專利名稱：以油體蛋白作載體在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)重組水蛭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以油體蛋白作載體在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)重組水蛭素的方法。將人工合成的、按照植物所偏愛的密碼子優(yōu)化后的水蛭素基因及蛋白酶切割識別信號與油體蛋白基因進(jìn)行體外拼接，然后通過轉(zhuǎn)基因途徑以融合蛋白的方式在大豆中表達(dá)并定位在大豆油體的表面，從大豆種子中分離出油體及融合改造后的油體蛋白并經(jīng)蛋白酶進(jìn)行特異性切割可釋放出有活性的重組水蛭素蛋白。
水蛭素是吸血水蛭(俗稱螞蟥)唾液或身體中所含有的一類抗凝血多肽，分子量比較小，約為7000Da，屬于酸性蛋白(等電點(diǎn)pI＝3.9)[1]，它們可與凝血酶蛋白分子形成1∶1非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物并成為迄今為止已知的最有效的凝血酶蛋白抑制劑。上個(gè)世紀(jì)80年代，三種天然水蛭素(HV1、HV2和HV3)的氨基酸序列相繼得到報(bào)道[2，3，4]，這三個(gè)水蛭素各含有65-66個(gè)氨基酸殘基，相互之間具有85％以上的序列同源性。在這些水蛭素蛋白分子N端的保守區(qū)內(nèi)(1-47殘基之間)含有6個(gè)半胱氨酸殘基，在這些半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵使N端成為一個(gè)緊湊的、非極性的結(jié)構(gòu)域，它可與凝血酶的催化位點(diǎn)結(jié)合；水蛭素的C端(49-66殘基之間)可通過大量的靜電和親水作用與凝血酶的血纖蛋白原識別位點(diǎn)結(jié)合，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共同作用可有效地抑制凝血酶所有主要的生物學(xué)活性[5]。
水蛭素具有重大的藥用價(jià)值，這不僅是因?yàn)樗軌蚍浅Ｌ禺愋缘刈饔糜谀?，而且它還具有許多特性使它比現(xiàn)在使用許多抗凝血因子如肝素更為優(yōu)越。每個(gè)水蛭頭部大約含有20ug水蛭素[6]，因此，從水蛭中提取天然的水蛭素蛋白的量很有限，完全不能夠滿足人們的需求。具有生物活性的重組水蛭素異構(gòu)體蛋白基因已經(jīng)被克隆并在大腸桿菌[3，4]、酵母[7，8]、多角體病毒侵染的昆蟲細(xì)胞[9]和鏈霉菌(Streptomyces lividans)成功表達(dá)[10]，這些表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組水蛭素從幾毫克到幾十毫克不等，純化程度可達(dá)99％以上。
油體是一些植物種子中儲存三酰甘油(triacylglycerols，TAG)的亞細(xì)胞器官，呈球形，在其內(nèi)部儲藏有液態(tài)的TAG，外部則是由磷脂單分子層(PL)及嵌入其內(nèi)的油體蛋白(oleosin)組成的半單位膜所包裹。在所有產(chǎn)油種子內(nèi)如大豆、油菜和花生都含有大量油體及油體蛋白[11]。
油體蛋白分子結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特，中部是一個(gè)疏水的氨基酸長鏈，比已知的其它蛋白都要長，具有很強(qiáng)的疏水性，因此這部分氨基酸序列可穩(wěn)固地嵌入到油體脂質(zhì)膜內(nèi)。疏水的核心骨架兩側(cè)是親水的N端和C端，通常游離在油體脂質(zhì)膜的外側(cè)，這些親水部分在不同植物中氨基酸序列和長度上是不同的。
油體蛋白獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和生化特性使其適于應(yīng)用在重組外源蛋白的生產(chǎn)中，首先，油體蛋白在產(chǎn)油種子內(nèi)含量很高，例如在大豆中，估計(jì)油體蛋白約占到種子總蛋白的2％-10％左右，該含量與同一植物種子儲藏蛋白的積累水平相當(dāng)[12]。其次，當(dāng)種子研磨后用緩沖液提取時(shí)，油體及油體蛋白會浮在水面上，經(jīng)過反復(fù)離心洗滌很容易洗去其它蛋白成份而將油體蛋白濃縮到一個(gè)很高的地步[12，13]，油體蛋白通過這種方式很容易與種子儲藏蛋白和其它蛋白成份分離開來，如果將其它外源蛋白與油體蛋白的N端或C端融合表達(dá)時(shí)可能遵守同樣的分離原則，這就為重組外源蛋白的下游加工帶來極大的方便。
盡管大豆是一種雙子葉植物，但正如本領(lǐng)域?qū)＜宜熘哪菢?，大豆的遺傳轉(zhuǎn)化是非常困難的，國內(nèi)外迄今只有抗除草劑等極少數(shù)種類轉(zhuǎn)基因大豆獲得成功，因此，在本發(fā)明之前，還沒有人通過轉(zhuǎn)基因的方式，利用大豆油體生產(chǎn)其他外源重組蛋白、尤其是水蛭素蛋白，也沒有人根據(jù)大豆所偏愛的密碼子對水蛭素基因進(jìn)行修飾和改造，以便最大程度地提高該外源蛋白在植物中的表達(dá)效率。
本發(fā)明利用油體蛋白的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、在種子內(nèi)的高表達(dá)特性以及易于分離和純化的特點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)出具有活性的重組水蛭素蛋白。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及對水蛭素1蛋白基因(HV1)按照大豆所偏愛的密碼子進(jìn)行修飾和改造，以便改造后的基因能夠更高效地在大豆種子中進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明提供了以油體蛋白作載體、以融合蛋白的方式生產(chǎn)重組水蛭素的方法，按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，水蛭素基因與油體蛋白基因的N端或C端編碼序列進(jìn)行體外拼接，但這種拼接并不會改變彼此的閱讀框架，也不會影響融合后的油體蛋白在大豆油體上的定位。通過抽提大豆油體，很容易將重組水蛭素與其他大豆種子蛋白分離開來，由此可簡化提純過程和大大降低生產(chǎn)成本。
按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及自融合蛋白狀態(tài)下釋放出有活性重組水蛭素的的方法，因?yàn)樵谟腕w蛋白與水蛭素編碼序列之間含有蛋白酶特異性切割識別信號，經(jīng)蛋白酶消化處理，有活性的重組外源蛋白被釋放出來。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，這種識別信號能夠被腸肽酶或Xa因子所識別，在從大豆種子中分離出大豆油體及油體蛋白(融合蛋白)后，利用腸肽酶或Xa因子處理該融合蛋白便可以將重組水蛭素釋放出來，成為有活性的蛋白多肽。
