At7轉(zhuǎn)基因擬南芥對黃萎菌毒素的抗性用濃度為0.22μg/mL的黃萎菌V991菌液處理步驟一獲得的陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥第35株系的T2代幼苗，觀察幼苗的生長變化，結(jié)果如圖11所示(長箭頭所指為At7在轉(zhuǎn)基因陽性植株，短箭頭所指為非轉(zhuǎn)基因植株)，在所處理的培養(yǎng)皿中共有30株，其中有8株幼苗在處理后10min內(nèi)開始萎蔫，此后萎蔫程度逐漸加重，至2h達到最嚴(yán)重程度；另外的22株對黃萎菌毒素的處理不敏感，從開始至6h均未出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，即表型具有抗致萎性。統(tǒng)計抗致萎植株與萎蔫植株的比例，結(jié)果抗致萎植株與萎蔫植株的比例為22∶8，符合3∶1的顯性單基因遺傳規(guī)律，表明At7在轉(zhuǎn)基因陽性植株中可能為單拷貝整合。此外，在移栽擬南芥時，一個培養(yǎng)皿在試驗中偶然被雜菌污染，結(jié)果At7轉(zhuǎn)基因陽性植株對雜菌表現(xiàn)出較強的抵御能力，而非轉(zhuǎn)基因株則不具備抗性(圖12所示，圖中箭頭所指為At7在轉(zhuǎn)基因陽性植株)。
實施例5檢測At7轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎菌毒素的抗性一、At7轉(zhuǎn)基因棉花的獲得及檢測采用周光宇等根據(jù)DNA片段雜交理論設(shè)計的花粉管通道法(pollen-tube pathway)(Zhou G.Y.et al.，Introduction of exogenous DNA into cotton embryos，MethEnzymol，1983，101433-481)將實施例3構(gòu)建的At7超表達載體pCAMBIA1301-At7轉(zhuǎn)化棉花(棉花品種為2003-006)，具體方法為在棉花自花授粉后的20-24h，去除花冠，暴露雌蕊，平切子房頂部，以不露心室為度，將pCAMBIA1301-At7質(zhì)粒滴加在子房切面或淺插注射，每朵花注入5μL，對導(dǎo)入花朵掛牌標(biāo)記。在棉花吐絮后，按組合采收。下一代按組合種植。然后用以下方法對轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定1、抗病性鑒定將At7超表達載體pCAMBIA1301-At7轉(zhuǎn)化棉花后所收獲的轉(zhuǎn)基因植株的種子種在含有3.0×108個黃萎菌孢子的病土中，在病原菌的“高壓”下鑒定其抗病性。由于用于At7轉(zhuǎn)基因的棉花品種為感病品種，因此經(jīng)過高壓選擇后，多數(shù)棉苗發(fā)病死去，剩下的少數(shù)植株具有高的抗病性。結(jié)果當(dāng)棉苗生長至2片真葉時，只有15株棉苗沒有表現(xiàn)黃萎病癥狀，約占總數(shù)的0.4％，其余全部發(fā)病枯死(如圖13-圖16所示)。
2、抗卡那霉素鑒定待經(jīng)步驟1抗病性鑒定后存活的15株At7轉(zhuǎn)基因棉株長出2片真葉后，用濃度為1000ppm的卡那霉素溶液點滴于幼苗生長點，幾天后觀察幼苗新葉接觸卡那霉素溶液部位對卡那霉素的反應(yīng)，葉片沒有反應(yīng)者為卡那霉素抗性陽性植株，葉片顏色變?yōu)辄S色者為對卡那霉素反應(yīng)敏感的陰性植株。對初篩選的卡那霉素抗性陽性植株，再重復(fù)2次上述卡那霉素溶液點滴幼苗生長點的表型鑒定，最終得到11株具卡那霉素抗性的At7轉(zhuǎn)基因棉株。
3、PCR鑒定提取經(jīng)過上述兩步鑒定為陽性的11株At7轉(zhuǎn)基因棉株葉片的總DNA并以此為模板，在At7cDNA特異引物引物1和引物2的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖17所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道1-4為不同的轉(zhuǎn)基因植株)，可擴增出約600bp目的片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，而假陽性植株未擴增出相應(yīng)大小的片段。
二、檢測At7轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎菌毒素的抗性1、室內(nèi)病土鑒定從連續(xù)8年種植棉花的病田取土(該地塊棉花枯、黃萎病混生，缺苗率高達67％)，再接種人工培養(yǎng)的黃萎病V991，接種濃度為3.0×108個孢子，接種量為每克土30個孢子。然后將步驟一中獲得的At7超表達載體pCAMBIA1301-At7轉(zhuǎn)化棉花后所收獲的轉(zhuǎn)基因植株的種子按照100克種子種植1m2的播量種植。因為病原菌量很大，棉花出苗后大量染病死亡，發(fā)生的病害包括苗病、枯萎及黃萎病。以此高強度篩選得到抗病At7轉(zhuǎn)基因植株。
2、田間自然鑒定將經(jīng)步驟1室內(nèi)病土鑒定存活的At7轉(zhuǎn)基因抗病棉苗移栽到病圃，于7月中旬后每隔10天調(diào)查一次發(fā)病情況，最終得到抗病At7轉(zhuǎn)基因植株。
