專利名稱：表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)損傷治療的能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)是人體的主要控制系統(tǒng)，可以視為人體活動(dòng)的指揮系統(tǒng)，司令部。神經(jīng)系統(tǒng)接受外界和體內(nèi)的各種信號(hào)，在對(duì)信號(hào)進(jìn)行分析，篩選，甄別后，根據(jù)信號(hào)的不同性質(zhì)，產(chǎn)生不同的生物電或生物化學(xué)信號(hào)，作用于相應(yīng)的組織、器官，并表現(xiàn)出形式各異的應(yīng)答，最終保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，新陳代謝的恒定，生命力的活躍。
神經(jīng)系統(tǒng)的主要功能細(xì)胞是神經(jīng)元，各種信號(hào)的傳遞都是有它完成，因此，神經(jīng)元的損傷必然造成機(jī)體功能的嚴(yán)重受損。許多因素都可以引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷，如外傷、缺血、缺氧、病原微生物感染、藥物、酒精及退行性病變等。由于神經(jīng)細(xì)胞的增生速度極為緩慢，因此一旦損傷其恢復(fù)速度極慢，在老齡患者或某些病變中，神經(jīng)細(xì)胞的損傷甚至是不可逆轉(zhuǎn)的。
目前，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療主要以對(duì)癥治療為主，如降低顱壓，抗感染，高壓氧倉(cāng)治療等。目前也有一些神經(jīng)細(xì)胞再生類物質(zhì)用于臨床，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，但由于血腦屏障的存在，外周給藥不能到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，故藥效有限，若采取腦內(nèi)直接給藥，如脊髓內(nèi)注射，則增加了治療風(fēng)險(xiǎn)，因此并未廣泛開展。
目前已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有明顯保護(hù)有促進(jìn)其再生的小分子肽類藥物，由于其分子量小，因此它們可以借助物理彌散的方式通過血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)?，F(xiàn)在已證明鼻腔給藥可以通過嗅神經(jīng)通路彌散入腦，國(guó)外已有應(yīng)用藥物滴鼻技術(shù)治療腦損傷的報(bào)道。但由于肽類藥物在體內(nèi)的半衰期很短，若要維持療效，需持續(xù)給藥，在實(shí)際應(yīng)用中是很難實(shí)現(xiàn)的。
基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的主體?；蚬こ淌峭ㄟ^對(duì)核酸分子的插入、拼接和重組而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，再借助病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，并使目的基因在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)，其主要研究任務(wù)包括基因分離、合成、切割、重組、轉(zhuǎn)移和表達(dá)等。所以基因工程又稱基因操作、基因克隆和DNA分子克隆或DNA重組等。
基因工程技術(shù)的興起是在分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)研究取得一系列重大突破后而發(fā)展起來的，概括其發(fā)展過程，大體可分為四個(gè)里程碑式的階段。
1. 1944年，Oswald Avery在美國(guó)首次(1928年)報(bào)道了肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，這不僅證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，而且還證明了DNA可以轉(zhuǎn)移，并把一個(gè)細(xì)菌的性狀傳給另一個(gè)細(xì)菌。Oswald Avery的工作是現(xiàn)代生物科學(xué)的革命開端，也可以說是基因工程的先導(dǎo)。
2. 1953年James waston和Francis crick闡明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。crick在20世紀(jì)60年代建立了DNA半保留復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的中心法則，從而解開了DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯過程之謎，提出了遺傳信息是DNA→RNA→蛋白質(zhì)，也闡明了轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中出現(xiàn)誤差所造成生物變異之謎，從此千百年來神秘的遺傳現(xiàn)象從分子水平上得到了揭示，為遺傳和變異提供了理論依據(jù)。
3.遺傳密碼子的破譯。1961年Monod和Jacob提出了操縱子學(xué)說，為基因表達(dá)調(diào)控提出了新理論，到1968年crick和Nlreberg完全破譯了64個(gè)遺傳密碼子，mRNA中每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子。每一個(gè)密碼子代表某一個(gè)氨基酸，其中61個(gè)分別代表各種氨基酸，剩余的3個(gè)密碼子(UAA、UAG、UGA)為肽鏈的終止信號(hào)(又稱終止密碼子)，不代表任何氨基酸，AUG既代表蛋氨酸密碼子，同時(shí)又為肽鏈合成的啟動(dòng)信號(hào)(又稱啟動(dòng)密碼子)。確定遺傳信息是以密碼子方式傳遞的，為基因工程中的基因結(jié)構(gòu)、框架、基因分離、合成提供了依據(jù)，此后才開始基因操作的研究，基因工程技術(shù)才得以發(fā)展。
4.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)為基因工程開創(chuàng)了新局面。20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的質(zhì)粒，它是指生物體內(nèi)染色體以外的環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立自我復(fù)制的能力，可在微生物細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。此后又相繼發(fā)現(xiàn)噬菌體、瘡疹病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、昆蟲多角體病毒轉(zhuǎn)移載體等。這些發(fā)現(xiàn)為目的基因轉(zhuǎn)移和導(dǎo)入找到了理想的運(yùn)載工具，使目的基因表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)，基因工程的成功成為可能。