對本發(fā)明所使用的方法和其它相關(guān)事項(xiàng)極為重要的是一些質(zhì)粒載體或DNA片段的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)基因大豆以及有活性重組水蛭素的過程中起重要作用。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，用于轉(zhuǎn)化大豆的質(zhì)粒載體或DNA片段由編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別信號-水蛭素基因的DNA序列和操縱該DNA序列在大豆中表達(dá)的一個(gè)植物啟動(dòng)子組成。在某些具體實(shí)施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個(gè)選擇或標(biāo)記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因大豆的篩選。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所使用的植物啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子或油體蛋白基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的質(zhì)粒載體或DNA片段可用于基因槍法轉(zhuǎn)化大豆。
本發(fā)明也提供了獲得轉(zhuǎn)基因大豆細(xì)胞的方法，它包括以下步驟1.水蛭素基因的密碼子優(yōu)化；2.構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別信號-水蛭素的融合蛋白基因，而且該基因被置于一個(gè)植物啟動(dòng)子的操縱之下；3.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，還包括從轉(zhuǎn)化的大豆細(xì)胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因大豆的方法。
本發(fā)明提供了大豆的各種遺傳轉(zhuǎn)化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實(shí)施方案中僅利用了特定的轉(zhuǎn)化方法，但顯而易見的是，本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘钠渌参镛D(zhuǎn)化方法也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些方法包括微管注射、PEG融合和電融合法。按照某些優(yōu)先實(shí)施方案，使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，特別指Ti質(zhì)粒參與的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實(shí)施方案中，還可以使用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞或植株。
為了詳細(xì)描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實(shí)施方案，并以相應(yīng)的繪圖作參考

圖1細(xì)菌質(zhì)粒載體pGEMHV1的構(gòu)建過程。
圖2大豆油體蛋白基因的克隆及細(xì)菌質(zhì)粒載體pGEMO的構(gòu)建過程。
圖3植物表達(dá)載體pBI0H的構(gòu)建過程。其中GUS代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；融合蛋白基因代表大豆油體蛋白基因-腸肽酶切割識別信號-水蛭素1拼接完成后所形成的融合蛋白基因。
圖4質(zhì)粒pBIOH的T-DNA中所含的2個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控表達(dá)序列。其中Nos-Pro代表胭脂堿合成酶啟動(dòng)子；npt-II代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Nos-Ter代表胭脂堿合成酶終止子；35S Pro代表花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；RB代表DNA右邊界序列；LB代表DNA左邊界序列。
圖5PCR檢測油體蛋白-水蛭素融合蛋白基因在不同轉(zhuǎn)基因大豆株系中的整合情況。其中1為λDNA/EcoRI+HindIII Marker，2為陽性對照擴(kuò)增結(jié)果，以pBIOH質(zhì)粒DNA為模板，3為以非轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板的陰性對照擴(kuò)增產(chǎn)物，4-8為不同轉(zhuǎn)基因大豆株系的擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖6不同株系轉(zhuǎn)基因大豆葉片中油體蛋白-水蛭素融合蛋白基因mRNA的Northern雜交結(jié)果。1為非轉(zhuǎn)基因大豆，2-6為轉(zhuǎn)基因大豆植株。
圖7經(jīng)大豆油體抽提、腸肽酶切割和硫酸銨沉淀后純化出的重組HV1的SDS-PAGE分析。其中1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(Amersham Biosciences)；2為非轉(zhuǎn)基因大豆種子總可溶性蛋白提取物；3為轉(zhuǎn)基因大豆種子總可溶性蛋白提取物；4為經(jīng)大豆種子油體抽提、腸肽酶切割和硫酸銨沉淀后獲得的部分純化的重組HV1。
圖8通過凝血酶抑制顯色定量分析檢測大豆重組水蛭素的活性。其中1為工作緩沖液中加入2ul空白緩沖液(陰性對照)；2為工作緩沖液中加入2ul大豆重組水蛭素；3為工作緩沖液中加入了2ul天然水蛭素(陽性對照)；4為工作緩沖液中加入了2ul腸肽酶(陰性對照)。
本發(fā)明包括以下幾個(gè)組成部分1.按照植物所偏愛的密碼子，對水蛭素基因進(jìn)行修飾和改造，改造后的基因在大豆中將更穩(wěn)定和更高效地表達(dá)；2利用DNA重組技木構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，它含有編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別信號-水蛭素基因的DNA序列和操縱該DNA序列在大豆中表達(dá)的一個(gè)植物啟動(dòng)子組成。3.對大豆進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使編碼上述融合蛋白的基因穩(wěn)定地整合入大豆染色體中并可遺傳給后代；4.從轉(zhuǎn)化的大豆細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株，而且該植株能夠穩(wěn)定、高效地產(chǎn)生油體蛋白與水蛭素所構(gòu)成的融合蛋白；5.重組水蛭素的分離和純化，其特征在于從所述的轉(zhuǎn)基因大豆成熟的種子中提取出油體、加入蛋白酶進(jìn)行消化以便水蛭素從油體中釋放出來，然后使用硫酸銨沉淀和冷凍干燥，最后獲得有活性的重組水蛭素蛋白。
1.水蛭素基因的修飾和改造盡管水蛭和大豆都屬于真核生物，但它們在基因密碼子偏好方面仍然存在著一定的差異，這種差異會導(dǎo)致外源基因在大豆細(xì)胞內(nèi)不夠穩(wěn)定，另外基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率都會受到一定的影響。
