專利名稱：胰高血糖素樣多肽－1類似物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)類似物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，2型糖尿病由于發(fā)病率提高而成為世界性的疾病。2型糖尿病的發(fā)病機理非常復(fù)雜，當(dāng)前使用的治療2型糖尿病藥物有種種缺陷，最主要表現(xiàn)在長期使用引起患者的體重增加，而且由于藥物引起的β-細胞功能作用的逐漸損失使得患病加重。大約百分之九十糖尿病患者為2型糖尿病，亦稱為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)。2型糖尿病患者一般仍然分泌胰島素，但胰島素?zé)o法由身體細胞有效地使用，因而無法降低血糖水平。
胰高血糖素樣肽1是機體正常的分泌多肽，由于對2型糖尿病的療效顯著并且能克服現(xiàn)有藥物的缺陷而成為倍受矚目的治療2型糖尿病的新型藥物。
胰高血糖素樣肽1(GLP-1)發(fā)現(xiàn)于1984年，被認為是一種重要的腸降糖素(incretin)。胰高血糖素樣肽1是胰高血糖素原基因的產(chǎn)品.胰高血糖素樣肽1是在攝食時由腸道的L-細胞釋放，并促進胰腺β-細胞釋放胰島素。胰高血糖素樣肽1的作用不僅在于刺激胰島素的釋放，還有眾多的其它功能。目前普遍認為胰高血糖素樣肽1不僅控制血液葡萄糖而且通過幾個其它作用控制2型糖尿病疾病的行進。
在臨床上，胰高血糖素樣肽1被證明在降低血液葡萄糖是非常有效的，并且可用在糖尿病的任意階段。非常重要的發(fā)現(xiàn)是很少觀察到低血糖的風(fēng)險。其原因在于胰高血糖素樣肽1不同于磺酰脲降糖藥(sulfonylureas)，只刺激葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。利用天然胰高血糖素樣肽1進行六周皮膚注射試驗表明患者的體重也下降了。唯一已知的藥物學(xué)副作用是當(dāng)在使用高劑量胰高血糖素樣肽1時患者有惡心和嘔吐。這些不必要的副作用可由被禁止空腹使用而克服。并且，大多數(shù)臨床數(shù)據(jù)表明，惡心只是短暫的，高效率的葡萄糖控制能在沒有這種副作用情況下實現(xiàn)。因而，從臨床觀點看，胰高血糖素樣肽1可有效地降下血液葡萄糖，較少低血糖癥風(fēng)險和阻止疾病發(fā)展的潛力，為治療型2糖尿病的理想藥物。
目前有兩類胰高血糖素樣肽1化合物在進行臨床開發(fā)。一類是天然胰高血糖素樣肽1。另一類是exendin-4，是一種從蜥蜴Heloderma Suspectum的毒液中分離的多肽。這兩類多肽結(jié)構(gòu)同源性高達53％。
人類胰高血糖素樣肽1是含有37氨基酸殘基的多肽，來源于在回腸末端，由胰高血糖素樣肽原衍生而來。在L-細胞中，胰高血糖素樣肽原被加工成胰高血糖素樣肽-1(7-36)-NH2、胰高血糖素樣肽-1(3-37)和胰高血糖素樣肽-2。具有功能的天然人類胰高血糖素樣肽1有兩種形式胰高血糖素樣肽-1(7-36)-NH2，胰高血糖素樣肽-1(3-37)。
胰高血糖素樣-1(7-36)NH2作為潛在治療2型糖尿病藥物擁有幾個獨特和有益的效果。但是，由于被二肽酶IV(DPP IV)迅速水解和被腎臟迅速清除，天然胰高血糖素樣肽-1在體內(nèi)作用的半衰期的極短，少于2分鐘。有證據(jù)揭示其它水解酶，譬如中性肽鏈內(nèi)切酶(NEP)也降解胰高血糖素樣肽1。因而阻礙了利用胰高血糖素樣肽-1治療2型糖尿病研究發(fā)展。
比較而言，exendin-4對DPP-IV和NEP水解有較強抵抗性，在人體中的半衰期在DPP-IV控制后為26分鐘。在Exendin-4類似物中，第八位的丙氨酸由Gly替代，盡管替換后的胰高血糖素樣肽-1輕微地減弱了與受體的親和力，但對DPP IV更穩(wěn)定。根據(jù)exendin-4氨基酸序列，可以獲得更多抗酶的多肽分子，但這些多肽分子也許引起免疫反應(yīng)。
