專利名稱：一個人源的Nanog基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于人的Nanog基因及其編碼蛋白與其在腫瘤的檢測及治療性藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Nanog是2003年剛發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子，它具有homeodomain結(jié)構(gòu)域，在胚胎干細胞的自我更新和多能性維持中起到十分重要的作用(Mitsui et al.，Cell，2003113，631-642)。Nanog基因僅在鼠和人的ES、EG和EC中表達，在分化細胞和正常組織中不表達，而且該基因在鼠和人中具有較高的同源性。Nanog基因在上述全能性細胞中起到自我更新的作用，并且實驗證實它對細胞的生長周期具有影響。
在多基因家族中，某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因。假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點突變等原因，使這些基因失去活性，成為沒有功能的基因。造成假基因的原因之一，可能是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后生成的RNA前體通過剪接失去內(nèi)含子形成mRNA，mRNA經(jīng)反復轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再整合到染色體DNA中，便成為假基因，因此假基因是沒有內(nèi)含子的，在這個過程中，可能同時會發(fā)生缺失，倒位或點突變等變化，從而使假基因不能表達。
人的Nanog基因具有11個假基因，它們分布在不同的染色體上。假基因1具有內(nèi)含子和外顯子，其它幾個假基因沒有內(nèi)含子，而且除了假基因8外別的假基因都具有內(nèi)部終止子。理論上認為假基因8不能稱為假基因而應(yīng)該稱之為逆轉(zhuǎn)錄基因，因為它具有完整的編碼框，而且具有Alu序列。但是迄今為止，還未發(fā)現(xiàn)假基因8的任何EST序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個人源的Nanog基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的Nanog基因，名稱為NANOGP8(簡稱NgP8)，來源于人屬人(Homosapiens)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由918個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至918位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第300至479位堿基編碼homeodomain結(jié)構(gòu)域。
所述Nanog基因NANOGP8編碼的蛋白(NANOGP8)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對腫瘤細胞的自我更新和生長周期具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由305個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第100至159位氨基酸殘基為homeodomain結(jié)構(gòu)域。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增NANOGP8中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供了一個人源的Nanog基因NANOGP8，實驗證明，該基因與細胞增殖關(guān)系密切，它的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的快速檢測及治療提供了一條新的途徑，將在腫瘤的檢測及其治療性藥物的制備中發(fā)揮重大作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為PCR檢測Nanog基因及其假基因8在不同細胞系中表達情況的結(jié)果圖2為PCR檢測Nanog基因及其假基因8在人正常組織和腫瘤組織中表達情況的結(jié)果圖3為NANOGP8與人Nanog基因的核苷酸序列比對結(jié)果圖4為Western blot檢測NANOGP8在OS732、HepG2中表達情況的結(jié)果圖5為分別轉(zhuǎn)染pQCXIN-NANOGP8和pQCXIN空載體的NIH3T3細胞的生長曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實施例1、人源Nanog基因NANOGP8全長序列的獲得根據(jù)已公開的Nanog基因的核苷酸序列(GenBank號AB093576)，設(shè)計兩對引物引物對1(引物1和引物2)可特異性擴增Nanog基因，擴增片段的大小為439bp；根據(jù)假基因8和Nanog基因具有較高的同源性而設(shè)計的引物對2(引物3和引物4)，可同時擴增出兩者的大小為292bp的片段，引物序列如下引物1(上游引物)5’-TAGAGACTCCAGGATTTTAACG-3’引物2(下游引物)5’-GTGGGTTGTTTGCCTTTGGGAC-3’；引物3(上游引物)5’-ATCCGACTGTAAAGAATCTTCAC-3’引物4(下游引物)5’-TCTATCATTGAGTACACACAGC-3’首先以正常的人成纖維細胞和不同人源腫瘤細胞的總RNA為模板，分別在引物對1和引物對2的引導下，進行RT-PCR擴增，以Actin基因為參照(上游引物5’-TCACCACCACGGCCGAGCG-3’和下游引物5’-TCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’)，20ulPCR反應(yīng)體系為模板2ul；上、下游引物各2ul；dNTP 2ul；rTaq酶緩沖液(試劑盒自帶)2ul；水11.9ul；rTaq酶(Takara公司)0.1ul；PCR反應(yīng)條件為先94℃5分鐘；然后94℃40秒，55℃40秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道1-8分別為以下述細胞的RT-PCR擴增產(chǎn)物正常的人成纖維細胞、OS732細胞、HepG2細胞、MCF-7細胞、THP-1細胞、Hela細胞、畸胎瘤PA-1和NTERA-2細胞)，表明439bp的Nanog基因片段只在畸胎瘤PA-1和NTERA細胞中表達，在其余的細胞中不表達，在腫瘤細胞OS732、HepG2、MCF-7、PA-1和NTERA-2中均檢測到了292bp的片段，綜合兩對引物的PCR擴增結(jié)果，推測在OS732、HepG2和MCF-7腫瘤細胞表達的是假基因8。