完整的水蛭素基因被人工合成，在合成基因的過程中，保留原來的氨基酸序列不變但密碼子改為大豆所偏愛的密碼子[14]。改造后的水蛭素基因在植物中將更穩(wěn)定和更高效地表達(dá)；2.大豆轉(zhuǎn)化方法有許多種方法可以將外源基因?qū)氲酱蠖怪?，其中將外源基因穩(wěn)定整合入大豆染色體基因組DNA的主要方法包括1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細(xì)胞和組織等。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用質(zhì)粒載體將特定的DNA片段整合入植物染色體基因組DNA。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的植物外植體。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法特別適用于雙子葉植物包括大豆的轉(zhuǎn)化。
正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉(zhuǎn)化方法，電激法是先將原生質(zhì)體置于放在一個(gè)強(qiáng)電場中，在電流作用下將外源DNA送入原生質(zhì)體內(nèi)。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細(xì)胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入植物細(xì)胞或組織中。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)先實(shí)施方案，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)被選用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有一段叫做轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的，它可以進(jìn)入大豆細(xì)胞中并最后整合入大豆的染色體中。轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分為兩步，首先是構(gòu)建一個(gè)可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，這個(gè)質(zhì)粒含有編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別信號-水蛭素基因的DNA序列和操縱該DNA序列在大豆中表達(dá)的一個(gè)植物啟動(dòng)子組成，該DNA序列的兩端含有T-DNA邊界序列，它負(fù)責(zé)目的基因在大豆基因組中的插入位點(diǎn)。通常另外一個(gè)選擇標(biāo)志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在大豆細(xì)胞中表達(dá)后可提供一個(gè)選擇標(biāo)記證實(shí)大豆或大豆細(xì)胞是否含有整合的T-DNA序列。載體構(gòu)建的第二步是將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。這可以通過三親交配的方式或DNA直接導(dǎo)入方式完成。為了T-DNA的轉(zhuǎn)移，所用的農(nóng)桿菌菌株中還要含有一套誘導(dǎo)基因，它們在T-DNA轉(zhuǎn)移到大豆細(xì)胞中起重要作用。
熟悉大豆遺傳轉(zhuǎn)化的人應(yīng)該知道轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌株可以有多種選擇，質(zhì)粒構(gòu)建也有多種方式，其目的都是為了更有利于大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。大豆的轉(zhuǎn)化最常用的是植物葉盤轉(zhuǎn)化法，在某些情況下，還需要加入一些輔助細(xì)胞。其他的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，繼而由原生質(zhì)體再生出大豆細(xì)胞及完整植株。
本發(fā)明不僅僅限于使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，還應(yīng)包括其它物理性的手段將外源基因直接導(dǎo)入大豆細(xì)胞或原生質(zhì)體的方法以及其它將外源基因?qū)氪蠖辜?xì)胞的方法。
3.基因表達(dá)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)化方法確定之后，一個(gè)組成型的、發(fā)育調(diào)節(jié)型的或組織特異型的表達(dá)啟動(dòng)子被選擇以便外源基因能夠在大豆中表達(dá)。
所有已知能操縱外源基因在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子都可以在應(yīng)用在本發(fā)明中。這些啟動(dòng)子可從植物或病毒中獲得，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(包括經(jīng)過拼接、加倍和突變改造后的35S啟動(dòng)子)；油體蛋白基因啟動(dòng)子；光誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)或逆境誘導(dǎo)基因如乙醇脫氫酶(Adhl)等，但不僅限于此。
用于大豆轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通常含有一個(gè)選擇標(biāo)志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。
下面以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法為例，描述一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于此。
實(shí)施例11.水蛭素基因(HV1)的人工合成迄今為止，尚沒有人正式報(bào)道自水蛭中克隆出編碼水蛭素1(HV1)基因的核苷酸序列，為此，我們只能根據(jù)業(yè)已公布的HV1的氨基酸序列[15]，在不改變該蛋白氨基酸序列的情況下，按照大豆所偏愛的密碼子[14]，人工設(shè)計(jì)和合成了水蛭素1的全基因序列(見序列表1和2)。為了便于今后質(zhì)粒載體的構(gòu)建、融合蛋白基因的拼接和表達(dá)及重組水蛭素的釋放，在人工合成水蛭素1基因編碼序列的同時(shí)，在該基因的5’端還同時(shí)合成和增加了腸肽酶切割識別位點(diǎn)(見序列表3和4)以及限制性酶切位點(diǎn)KpnI，在HV1基因的3’端中止密碼子后增加了限制性酶切位點(diǎn)SacI(上述基因拼接和合成工作由上海博亞生物技術(shù)公司代為完成)。
2.HV1基因的克隆上述人工合成的基因片段被直接插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點(diǎn)內(nèi)(Promega公司產(chǎn)品)，按照該公司提供的方法，通過藍(lán)白系統(tǒng)篩選，得到含有該基因的細(xì)菌克隆pGEMHV1(見圖1)，然后，通過核苷酸序列分析，確定HV1基因及腸肽酶切割識別信號是正確和完整的(DNA測序由上海博亞生物技術(shù)公司代為完成)。