1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)P.Berg等在世界上第一次將猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體DNA通過酶切和T4DNA連接酶連接后，所獲得的包含SV40基因的重組體在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。同時(shí)斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人將抗四環(huán)素質(zhì)粒和抗新霉素及抗磺胺的質(zhì)粒通過酶切和連接后，又獲得了抗四環(huán)素和抗新霉素的重組菌落。從此揭開了基因工程的序幕，這一年被定為基因工程誕生之年。
基因工程的誕生其理論和實(shí)踐意義都非常重大，受到人們的極大關(guān)注。但開始并未被大家所認(rèn)識(shí)，結(jié)果遇到了強(qiáng)大的阻力。對(duì)基因工程產(chǎn)生了爭(zhēng)議，爭(zhēng)論的焦點(diǎn)是害怕基因工程創(chuàng)造的雜種生物會(huì)從實(shí)驗(yàn)室逸出，在自然界造成難以控制的危害。因它們?cè)谧匀唤缈刹粩嘣鲋?，危害更大，由此又?duì)基因工程產(chǎn)生了恐懼。于是，許多社會(huì)人士、政府官員，甚至許多科學(xué)家也發(fā)出呼吁，要求制定法規(guī)限制基因工程研究。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院還成立了一個(gè)專門委員會(huì)處理這些訴訟事宜。于1975年又制定了“通用重組DNA分子研究準(zhǔn)則”為基因工程安全防護(hù)作了許多規(guī)定，甚至有許多科學(xué)家聯(lián)名要求取消危險(xiǎn)的基因工程實(shí)驗(yàn)。面對(duì)強(qiáng)大的阻力，一批科學(xué)家仗義執(zhí)言，Cohen等人也寫文章給以反駁，一方面指出基因工程具有強(qiáng)大的生命力；另一方面，又告誡人們，所謂基因工程的危險(xiǎn)都是估計(jì)性的，是無依據(jù)的斷定，由于人們對(duì)基因工程缺乏理解，就如大多數(shù)人不能區(qū)分原子和分子、病毒和細(xì)胞、細(xì)胞和生物一樣，是一種出于不理解而造成的恐懼。以后情況漸漸緩和隨著研究的深入發(fā)展，研究人員通過事實(shí)不斷消除人們的恐懼心理，通過對(duì)從事大腸桿菌表達(dá)研究的基因工程研究人員的糞便檢查，并未發(fā)現(xiàn)有所研究的大腸桿菌及其質(zhì)粒。1977年，Itakura又將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制素(somatostatin，SMT)基因在原核細(xì)胞中獲得了真核基因的表達(dá)，打破了物種界限，轟動(dòng)了全世界，各種指責(zé)隨之消失，從此才使基因工程能以旺盛的生命力向前發(fā)展。
肽是幾個(gè)或幾十個(gè)氨基酸，通過肽鍵連接形成的有機(jī)分子。具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和功能專一的特點(diǎn)，在預(yù)防、診斷和治療疾病中具有重要使用價(jià)值并已經(jīng)用于臨床，如目前使用的免疫調(diào)節(jié)劑日達(dá)先、抗愛滋病毒的T-20肽、腫瘤凋亡肽和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽等。
目前主要是合成方法制備各種肽，產(chǎn)量是毫克級(jí)的，難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，且合成肽的生產(chǎn)成本很高，存在生產(chǎn)技術(shù)瓶頸。
人體的循環(huán)血和細(xì)胞內(nèi)存在大量的肽水解酶，當(dāng)肽注射到體內(nèi)常常被迅速降解，體內(nèi)半衰期縮短，臨床要求每日多次的注射生物肽來治療疾病，存在臨床應(yīng)用瓶頸。
肽雖然也可以根據(jù)氨基酸序列來推測(cè)它的cDNA編碼，但很難用表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法在體內(nèi)和體外表達(dá)生物活性肽，尤其是在體內(nèi)表達(dá)。這主要的差異是編碼蛋白質(zhì)是一個(gè)完整的基因，在細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在識(shí)別、轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和最終分泌出細(xì)胞的完整系統(tǒng)，它保證了編碼蛋白的表達(dá)。而編碼肽的cDNA片段，是一個(gè)極不完整的，它轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物無法進(jìn)行細(xì)胞的加工和運(yùn)輸、出胞和分泌。因此目前使用肽作為預(yù)防和治療疾病時(shí)，僅能使用化學(xué)合成方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于神經(jīng)損傷治療的能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒及其制備方法和含有該病毒的制劑和該制劑的應(yīng)用。
為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一種能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，它是由具有能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽基因序列的腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞經(jīng)過單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后純化得到的重組腺伴病毒。
本發(fā)明所述基因序列為具有NAP(八肽)和ADNF(九肽)的cDNA序列，所述cDNA序列是具有依據(jù)NAP和ADNF的肽序列分別在5｀端加入內(nèi)肽酶識(shí)別序列和Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)、3｀端加入終止子和內(nèi)切酶Bam H I識(shí)別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA。
本發(fā)明所述cDNA序列的表達(dá)載體構(gòu)建是將已經(jīng)插入了NT4全長(zhǎng)的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，分別插入NAP peptide cDNA和ADNF peptide cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體本發(fā)明所述pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體是分別使用EcoR I和BamH I雙酶切獲得編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-NAPcDNA片段和編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-ADNF cDNA片段，將其插入到pssHG-CMV載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pssHG-Neo載體由加拿大Microbix生物公司提供的pSSV9int載體，在兩側(cè)的AAV5｀ITR之間插入Neo篩選基因和多克隆位點(diǎn)。