再利用上述兩對引物，在人正常皮膚組織和不同的人源腫瘤組織中用同樣方法進行PCR檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道1-11分別為以下述組織和腫瘤細胞的RT-PCR擴增產(chǎn)物人正常皮膚組織；人腎、乳腺、宮頸、膀胱、甲狀腺、食道、胃、結(jié)腸、肺來源的腫瘤組織；畸胎瘤PA-1細胞)，表明439bp的Nanog基因片段僅在畸胎瘤細胞PA-1中表達，在人正常皮膚組織和各種腫瘤組織中不表達，292bp的片段在上述各種腫瘤組織和畸胎瘤細胞PA-1都有表達，綜合兩對引物的PCR擴增結(jié)果，推測在人腎、乳腺、宮頸、膀胱、甲狀腺、食道、胃、結(jié)腸和肺來源的腫瘤組織中表達的是假基因8?；厥詹⒓兓瘡纳鲜瞿[瘤組織中擴增出的292bp的片段，將其克隆入T載體pGEM-T(Promega公司)中，進行測序，測序結(jié)果表明所表達的確實是與Nanog基因具有較高同源性的假基因8，與預期結(jié)果相符。
根據(jù)假基因8 292bp片段的序列設(shè)計引物，RT-PCR擴增其全長序列，引物序列如下引物5(上游引物)5’-ACCGAATTCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTC-3’引物6(下游引物)5’ATTGTCGACTCACACGTCTTCAGGTTGCATG-3’
以人膀胱腫瘤組織的總RNA為模板，在引物5和引物6的引導下，進行PCR擴增，50ul PCR反應(yīng)體系為模板5ul；上、下游引物各5ul；dNTP 5ul；ExTaq酶緩沖液5ul；水29.8ul；ExTaq酶(Takara公司)0.2ul；PCR反應(yīng)條件為先94℃5分鐘；然后94℃40秒，55℃40秒，72℃1分鐘30秒，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約918bp的目的片段，將該目的基因命名為NANOGP8(簡稱NgP8)，將其克隆到載體pGEM-T(Promega公司)中，篩選陽性克隆，將含有NANOGP8的重組質(zhì)粒載體命名為NANOGP8-pGEM-T，進行測序，測序結(jié)果表明NANOGP8具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由918個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至918位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第300至479位堿基編碼homeodomain結(jié)構(gòu)域。將NANOGP8與人Nanog基因進行核苷酸序列比對，序列比對結(jié)果如圖3所示，NANOGP8與人Nanog基因只有6個堿基的差別，兩者編碼的氨基酸殘基序列僅有一個氨基酸殘基的差別，相似性較高。
實施例2、用Nanog的抗體檢測NANOGP8在OS732、HepG2中的表達情況因為Nanog和NANOGP8只有一個氨基酸殘基的差別，故用Nanog的抗體檢測NANOGP8在OS732、HepG2中的表達情況，具體方法如下1、核蛋白的抽提1)將細胞用冷的PBS洗兩次，其中一次是用PBS+1mM Na3VO4+5mM NaF，另外一次是用低滲溶液(PBS+20mM Hepes+20mM NaF+1mM Na3VO4+1mM Na4P2O7+1mM EDTA+1mMEGTA+1mM DTT+0.5mM PMSF+1ug/mL leupeptin+1ug/mL Aprotunin+1ug/mL Pepstain)；2)將冷的低滲溶液+0.2％NP40(總共0.5mL)加到10cm培養(yǎng)皿中裂解細胞；3)將裂解的細胞收集到1.5mL離心管中，混勻，16000g離心20s，得到的上清為胞質(zhì)溶膠，沉淀為細胞核；4)用150ul的高鹽緩沖液(低滲溶液+420uM NaCl+20％甘油)重懸細胞核，緩慢搖動30min5)16000g、4℃離心20min，上清即為核蛋白。
2、表達蛋白的Western blot檢測1)將步驟1獲得的蛋白樣品跑10％SDS-PAGE，按膠的大小裁剪NC膜(購自AmershamBiosciences公司)一張，3mm Watmman濾紙四張。將膠和NC膜及濾紙在電轉(zhuǎn)液中浸泡10min；2)依次放上海綿墊片、兩層濾紙、膠、NC膜、兩層濾紙、海綿墊片，安裝完畢后在Amersham Biosciences電轉(zhuǎn)系統(tǒng)恒壓下100V轉(zhuǎn)膜50minutes；
3)將NC膜置封閉液中封閉12-24小時；4)將一抗(Nanog的抗體，購自R&D公司，貨號AF1997，以Actin的抗體為參照)用TBST以1∶1000稀釋，NC膜浸于其中輕搖1小時，再用TBST洗膜三次，每次10min；5)將堿磷酶標記的anti-mouse IgG(購自Sigma公司)用TBST以1∶20000稀釋，NC膜浸于其中輕搖1小時，再用TBST洗膜三次，每次10min；6)準備10mL堿磷酶顯色溶液，先后加入66μl NBT和33μl BCIP底物儲液并混勻；7)將NC膜在濾紙上輕輕吸干，轉(zhuǎn)移至顯色液中。當顯色合適后，將膜置于去離子水中終止反應(yīng)。
檢測結(jié)果如圖4所示(泳道1-4分別為正常的成纖維細胞(陰性對照)、HepG2、PA-1(陽性對照)、OS732)，表明檢測到的應(yīng)該是NANOGP8的全蛋白，證明NAMOGP8不是一個假基因，而是一個真基因。推測該基因可能與Nanog基因在細胞的自我更新中具有相似的作用，只是NANOGP8在腫瘤細胞中發(fā)揮作用，而Nanog基因在胚胎干細胞中發(fā)揮作用。
實施例3、NANOGP8的轉(zhuǎn)細胞實驗首先，將全長918bp的NANOGP8克隆入載體pQCXIN(Clontech公司)中，得到含NANOGP8全長基因的重組載體，命名為pQCXIN-NANOGP8，對其進行測序，測序結(jié)果表明插入的NANOGP8序列正確；然后將pQCXIN-NANOGP8轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，以轉(zhuǎn)染pQCXIN空載體的NIH3T3細胞為對照；最后通過流式細胞檢測儀檢測分別轉(zhuǎn)染pQCXIN-NANOGP8和pQCXIN空載體的NIH3T3細胞的細胞周期的差異，結(jié)果轉(zhuǎn)染NANOGP8后，NIH/3T3的S期比例明顯增加，從正常培養(yǎng)的30.49％±0.9增加到46.52％±1.8，再對結(jié)果數(shù)據(jù)進行t-檢驗分析，分析結(jié)果表明NANOGP和pQCXIN空載體轉(zhuǎn)染組間有顯著差異，P小于0.05，表明NANOGP對細胞的生長周期具有調(diào)控作用。繪制兩種轉(zhuǎn)染細胞的生長曲線，檢測S期的增加對細胞生長是否有影響，結(jié)果如圖5所示，NANOGP和pQCXIN空載體轉(zhuǎn)染組間有顯著差異，P小于0.05，轉(zhuǎn)NANOGP的細胞數(shù)量較pQCXIN空載體轉(zhuǎn)染組明顯提高，表明S期的增加對細胞生長是有顯著影響的。