3.大豆油體蛋白基因的克隆根據(jù)已公布的大豆油體蛋白基因序列(見GenBanK，U09118)，合成了一對特定的引物，其中上游引物(5’端引物)序列為5’-AATCTAGATCAACCATGACCACACAAGTAC-3’，它內(nèi)部含有XbaI切割位點(diǎn)，下游引物(3’端引物)為5’-TGCGGTACCGGTTGTTGCTGTCACTGTTGT-3’，它內(nèi)部含有KpnI切割位點(diǎn)。根據(jù)王關(guān)林等[16]人的方法，從大豆種子(品種為Century，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所邱麗鵑研究員提供)提取出其基因組DNA，以此DNA為模板，通過PCR的方法[大豆基因組DNA1ul(約含1ug)作為模版，5’端引物和3’端引物各1ul，10XPCR緩沖液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul約1.5U，加水至總體積30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)]。擴(kuò)增獲得一段長度約700bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。該產(chǎn)物被直接插入到到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點(diǎn)內(nèi)(Promega公司產(chǎn)品)，按照該公司提供的方法，通過藍(lán)白系統(tǒng)篩選，得到含有該基因的細(xì)菌克隆pGEMO(見圖2)，然后，通過核苷酸序列分析，確定的大豆油體蛋白基因是正確和完整的(見序列表5和6)(DNA測序由上海博亞生物技術(shù)公司代為完成)。
實(shí)施例21.油體蛋白-水蛭素融合蛋白植物表達(dá)載體pBIOH的構(gòu)建為了構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，在人工合成HV1基因時(shí)，在其5’端添加了限制性酶切位點(diǎn)KpnI和腸肽酶切割識別信號，在其3’端添加了限制性酶切位點(diǎn)SacI。在克隆大豆油體蛋白基因時(shí)，在其5’端添加了限制性酶切位點(diǎn)XbaI，在其3’端添加了限制性酶切位點(diǎn)KpnI。因此含有上述兩個(gè)基因的質(zhì)粒載體pGEMHV1和pGEMO分別用KpnI+SacI以及XbaI+KpnI雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離出兩個(gè)小片段的DNA，爾后這兩個(gè)基因片段被直接定向插入到質(zhì)粒pBI121的原GUS基因位點(diǎn)內(nèi)(經(jīng)XbaI和SacI雙酶切)，便構(gòu)建成了雙元植物表達(dá)載體pBIOH。
質(zhì)粒pBI121購自美國Clonetech公司，它的XbaI限制性酶切位點(diǎn)位于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和GUS基因起始密碼之間，而SacI則位于GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質(zhì)粒pBI121是因?yàn)橛肵baI和SacI雙酶切后可將GUS基因刪除，而隨后可插入另外一個(gè)新的外源蛋白基因，新基因?qū)⒛軌蛟谥参锛?xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。質(zhì)粒pBI121還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(nptII)，它編碼的酶可為植物細(xì)胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細(xì)胞和組織與未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織區(qū)分開來。nptII基因有自己的啟動(dòng)子和多聚腺酸信號序列，它們均源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
質(zhì)粒pBIOH含有1)新霉素合成酶基因II(nptII)，它提供給植物細(xì)胞卡那霉素抗性；2)大豆油體蛋白基因-腸肽酶切割識別信號-水蛭素1基因(融合蛋白基因)及操縱該基因的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將nptII基因和上述融合蛋白基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)并整合到大豆的染色體中。pBIOH的結(jié)構(gòu)如圖3和圖4所示。
2.將表達(dá)載體pBIOH導(dǎo)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)
按照Clonetech公司所提供的方法，含有融合蛋白基因的質(zhì)粒pBIOH被通過三親交配的方式轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用，它是改造后的農(nóng)桿菌菌株，含有完整Vir基因，但T-DNA已經(jīng)被刪除。Vir基因可反式調(diào)節(jié)T-DNA自質(zhì)粒pBIOH向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
農(nóng)桿菌在含有25mg/L鏈霉素的50ml YEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl 5克，加蒸餾水至1升，pH7.0)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達(dá)到0.4-0.7時(shí)，4000g離心收集細(xì)菌細(xì)胞，將農(nóng)桿菌細(xì)胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養(yǎng)基中待用。含有表達(dá)載體pBIOH的DH5α(購自美國GIBCO公司)和含有輔助質(zhì)粒pRK2013(購自美國Clonetech公司)的HB101(購自美國Clonetech公司)分別接種在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達(dá)到0.4-0.7時(shí)，4000g離心收集細(xì)菌細(xì)胞，然后將細(xì)胞分別懸浮在1ml不含任何抗生素的LB培養(yǎng)基中待用。取上述三種細(xì)胞懸浮液各200ul，置于同一1.5ml離心管中，28℃靜置培養(yǎng)過夜，取該培養(yǎng)物5-10ul，均勻涂抹在YEP固體培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基中同時(shí)含有25mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培養(yǎng)2天后，含有pBIOH質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落開始產(chǎn)生。
用堿裂解法從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶酶切可檢測pBIOH質(zhì)粒DNA是否存在。