本發(fā)明插入目的基因的腺伴病毒載體是轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞得到腺伴病毒載體質(zhì)粒。
本發(fā)明它的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入了AAV Rep和Cap基因的pAAV/Ad作為包裝輔助質(zhì)粒。
本發(fā)明它的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入腺病毒5型全基因組的pFG140質(zhì)粒作為輔助病毒啟動(dòng)AAV復(fù)制。
本發(fā)明它的包裝是使用磷酸鈣方法，腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞得到重組腺伴病毒。
本發(fā)明收獲細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次，3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清；加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜；4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀；沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌，得到純化后的重組腺伴病毒。
本發(fā)明純化后的重組病毒，用于各種原因引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的治療，包括外傷、心腦血管病、老年退行性病變、有毒物質(zhì)等引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡。
本發(fā)明可以制成滴鼻劑、洗鼻劑、鼻用噴霧劑、鼻用軟膏劑、鼻用乳膏劑、鼻用凝膠劑、鼻用散劑、鼻用粉霧劑或鼻用棒劑制劑形式用于中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷治療。
本發(fā)明所述制劑形式是10-10～1010ml/規(guī)格。
本發(fā)明還公開了一種所述能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒的制備方法，它包括下列步驟1.細(xì)胞庫(kù)包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞，購(gòu)置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始種子細(xì)胞庫(kù)；1.1種子細(xì)胞庫(kù)原始種子細(xì)胞由液氮儲(chǔ)存容器保存，每?jī)蓚€(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用；1.2主細(xì)胞庫(kù)種子細(xì)胞庫(kù)經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，作為主細(xì)胞庫(kù)，由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用；1.3工作細(xì)胞庫(kù)從主細(xì)胞庫(kù)最早復(fù)蘇的細(xì)胞，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，用至60代后，集停止使用；2.重組質(zhì)粒的工程菌庫(kù)2.1目的基因的來源2.1.1根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)資料，查到NAP(八肽)和ADNF(九肽)的氨基酸序列和根據(jù)人類優(yōu)勢(shì)密碼子原則推導(dǎo)出編碼以上兩個(gè)肽的cDNA，依據(jù)NAP和ADNF的肽序列分別在5｀端加入內(nèi)肽酶識(shí)別序列和Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)、3｀端加入終止子和內(nèi)切酶Bam H I識(shí)別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA；2.1.2將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)其正確性；(1)表達(dá)載體構(gòu)建將已經(jīng)插入了NT4全長(zhǎng)的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，分別插入NAP peptidecDNA和ADNF peptide cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體，經(jīng)酶切圖譜檢測(cè)證實(shí)；(2)分別使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體載體獲得編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-NAP cDNA片段和編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-ADNF cDNA片段，將其插入到pssHG-CMV載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pssHG-Neo載體由加拿大Microbix生物公司提供的pSSV9int載體，其特點(diǎn)是在兩側(cè)的AAV5｀ITR之間插入Neo篩選基因和多克隆位點(diǎn)；(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定；大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；2.2重組質(zhì)粒種子工程菌庫(kù)單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支；每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；2.3重組質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；2.4重組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)，液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；3.輔助質(zhì)粒工程菌庫(kù)3.1輔助質(zhì)粒原工程菌庫(kù)使用在兩個(gè)Ad ITR間插入了AAV Rep和Cap基因的pAAV/Ad作為包裝輔助質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌；種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；3.2輔助質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；3.3輔助質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)。液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；4.腺病毒全基因組質(zhì)粒工程菌庫(kù)使用插入腺病毒5型全基因組的pFG140質(zhì)粒作為輔助病毒啟動(dòng)AAV復(fù)制，轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)；-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；4.1腺病毒全基因組質(zhì)粒種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；