毋庸置疑，以胰高血糖素樣肽1受體為目標(biāo)的治療的理想的方式是使用多肽化合物衍生物。因而，新藥物發(fā)現(xiàn)將是開發(fā)一種具有半衰期長而穩(wěn)定的化合物。實驗結(jié)果表明，胰高血糖素樣肽1肽的N-終端序列負責(zé)對胰高血糖素樣肽1受體的核心部位的高親合力結(jié)合，其C-端負責(zé)選擇性與受體的N-端相結(jié)合；丙胺酸掃瞄實驗顯示天然胰高血糖素樣肽1第7，10，12，13，15，28，和29位的氨基酸對變異敏感。大量早期的研究在于瞄準(zhǔn)設(shè)計抗蛋白酶的胰高血糖素樣肽1，以利用作藥物。但是，這些胰高血糖素樣肽1類似物還是無法被用作為候選藥物，因為它們被腎臟迅速地仍然清除。因而要求用其它形式提高多肽化合物的某種延時性。
就胰高血糖素樣肽1而言，最大的挑戰(zhàn)是這些肽類化合物必須注射。另一個更加具體的挑戰(zhàn)是一種成功的胰高血糖素樣肽1藥物應(yīng)盡可能地減少對食道的副作用。這種藥物學(xué)副作用就是發(fā)生在藥物濃度達到高峰時的惡心。根據(jù)與此相關(guān)聯(lián)藥物動力學(xué)的性質(zhì)的研究，長半衰期可以最好地避免惡心，因為長半衰期可以保證血漿中的最小給藥量。大量臨床前和臨床研究數(shù)據(jù)表明，胰高血糖樣肽-1作為一種治療非胰島素依賴性糖尿病有巨大的前景，特別是當(dāng)口服藥劑失敗時尤為顯著。
此外，胰高血糖素樣肽1的真正臨床潛力在于降低葡萄糖，控制體重，并且控制病情。胰高血糖樣肽-1可誘導(dǎo)許多生物效應(yīng)，譬如刺激胰島素分泌，抑止胰高血糖素分泌，抑止胃倒空，提高葡萄糖利用，并且導(dǎo)致減重。而且，目前的臨床研究表明，胰高血糖樣肽-1可能阻止糖尿病伴隨的β-細胞功能損傷的惡化進程。胰高血糖樣肽-1的最明顯的特征是它能刺激胰島素分泌但沒有低血糖癥風(fēng)險，這種風(fēng)險常見于胰島素療法或口服藥物增加胰島素表達的治療過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服天然胰高血糖素樣肽-1在體內(nèi)作用的半衰期極短的問題，提供一種新的胰高血糖素樣多肽-1類似物。新的衍生物比天然型具有更好的藥物作用；比天然型在血液中對DPP-IV更強的抵抗力，具有更長的持久性；也更容易制備。
本發(fā)明的另一目的是提供上述胰高血糖素樣肽-1類似物的制備方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述胰高血糖素樣多肽-1類似物在制備用于治療2型糖尿病的緩釋藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的胰高血糖素樣多肽-1類似物，具有如下氨基酸序列Xaa5-Xaa6-His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Arg-Xaa37或藥物學(xué)可接受的鹽；其中Xaa5是Pro，Gly，Ac，NH2或者缺失；Xaa6是Pro，Ala，Ser或者缺失；Xaa8是Ala，bAla，Gly，Cys，-NH-CH(CH3)-CH2-，-NH-CH2-CH2-，Cys(Acm)或者Cys(SO3)；
Xaa34是Lys或者Pro或者缺失；Xaa35是Gly或者Pro或者缺失；Xaa37是βAla，Met，homoserine，Gly，Asp，NH2或者缺失；但是，所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物不包括以下序列GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)NH2，Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2。