實(shí)施例31.大豆的遺傳轉(zhuǎn)化大豆(Glycine max L.)栽培品種中豆28號購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。按照Horsch等人的方法[17]，利用葉盤法轉(zhuǎn)化大豆。含有表達(dá)載體pBIOH的農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種在50ml YEP中，28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘，收集菌體，然后重新懸浮在液體的MS培養(yǎng)基中至OD600nm＝0.4，用手術(shù)刀片將發(fā)芽5-6天后大豆無菌子葉自相連處切開，隨即浸入稀釋后的農(nóng)桿菌液中30分鐘，然后取出，用濾紙吸干，葉面朝上置于MS固體培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)4天。然后將葉片移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上[MS基礎(chǔ)成分中添加植物激素(Sigma公司)6-BA2mg/L和IBA0.2mg/L，并含有50ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素]培養(yǎng)，給予25℃和16小時(shí)光照。以后每隔2個(gè)星期更換一次選擇性培養(yǎng)基直到葉柄傷口處長出愈傷并分化出幼苗。當(dāng)幼苗出現(xiàn)并長到足夠大時(shí)，將幼苗切下來(通常在共培養(yǎng)后4-8個(gè)星期)，移到生根培養(yǎng)基上(MS含有0.2mg/mlIBA和50ug/ml卡那霉素)，當(dāng)根長出后，幼苗被移到無菌的營養(yǎng)土中生長并輔之以適當(dāng)?shù)臏囟群凸庹諚l件。
2.PCR檢測融合蛋白基因在大豆中的整合情況大豆基因組DNA的提取方法基本依據(jù)Chee的方法[18]。取0.5g大豆轉(zhuǎn)基因植株新鮮葉片，放入研缽中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml離心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/Lβ-巰基乙醇，10g/L CTAB)，劇烈振蕩1分鐘，使之充分混勻。在60℃水浴中溫浴90分鐘，期間每30分鐘振蕩一次。從水浴中取出離心管，室溫下放置4-5分鐘，使之冷卻，然后加入4.5ml氯仿，輕輕搖動(dòng)，使之充分混勻。室溫下5000g離心10分鐘。收集上清液于另一20ml離心管中，加入4.5ml氯仿，重復(fù)上述步驟。收集上清液，加入10ml冰冷的異丙醇，輕搖10-15分鐘，5000g離心5分鐘，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA，將DNA濃度調(diào)至1ug/ul。
取上述大豆基因組DNA1ul(約含1ug)作為模版，加入大豆油體蛋白基因5’端引物和水蛭素基因3’端引物(見實(shí)施例1)各1ul，10XPCR緩沖液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul約1.5U，加水至總體積30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul擴(kuò)增樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖5所示，陰性對照植物中(泳道3)沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉(zhuǎn)基因大豆植株中則可擴(kuò)增出1個(gè)約900bp的特異性條帶(泳道4-8)，與預(yù)期的結(jié)果相一致，該結(jié)果表明大豆油體蛋白-腸肽酶切割識別信號-水蛭素1融合蛋白基因已整合進(jìn)入大豆基因組DNA中。
3.轉(zhuǎn)基因大豆的RNA分析利用地高辛標(biāo)記的水蛭素基因DNA片段做探針(標(biāo)記方法見Roche公司試劑盒)，對pBIOH植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的部分卡那霉素抗性大豆植株RNA進(jìn)行了雜交分析。
轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片總RNA被提取，方法見參考文獻(xiàn)[19]。大約1.0g葉片在液氮中用研缽磨成粉末，加入10ml RNA提取緩沖液(0.2M Tris-HCl，pH6.8；0.2M NaCl；20mM EDTA；2％SDS)，隨即加入10ml飽和酚緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA飽和)進(jìn)行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g離心，收集上層水相，加入0.3M醋酸鉀(pH5.2)緩沖液和2.5倍體積的無水乙醇，10000g離心收集沉淀，風(fēng)干后，沉淀重新懸浮在2ml的水中，隨后加入2ml 6M的醋酸銨緩沖液和10ml無水乙醇，10000g離心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新懸浮在0.4ml水中，RAN濃度可通過測定260nm的吸光值進(jìn)行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25單位。
取10ug RNA樣品，約5ul，與2倍體積RNA樣品緩沖液(10ml去離子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5X MOPS)混合后，65℃加熱5分鐘，冷卻后，加入3ulRNA加樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚藍(lán))，然后經(jīng)過1％的RNA瓊脂糖凝膠電泳。核酸通過毛吸管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond N+)上，所用的緩沖液為20XSSC，pH7.2(3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉)，轉(zhuǎn)移時(shí)間為16小時(shí)。核酸通過紫外線照射后被交連在尼龍膜上，將膜置于預(yù)雜交液中[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，100ug/ml鮭魚精DNA]，68℃預(yù)雜交3小時(shí)，然后更換新的雜交液[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％的封閉劑(BM試劑盒中提供)]，5ml雜交液中加入變性的地高辛標(biāo)記的DNA探針60ng進(jìn)行雜交，探針長225bp，它是來自質(zhì)粒pGEMHV1的KpnI和SacI的雙酶切小片段，包括了水蛭素基因的全部編碼序列。在雜交液中68℃雜交24小時(shí)后，取出雜交膜，于200ml 2XSSC，0.1％SDS緩沖液中室溫下洗膜2次，然后于100ml0.1XSSC，0.1％SDS緩沖液中68℃洗膜2次。顯色反應(yīng)基本依據(jù)試劑盒中提供的方法(Roche)，尼龍膜先于洗脫緩沖液