4.2腺病毒全基因組質(zhì)粒主工程菌種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；4.3腺病毒全基因組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)，液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；5.包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫(kù)的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫(kù)分離獲取，在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝；②使用磷酸鈣方法，腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清，加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒；③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測(cè)的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)；噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。
本發(fā)明利用生物工程技術(shù)的最新成果，將重組的腺伴病毒改建為可表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的載體，表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)肽可通過鼻粘膜彌散進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由于該病毒可持續(xù)表達(dá)產(chǎn)物，因此藥物可以源源不斷的進(jìn)入腦內(nèi)，使受損的神經(jīng)細(xì)胞迅速恢復(fù)正常的功能，并不斷產(chǎn)生新的，充滿活力的新生神經(jīng)細(xì)胞，這是基因工程技術(shù)與基因治療技術(shù)的完美結(jié)合。
本發(fā)明是肽治療學(xué)發(fā)展中革命性的進(jìn)步，它解決了長(zhǎng)期以來困擾我們的一個(gè)難題，即如何在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)具有生物學(xué)效應(yīng)的活性的小分子肽。
本發(fā)明的作用原理是將能夠持續(xù)產(chǎn)生治療物質(zhì)的“工廠”移入人體內(nèi)，因而省略了體外合成，提取，純化，分離的繁瑣程序，實(shí)現(xiàn)了我們追求的低耗，高效，持久的治療目的。
本發(fā)明的給藥途徑是另辟蹊徑，通過滴鼻給藥，利用嗅神經(jīng)-海馬-中樞的途徑，使小分子肽彌散進(jìn)入中樞神經(jīng)，達(dá)到外周給藥，治療中樞的效應(yīng)，使用方法非常簡(jiǎn)便，完全符合家庭用藥標(biāo)準(zhǔn)。
基因治療中重要的問題是如何保證治療的安全性。本發(fā)明采用腺相關(guān)病毒作為載體，以下幾點(diǎn)可確保其安全性①正常人鼻腔內(nèi)即存在此類病毒，可以認(rèn)為每個(gè)人都有該病毒的天然感染；②該病毒無任何致病性；③本發(fā)明使用的腺相關(guān)病毒經(jīng)過多次改造，與鼻粘膜細(xì)胞的DNA不形成整合，只是形成染色體外附加體，對(duì)宿主基因無任何改變；④大量毒理實(shí)驗(yàn)資料支持上述結(jié)論


圖1為本發(fā)明所述cDNA變性和復(fù)性后的編碼結(jié)構(gòu)。
其中1為內(nèi)肽酶切點(diǎn)；2為Nae I切點(diǎn)；3為BamH I切點(diǎn)；4為NAP cDNA。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒的制備1.細(xì)胞庫(kù)包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞(購(gòu)自于美國(guó)ATCC)，購(gòu)置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始細(xì)胞庫(kù)(原始種子細(xì)胞庫(kù))，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。
1.1種子細(xì)胞庫(kù)由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，專人專門負(fù)責(zé)。每?jī)蓚€(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用，再次重新購(gòu)置，鑒定方法及監(jiān)測(cè)方法同前。
1.2主細(xì)胞庫(kù)種子細(xì)胞庫(kù)經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，作為主細(xì)胞庫(kù)。由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，專人專門負(fù)責(zé)。每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用，再次重新購(gòu)置，鑒定方法及監(jiān)測(cè)方法同前。
1.3工作細(xì)胞庫(kù)從主細(xì)胞庫(kù)最早復(fù)蘇的細(xì)胞。傳代次數(shù)依據(jù)生產(chǎn)任務(wù)而定，且要留有繼續(xù)傳代的細(xì)胞的量。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。一般用至60代后，集停止使用。
2.重組質(zhì)粒的工程菌庫(kù)
2.1目的基因的來源2.1.1根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)資料，查到NAP(八肽)和ADNF(九肽)的氨基酸序列和根據(jù)人類優(yōu)勢(shì)密碼子原則推導(dǎo)出編碼以上兩個(gè)肽的cDNA。依據(jù)NAP和ADNF的肽序列分別在5｀端加入內(nèi)肽酶識(shí)別序列和Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)、3｀端加入終止子和內(nèi)切酶Bam H I識(shí)別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA，進(jìn)行變性和復(fù)性，2.1.2將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)其正確性。
(1)表達(dá)載體構(gòu)建將已經(jīng)插入了NT4全長(zhǎng)的pBV-NT4質(zhì)粒(本室自己克隆構(gòu)建，測(cè)序證實(shí))，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，分別插入NAP peptide cDNA和ADNF peptide cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體經(jīng)酶切圖譜檢測(cè)證實(shí)。