序列表<160>2<210>1<211>120<212>PRT<213>棉屬海島棉(Gossypium barbadense)<400>1Met Ala Ser Ser Met Ser Leu Lys Leu Ala Cys Val Ala Val Leu Cys1 5 10 15Met Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Gln Gly Ala Val Thr Cys Gly Gln20 25 30Val Thr Ser Ser Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr Leu Thr Gly Asn Gly35 40 45Ala Gly Gly Val Pro Pro Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys Ser Leu Asn50 55 60Ser Ala Ala Gln Thr Thr Pro Asp Arg Gln Ala Ala Cys Lys Cys Ile65 70 75 80Lys Ser Ala Ala Ala Gly Ile Ser Gly Ile Asn Tyr Gly Ile Ala Ser85 90 95Gly Pro Pro Gly Lys Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Ser Pro100 105 110Ser Thr Asp Cys Asn Ser Val Lys115 120<210>2<211>592
<212>DNA<213>棉屬海島棉(Gossypium barbadense)<400>2ttgggaagaa gcagcaatag tactactact ccaagcaggc attttcctta caagtttgtt 60ctccttgtga ttaatcgata tggctagctc aatgtccctt aagcttgcat gtgtggcggt120gttgtgcatg gtggtgggtg cacccctggc tcaaggggcc gtaacctgtg gtcaagtcac180aagctccctc gcaccctgca ttggttactt gacagggaat ggtgctggtg gcgttccccc240aggttgctgc ggcggcataa aatctctcaa ctccgccgcc caaacaacac cagaccggca300agcagcttgc aaatgcatca aaagtgcggc cgccggcatt tctggcatca actatggtat360tgcaagcgga cccccaggca agtgcggtgt caacatccct tacaagatca gccctagcac420tgactgcaac agcgtcaagt gaagttttgg catggaaagt tcaccagcta gtggaagcca480aaataacgat agctacagaa taaatatgga tgttaaaatt ccagagttgt gggttgtgta540ctatgccgct ttatgcgact acgtaatatt aactttatct acaaattaat aa59權(quán)利要求
1.一種海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有磷脂轉(zhuǎn)運作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6.一種培育抗黃萎病植物的方法，是將權(quán)利要求3所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗黃萎病的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因通過含有所述海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因的植物表達載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或pBI121。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達載體為pCAMBIA1301-At7。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主為棉花、煙草、擬南芥、水稻、小麥、苜蓿、大豆、番茄、茄子或西瓜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一種海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因，與該基因在培育抗黃萎病植物中的應(yīng)用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有磷脂轉(zhuǎn)運作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因的原核表達產(chǎn)物對棉花黃萎菌具有較強的抑菌活性。轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥及棉花對黃萎菌毒素均表現(xiàn)出較強的耐受能力。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)⒃诳裹S萎病植物(特別是棉花)的遺傳育種中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C12N15/29GK1740190SQ20051009827
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者齊俊生, 李懷方, 范在豐, 王 琦 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)