中平衡5分鐘，然后用50ml 1X封閉緩沖液封閉30分鐘，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體至濃度為75mU/ml，室溫下反應(yīng)30分鐘，用洗脫緩沖液2次，每次15分鐘。將膜移置20ml顯色緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)中平衡5分鐘，更換新的底物緩沖液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml顯色緩沖液)，遮光條件下顯色16小時(shí)，待所期望的條帶出現(xiàn)后，用水終止反應(yīng)。
經(jīng)質(zhì)粒pBIOH轉(zhuǎn)化后獲得的轉(zhuǎn)基因植株和陰性對照植株的RNA雜交結(jié)果如圖示6。不同轉(zhuǎn)基因植株的RNA雜交信號有差異，這可能是由于基因的插入位點(diǎn)和基因的拷貝數(shù)不同引起的。和標(biāo)準(zhǔn)RNA分子量相比，轉(zhuǎn)錄的mRNA約有900bp長，與預(yù)先估計(jì)的相一致。陰性對照植物的RNA泳道中沒有觀察到雜交信號。mRNA的穩(wěn)定、大量表達(dá)并能夠與編碼水蛭素1蛋白的DNA核酸探針特異性雜交的結(jié)果表明，mRNA的穩(wěn)定性不會成為水蛭素1基因在大豆中表達(dá)的一個(gè)問題。
實(shí)施例41.大豆油體的分離提取取轉(zhuǎn)基因大豆種子1g，在研缽中充分研磨，將研磨后的細(xì)粉全部轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，然后往離心管中加入0.5M蔗糖溶液(用0.1M Tris-HCl含10mMKCl，1mM MgCl2，pH7.5配制)30ml，在室溫下充分振蕩后，5000rpm離心15分鐘。勻漿液離心后分成三部分，液面上層主要是油體和與之相聯(lián)的蛋白，液體部分含有可溶性的種子蛋白，沉淀是不溶性的蛋白和一些顆粒狀物質(zhì)。收集上部含油體的部分，為了除去油體表面殘留的松散結(jié)合的可溶性蛋白，油體被重新懸浮在較低密度的蔗糖提取液中(0.3M蔗糖中含有0.5M NaCl)，離心后，洗滌后的油體重新漂浮在抽提液的表面，這一過程可反復(fù)進(jìn)行2-3次，直到油體部分所含的蛋白完全是融合蛋白，油體最后懸浮在5ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)含2.5mM CaCl2的緩沖液中。
2.重組水蛭素的釋放往上述緩沖液中加入20ng腸肽酶(購自New England Biolabs公司)進(jìn)行融合蛋白的消化。在室溫下消化過夜，離心除去油體和與之相聯(lián)的蛋白，收集含有重組水蛭素的液體部分，加入3g固體硫酸銨至飽和度約80％，室溫下攪拌1小時(shí)，10000rpm離心15分鐘，收集沉淀，加入1ml 10mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液進(jìn)行懸浮，然后裝入透析袋中在4℃下透析過夜，透析緩沖液為2升10mMTris-HCl(pH7.5)。透析完成后從透析袋中吸出透析物，經(jīng)冷凍干燥后，重新溶解在1ml10mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中，蛋白含量約為300ug/ml左右。然后從中取出10ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后檢測種子總蛋白提取物和純化后的蛋白提取物，通過比較發(fā)現(xiàn)，95％以上的雜蛋白成份被除去(見圖7)。
3.重組水蛭素活性的測定重組水蛭素活性的測定采用凝血酶抑制顯色定量分析法[20]，實(shí)驗(yàn)所用的凝血酶(Thrombin)購自Sigma公司，將其溶解于工作緩沖液中(50mM Tris-HCl，pH8.0，含100mM/L NaCl和5mM/L CaCl2)至終濃度為0.12-0.14u/ml待用。每200ul上述工作緩沖液中加入2ul上述純化后的重組水蛭素(濃度為1ug/ml)或?qū)φ站彌_液[陽性對照所使用的天然水蛭素購自Sigma公司，貨號H7380，溶于10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)至工作濃度為1ug/ml]，25℃下孵育10分鐘，然后加入1ul底物緩沖液[產(chǎn)色底物p-tosyl-gly-pro-arg-notroanilide購自Sigma公司，將其溶于蒸餾水中配制成50pM/L的底物緩沖液]，檢測2分鐘之內(nèi)405nm光吸收值的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)源自大豆的重組水蛭素可以抑制凝血酶的活性，使其活性降低至少達(dá)94％以上，其比活性比陽性對照還要高。加入2ul空白緩沖液的陰性對照(10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)中未表現(xiàn)出任何抑制活性，另外，加入2ul腸肽酶[溶于10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)，工作濃度為1ug/ml]的陰性對照中也未表現(xiàn)出任何活性(見圖8)。
參考文獻(xiàn)1.Stone S R and J Hofsteenage，Biochemistry，1986，254622-4628.
2.Harvey R P，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，831084-1088.
3.Rydel T J，et al.，Science，1990，249277-280.
4.Markwardt F，Thromb.Res.，1994，741-23.
5.Markwardt F，et al.，Haemostasis，1991，(Suppl 1)，21133-136.
6.Riechl-Bellon N，et al.，Biochemistry，1989，282941-2949.
7.Benatti L，et al.，Gene，1991，101255-260.
8.Bender E，et al.，Appl.Microbiol.，Biotech.，1990，34203-207.
9.Chang J，et al.，F(xiàn)EBS Letters，1983，164307-313.
10.Klocking H P，et al.，F(xiàn)olia Haematol.，1988，11575-82.
11.Jacks T J，et al.，JACOCS，1990，67353-361.
12.Qu R D and Huang A H C，J.Biol.Chem.，1990，2652238-2243.
13.Parmenter D L，et al.，InTransgenic plantsa production system for industrialand pharmaceutical protein，Owen M R L and Pen Jen(eds)，1996，JohnWiley&Sons Ltd，Chichester England，pp.261-280.
14.Stone S R and J M Maraganore，Meth.Enzymol.，1993，223312-336.
15.Chang J Y，F(xiàn)EBS Letters，1983，164307-313.
16.王關(guān)林和方宏筠，植物基因工程及原理，北京科學(xué)出版社，1998，598-599。
17.Horsch R B，et al.，Science，1985，2271229-1231.
18.Chee P P，Drong，R.F.and Slightom，J.L.，Plant Molecular Biology Manual，1991，C31-28.