(2)分別使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體載體獲得編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-NAP cDNA片段和編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-ADNF cDNA片段，將其插入到pssHG-CMV載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pssHG-Neo載體由加拿大Microbix生物公司提供的pSSV9int載體經(jīng)本室改建后獲得，其特點(diǎn)是在兩側(cè)的AAV5｀ITR之間插入Neo篩選基因和多克隆位點(diǎn)。
(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)Invtrogen公司購(gòu)買)。大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒。紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)。
-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定。大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒。
2.2重組質(zhì)粒種子工程菌庫(kù)單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支。每10代凍存一次。作為原始工程菌庫(kù)。每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
2.3重組質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)。每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
2.4重組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)。液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒。層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒。
3.輔助質(zhì)粒工程菌庫(kù)3.1輔助質(zhì)粒原工程菌庫(kù)使用在兩個(gè)Ad ITR間插入了AAV Rep和Cap基因的pAAV/Ad作為包裝輔助質(zhì)粒(購(gòu)于Genedetect公司)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌。
種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支。每10代凍存一次。作為原始工程菌庫(kù)。每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
3.2輔助質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)。每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
3.3輔助質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)。液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒。層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒。
4.腺病毒全基因組質(zhì)粒工程菌庫(kù)使用插入腺病毒5型全基因組的pFG140質(zhì)粒作為輔助病毒啟動(dòng)AAV復(fù)制，購(gòu)于Microbix公司，轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)Invtrogen公司購(gòu)買)。大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒。紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)。
-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定。大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒。
4.1腺病毒全基因組質(zhì)粒種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支。每10代凍存一次。作為原始工程菌庫(kù)。每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
4.2腺病毒全基因組質(zhì)粒主工程菌種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)。每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入。
4.3腺病毒全基因組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)。液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒。層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒。
5.包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫(kù)的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫(kù)分離獲取，記錄代數(shù)和分離時(shí)間。在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝。
②使用磷酸鈣方法，腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變。收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清。加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒。
③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測(cè)的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)。
噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。
6.重組病毒的生產(chǎn)和純化
6.1重組病毒的生產(chǎn)80％成片的293細(xì)胞，10MOI劑量接種工作病毒，感染后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
實(shí)施例2重組病毒的純化收獲的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃，2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，在將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌。