序列表<160>2<210>1<211>918<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120tcttctgctg agatgcctca cacagagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240gagaatagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ctactcttcc 540taccaccagg ggtgcctggt gaacccgact gggaaccttc caatgtggag caaccagacc 600tggaacaatt caacctggag caaccagacc cagaacatcc agtcctggag caaccactcc 660tggaacactc agacctggtg cacccaatcc tggaacaatc aggcctggaa cagtcccttc 720tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcact tccagccaaa ttctcctgcc 780agtgacttgg aggctgcctt ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc 840actaggtatt ttagtactcc acaaaccatg gatttattcc taaactactc catgaacatg 900caacctgaag acgtgtga 918<210>2<211>305<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)
<400>2Met Ser Val Asp Pro Ala Cys Pro Gln Ser Leu Pro Cys Phe Glu Ala1 5 10 15Ser Asp Cys Lys Glu Ser Ser Pro Met Pro Val Ile Cys Gly Pro Glu20 25 30Glu Asn Tyr Pro Ser Leu Gln Met Ser Ser Ala Glu Met Pro His Thr35 40 45Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp50 55 60Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gly Lys Gln Pro Thr Ser Ala65 70 75 80Glu Asn Ser Val Ala Lys Lys Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln85 90 95Lys Thr Arg Thr Val Phe Ser Ser Thr Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp100 105 110Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu115 120 125Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln130 135 140Asn Gln Arg Mer Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys145 150 155 160Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser165 170 175Leu Tyr Ser Ser Tyr His Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn180 185 190Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn195 200 205Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln210 215 220Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe225 230 235 240Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met His Phe Gln Pro
245 250 255Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu260 265 270Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln275 280 285Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp290 295 300Val30權(quán)利要求
1.人源Nanog基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源Nanog基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的人源Nanog基因的編碼蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對腫瘤細胞的自我更新和生長周期具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人源Nanog基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
6.權(quán)利要求1所述的人源Nanog基因在體外進行細胞增殖及腫瘤檢測中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的人源Nanog基因在制備腫瘤治療性藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3所述的人源Nanog基因的編碼蛋白在腫瘤檢測中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3所述的人源Nanog基因的編碼蛋白在制備腫瘤治療性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個人源的Nanog基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個人源的Nanog基因及其編碼蛋白與其在腫瘤的檢測、治療中的應(yīng)用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明為腫瘤的快速檢測及治療提供了一條新的途徑，將在腫瘤的檢測及其治療性藥物的制備中發(fā)揮重大作用。
文檔編號C12N15/63GK1763195SQ20051009845
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者張經(jīng)余, 王霞, 戴建武 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所