19.Mason H，et al.，Plant Molecular Biology，1988，11845-856.
20.Parmenter D L，et al.，Plant Molecular Biology，1995，291167-1180.
本發(fā)明的進(jìn)一步描述只是一些特別的優(yōu)先實(shí)施方案，是按照專利申請要求以及為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進(jìn)一步的改進(jìn)和變化。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>以油體蛋白作載體在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)重組水蛭素的方法<160>6<210>1<211>225<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(226)<400>1ggt acc gat gat gat gat aag gtc gtc tac aca gat tgc aca gag tcc ggg cag aac 57Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn1 5 10 15ctc tgc ctc tgc gaa ggg tcc aac gtc tgc ggg cag ggg aac aag tgc atc ctc ggg 114Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly20 25 30 35tcc gat ggg gag aag aac cag tgc gtc aca ggg gag ggg aca cca aag cca cag tcc 171Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser40 45 50 55cac aac gat ggg gat ttc gag gag atc cca gag gag tac ctc cag tag gag ctc 225His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln ***60 65 70<210>2<211>72<212>PRT<213>人工序列<400>2Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser1 5 10 15Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly20 25 30
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr35 40 45Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu50 55 60Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln65 70<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(15)<400>3gat gat gat gat aagAsp Asp Asp Asp Lys<210>4<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>腸肽酶切割識別序列<400>4Asp Asp Asp Asp Lys<210>5<211>681<212>DNA<213>大豆(Glycine max L.)油體蛋白基因<220>
<221>CDS<222>(1)...(678)
<400>5atg acc aca caa gta cca cca cac agt gtc caa gtc cac aca aca aca aca cac cgc 57Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr Thr His Arg1 5 10 15tac gaa gct ggc gtc gtc ccc ccc gga gcc cgt ttc gaa acg agt tat gaa gca ggc 114Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu Thr Ser Tyr Glu Ala Gly20 25 30 35gtc aag gcg gcc tcc att tac cat tcc gag aga ggt cca acg act tcc cag gtc ctc 171Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu40 45 50 55gcc gtc ctc gcc ggc ctc ccg gtc ggt ggc atc ctg ctc ctc ctg gca gga ttg acc 228Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr60 65 70 75ctg gca gga acc ctc acc gga ctg gca gtt gcc acg ccg ctc ttc gtc ctc ttc agc 285Leu Ala Gly Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser80 85 90 95ccg gtg ctg gtt cca gcc acg gtc gcc atc ggc ctg gcc gtg gcc ggg ttc ctg acg 342Pro Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Thr100 105 110tcg ggg gcc ttc ggg ctc acg gcg ctg tct tcc ttc tcc tgg atc ctg aac tac atc 399Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp Ile Leu Asn Tyr Ile115 120 125 130cgg gag acc cag cca gcc tcg gag aac ctc gcc gcc gcc gcg aag cat cac ctc gcc 456Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala135 140 145 150gag gcg gcg gag tac gtg ggg cag aag acg aag gaa gtg ggg cag aag acc aag gag 513Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu155 160 165 170gtt ggg cag gat att cag agc aag gca cag gat aca agg gag gca gct gca agg gat 570Val Gly Gln Asp Ile Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp175 180 185 190gca agg gag gca gct gca agg gat gca agg gaa gct gct gca agg gat gca aag gtg 625Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys Val195 200 205gag gca agg gat gta aag aga aca aca gtg aca gca aca acc gca acc gca tga 681Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala *210 215 220 225<210>6<211>226<212>PRT<213>大豆(Glycine max L.)油體蛋白