實(shí)施例3重組腺伴病毒鼻腔給藥制劑的制備成型將純化后的重組腺伴病毒按照相關(guān)制劑技術(shù)及《中華人民共和國(guó)藥典》，制備成滴鼻劑、洗鼻劑、鼻用噴霧劑、鼻用軟膏劑、鼻用乳膏劑、鼻用凝膠劑、鼻用散劑、鼻用粉霧劑、鼻用棒劑。
臨床應(yīng)用劑型及規(guī)格1.滴鼻劑(10-10～1010ml/規(guī)格)2.洗鼻劑(10-10～1010mg/規(guī)格)3.鼻用噴霧劑(10-10～1010mg/規(guī)格)4.鼻用軟膏劑(10-10～1010mg/規(guī)格)5.鼻用乳膏劑(10-10～1010mg/規(guī)格)6.鼻用凝膠劑(10-10～1010mg/規(guī)格)7.鼻用散劑(10-10～1010mg/規(guī)格)8.鼻用粉霧劑(10-10～1010mg/規(guī)格)9.鼻用棒劑(10-10～1010mg/規(guī)格)臨床給藥途徑鼻腔給藥臨床應(yīng)用范圍1.外傷引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡2.腦血管病引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡3.老年退行性引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡4.有毒物質(zhì)引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡等實(shí)施例4第一治療組和第二治療組分別使用表達(dá)不同種類神經(jīng)保護(hù)肽的重組病毒結(jié)果。未加害組就是正常動(dòng)物，加害對(duì)照就是加害后不給予治療的動(dòng)物。NSS評(píng)分是國(guó)際研究腦損傷后對(duì)動(dòng)物行為的評(píng)分方法，正常動(dòng)物為0分，損傷嚴(yán)重分?jǐn)?shù)高，最高10分。
護(hù)腦滴鼻液對(duì)昆明小鼠閉合性腦外傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注NSS評(píng)分是指小鼠平衡、運(yùn)動(dòng)等行為的國(guó)際評(píng)分方法實(shí)施例5第一治療組和第二治療組分別使用表達(dá)不同種類神經(jīng)保護(hù)肽的重組病毒結(jié)果。未加害組就是正常動(dòng)物，加害對(duì)照就是加害后不給予治療的動(dòng)物。NSS評(píng)分是國(guó)際研究腦損傷后對(duì)動(dòng)物行為的評(píng)分方法，正常動(dòng)物為0分，損傷嚴(yán)重分?jǐn)?shù)高，最高10分。
護(hù)腦滴鼻液對(duì)懷孕昆明小鼠子鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注NSS評(píng)分是指小鼠平衡、運(yùn)動(dòng)等行為的國(guó)際評(píng)分方法神經(jīng)保護(hù)肽DNA序列1-LISAL神經(jīng)保護(hù)肽DNA序列1-LISALFileNT4SAL.TXTRange1-270 ModeNormalCodon TableUniversalMolecular Weight9429.579 18 27 36 45 545’ATG CTC CCT CTC CCC TCA TGC TCC CTC CCC ATC CTC CTC CTT TTC CTC CTC CCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro63 72 81 90 99 108AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC TCA ACA TTG CCC CCT TTT CTG GCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala117 126 135 144 153 162CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CCC CGA GTA GTC CTG TCT AGG GGT GCC CCT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala171 180 189 198 207 216GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT GGG GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly225 234 243 252 261 270GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT TCC GCT CTG CTG AGG TCC ATC CCC GCC TGA 3’--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg Ser Ala Leu Leu Arg Ser Ile Pro Ala ***
神經(jīng)保護(hù)肽DNA序列2-liNAP神經(jīng)保護(hù)肽DNA序列2-LINAPFileNT4NAP.TXTRange1-267 ModeNormalCodon TableUniversalMolecular Weight9327.429 18 27 36 45 545’ATG CTC CCT CTC CCC TCA TGC TCC CTC CCC ATC CTC CTC CTT TTC CTC CTC CCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro63 72 81 90 99 108AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC TCA ACA TTG CCC CCT TTT CTG GCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala117 126 135 144 153 162CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CCC CGA GTA GTC CTG TCT AGG GGT GCC CCT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala171 180 189 198 207 216GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT GGG GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly225 234 243 252 261GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT AAC GCT CCC GTG TCC ATC CCT CAG TGA 3’--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg Asn Ala Pro Val Ser Ile Pro Gln ***