<400>6Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr1 5 10 15Thr His Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu20 25 30Thr Ser Tyr Glu Ala Gly Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu35 40 45Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro50 55 60Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser Pro85 90 95Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe100 105 110Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp115 120 125Ile Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala130 135 140Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln145 150 155 160Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile165 170 175Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg180 185 190Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys195 200 205Val Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala210 215 220Thr Ala22權(quán)利要求
1.一種利用油體蛋白作載體在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)重組水蛭素的方法。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的油體蛋白在與水蛭素形成融合蛋白后，并不會影響該油體蛋白在大豆油體上的定位。
3.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的油體蛋白與水蛭素之間含有可以被其他蛋白酶切割的識別位點(diǎn)，如可以被腸肽酶或Xa因子切割的識別位點(diǎn)。
4.一個(gè)用于轉(zhuǎn)化大豆的質(zhì)粒載體包括一段結(jié)構(gòu)為編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-水蛭素的DNA序列或者結(jié)構(gòu)為編碼水蛭素-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-油體蛋白的DNA序列。一個(gè)與所說的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，例如35S啟動(dòng)子或大豆油體蛋白基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說的DNA序列可以在大豆中表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4中的質(zhì)粒載體，它含有一個(gè)選擇或標(biāo)記基因。
6.一段用于基因槍法轉(zhuǎn)化大豆的DNA序列包括一段結(jié)構(gòu)為編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-水蛭素的DNA序列或者結(jié)構(gòu)為編碼水蛭素-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-油體蛋白的DNA序列。一個(gè)與所說的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，例如35S啟動(dòng)子或大豆油體蛋白基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說的DNA序列可以在大豆中表達(dá)。
7.如權(quán)利要求6中的DNA序列，它含有一個(gè)選擇或標(biāo)記基因。
8.一種獲得轉(zhuǎn)基因大豆細(xì)胞的方法包括構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有一段結(jié)構(gòu)為編碼油體蛋白-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-水蛭素的DNA序列或者結(jié)構(gòu)為編碼水蛭素-蛋白酶切割識別位點(diǎn)-油體蛋白的DNA序列。一個(gè)與所說的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，例如35S啟動(dòng)子或大豆油體蛋白基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說的DNA序列可以在大豆中表達(dá)。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8中的方法，它包括從轉(zhuǎn)基因大豆細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因大豆植株。
10.如權(quán)利要求8中的方法，其中所說的大豆細(xì)胞是通過農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的，而該農(nóng)桿菌中含有Ti質(zhì)粒的雙元載體系統(tǒng)，其中所說的質(zhì)粒載體是一個(gè)整合性載體。
11.重組水蛭素的分離和純化，其特征在于從所述的轉(zhuǎn)基因大豆成熟的種子中提取出油體、加入蛋白酶進(jìn)行消化以便水蛭素從油體中釋放出來，然后使用硫酸銨沉淀和冷凍干燥，最后獲得有活性的重組水蛭素蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及以油體蛋白作載體在轉(zhuǎn)基因大豆中生產(chǎn)重組水蛭素的方法。將人工合成的、按照植物所偏愛的密碼子優(yōu)化后的水蛭素基因及蛋白酶切割識別信號與油體蛋白基因進(jìn)行體外拼接，然后通過轉(zhuǎn)基因途徑以融合蛋白的方式在大豆中表達(dá)并定位在大豆油體的表面，從大豆種子中分離出油體及融合改造后的油體蛋白并經(jīng)蛋白酶進(jìn)行特異性切割可釋放出有活性的重組水蛭素蛋白。
文檔編號C12P21/02GK1928096SQ20051009831
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者劉德虎, 徐妙云, 李剛強(qiáng), 魏昭榮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所