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于它是由具有能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽基因序列的腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞經(jīng)過單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后純化得到的用于神經(jīng)損傷治療的能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于所述基因序列為具有NAP(八肽)和ADNF(九肽)的cDNA序列，所述cDNA序列是具有依據(jù)NAP和ADNF的肽序列分別在5`端加入內(nèi)肽酶識(shí)別序列和Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)、3｀端加入終止子和內(nèi)切酶Bam H I識(shí)別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于所述cDNA序列的表達(dá)載體構(gòu)建是將已經(jīng)插入了NT4全長(zhǎng)的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，分別插入NAP peptide cDNA和ADNF peptide cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于所述pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體是分別使用EcoR I和BamH I雙酶切獲得編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-NAP cDNA片段和編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-ADNF cDNA片段，將其插入到pssHG-CMV載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pssHG-Neo載體由加拿大Microbix生物公司提供的pSSV9int載體，在兩側(cè)的AAV5｀ITR之間插入Neo篩選基因和多克隆位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于插入目的基因的腺伴病毒載體是轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞得到腺伴病毒載體質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于它的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入了AAV Rep和Cap基因的pAAV/Ad作為包裝輔助質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于它的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入腺病毒5型全基因組的pFG140質(zhì)粒作為輔助病毒啟動(dòng)AAV復(fù)制。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于它的包裝是使用磷酸鈣方法，腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞得到重組腺伴病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于收獲細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次，3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清；加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜；4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀；沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌，得到純化后的重組腺伴病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于它可以制成滴鼻劑、洗鼻劑、鼻用噴霧劑、鼻用軟膏劑、鼻用乳膏劑、鼻用凝膠劑、鼻用散劑、鼻用粉霧劑或鼻用棒劑制劑形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，其特征在于所述制劑形式是10-10～1010ml/單位劑量。
12.一種如權(quán)利要求1-11所述表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒的制備方法，其特征在于它包括下列步驟1.細(xì)胞庫(kù)包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞，購(gòu)置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始種子細(xì)胞庫(kù)；1.1種子細(xì)胞庫(kù)原始種子細(xì)胞由液氮儲(chǔ)存容器保存，每?jī)蓚€(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用；1.2主細(xì)胞庫(kù)種子細(xì)胞庫(kù)經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，作為主細(xì)胞庫(kù)，由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫(kù)傳代至50代，終止使用；1.3工作細(xì)胞庫(kù)從主細(xì)胞庫(kù)最早復(fù)蘇的細(xì)胞，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，用至60代后，集停止使用；2.重組質(zhì)粒的工程菌庫(kù)2.1目的基因的來源2.1.1根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)資料，查到NAP(八肽)和ADNF(九肽)的氨基酸序列和根據(jù)人類優(yōu)勢(shì)密碼子原則推導(dǎo)出編碼以上兩個(gè)肽的cDNA，依據(jù)NAP和ADNF的肽序列分別在5｀端加入內(nèi)肽酶識(shí)別序列和Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)、3｀端加入終止子和內(nèi)切酶Bam H I識(shí)別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA；2.1.2將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)其正確性；(1)表達(dá)載體構(gòu)建將已經(jīng)插入了NT4全長(zhǎng)的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，分別插入NAP peptide cDNA和ADNF peptide cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體，經(jīng)酶切圖譜檢測(cè)證實(shí)；(2)分別使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-NAP載體和pBV-NT4-ADNF載體載體獲得編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-NAP cDNA片段和編碼NT4信號(hào)肽、引導(dǎo)肽-ADNF cDNA片段，將其插入到pssHG-CMV載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pssHG-Neo載體由加拿大Microbix生物公司提供的pSSV9int載體，其特點(diǎn)是在兩側(cè)的AAV5｀ITR之間插入Neo篩選基因和多克隆位點(diǎn)；(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定；大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；2.2重組質(zhì)粒種子工程菌庫(kù)單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支；每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；2.3重組質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；2.4重組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)，液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；3.輔助質(zhì)粒工程菌庫(kù)3.1輔助質(zhì)粒原工程菌庫(kù)使用在兩個(gè)Ad ITR間插入了AAV Rep和Cap基因的pAAV/Ad作為包裝輔助質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌；種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；3.2輔助質(zhì)粒主工程菌庫(kù)種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；3.3輔助質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)。液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；4.腺病毒全基因組質(zhì)粒工程菌庫(kù)使用插入腺病毒5型全基因組的pFG140質(zhì)粒作為輔助病毒啟動(dòng)AAV復(fù)制，轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測(cè)定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)；-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每?jī)芍軅鞔淮?，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；4.1腺病毒全基因組質(zhì)粒種子工程菌單克隆工程菌冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始工程菌庫(kù)，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；4.2腺病毒全基因組質(zhì)粒主工程菌種子工程菌經(jīng)過鑒定合格后，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，建立主工程菌庫(kù)，每半個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)質(zhì)粒的酶切圖譜和重組片斷的插入；4.3腺病毒全基因組質(zhì)粒工作工程菌庫(kù)從主工程菌中分離出來的轉(zhuǎn)化菌，LB擴(kuò)增，甘油LB培養(yǎng)基-20℃冰箱保存，記錄代數(shù)，液態(tài)LB復(fù)蘇后，固體LB上挑選單菌落，液態(tài)LB增菌，小提質(zhì)粒，建立酶切圖譜，選擇正確的克隆，進(jìn)行大量增菌，大提質(zhì)粒，層析純化，OD280/OD260鑒定后，轉(zhuǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)重組病毒；5.包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫(kù)的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫(kù)分離獲取，在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝；②使用磷酸鈣方法，腺伴病毒載體質(zhì)粒、pAAV/Ad和pFG140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清，加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒；③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測(cè)的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)；噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。
13.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于它還包括重組病毒的純化步驟收獲的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃，2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，在將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒的應(yīng)用，其特征在于它用于各種原因引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的治療，包括外傷、心腦血管病、老年退行性病變、有毒物質(zhì)等引起的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒，它是一種由具有能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽基因序列的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，純化得到的重組腺伴病毒。本發(fā)明還提供了上述能夠表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的重組腺伴病毒鼻腔給藥制劑的制備方法及含有該病毒的制劑及該制劑在治療各種原因造成的中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡疾病的用途。本發(fā)明將重組的腺伴病毒改建為可表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽的載體，表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)肽可通過鼻粘膜彌散進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由于該病毒可持續(xù)表達(dá)產(chǎn)物，因此藥物可以源源不斷的進(jìn)入腦內(nèi)，使受損的神經(jīng)細(xì)胞迅速恢復(fù)正常的功能，并不斷產(chǎn)生新的，充滿活力的新生神經(jīng)細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1840658SQ20051009847
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者楊廣孝, 李求是 申請(qǐng)人:北京多米諾醫(yī)藥研究所