本發(fā)明的胰高血糖素樣多肽-1類似物具有同胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1(7-37)OH)類似的氨基酸序列。GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列見表1中的SEQ ID NO2。胰高血糖樣肽-1類似物在修改一個或更多位置的氨基酸，如第8位和第37位氨基酸后，展示有比天然胰高血糖樣肽-1(7-37)OH有更強的活力。本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物與GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2有充分的同源性，胰高血糖素樣多肽-1類似物具備促胰島素活性。所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物包含有GLP-1(7-37)OH氨基酸序列或修改GLP-1(7-37)OH相對應(yīng)的位置氨基酸，以便類似物有一，二，三，四或五個氨基酸不同于GLP-1(7-37)OH。胰高血糖素樣多肽-1類似物的命名將替代的氨基酸和它的位置列在母本結(jié)構(gòu)之前，如表2至表6所示。例如，Cys8-GLP-1(7-37)OH為GLP-1(7-37)OH中在第8位的丙氨酸被替換為半胱氨酸的一種胰高血糖素樣多肽-1類似物。如表2所示，本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物是在位置8為非丙氨酸的一系列類似物，即位置8類似物。
本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物為含有大約三十或三十二個天然或非天然氨基酸的多肽，并和胰高血糖素樣多肽-1(7-37)OH有充分的同源性，而且具有胰島素促泌活性?！耙葝u素促泌活性”指刺激胰島素分泌能力可以回應(yīng)升高的葡萄糖水平，使升高的葡萄糖被細胞吸收利用，致使血漿中葡萄糖減少到正常水平。胰島素促泌活性可由已知方法分析，包括使用體內(nèi)實驗和體外分析測量胰高血糖素樣多肽-1受體結(jié)合親和力或受體的活化作用。結(jié)果分析見表7。
與本發(fā)明相符合的胰高血糖素樣肽-1類似物可為通過連接Xaa37和Xaa5形成的環(huán)狀肽。該環(huán)狀肽比線狀肽具有更好的藥物動力學(xué)和藥物代謝性能(如表7所示)，而且環(huán)狀肽具有可口服的優(yōu)點。
與本發(fā)明相符合的胰高血糖素樣肽-1類似物可為通過Cys5或Cys8二硫鍵形成的二聚體肽。該二聚體肽比線狀肽有更好的藥物動力學(xué)和藥物代謝性能(如表7所示)。
一個更具體化的胰高血糖素樣多肽-1類似物是將GLP-1(7-37)OH在位置7和位置37氨基酸連接形成一種環(huán)狀肽。更好地情況是除代替在位置8氨基酸之外，位置6為脯氨酸或甘氨酸，位置34和35氨基酸由脯氨酸替代，并且位置37氨基酸由天冬氨酸或甘氨酸替代。如表4所示。
通過上述位置氨基酸替代獲得比GLP-1(7-37)OH更穩(wěn)定的化合物。如表7所示，本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物的半衰期明顯比GLP-1(7-37)OH要長，胰高血糖素樣多肽-1類似物比GLP-1(7-37)OH更有活力。圖2說明mAla8-GLP-1(7-37)-OH與GLP-1(7-37)OH比較有更高的活力。
本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物，還包括藥物學(xué)上可接受的胰高血糖素樣多肽-1類似物的鹽類化合物。胰高血糖素樣多肽-1類似物擁有充足的酸性功能基團或堿性功能基團，或同時擁有酸堿功能基團，這些功能基團可與一定數(shù)量的無機堿，無機酸和有機酸等形成鹽。
在本發(fā)明中，其中的一個具體化是，本發(fā)明所述的胰高血糖素樣肽-1類似物可以轉(zhuǎn)換成C-端酰胺化多肽。
本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物主要指天然氨基酸。
在本發(fā)明中，其中的一個具體化是，通過重組DNA方法制備胰高血糖素樣肽-1類似物，而且所表達肽是前后重復(fù)排列的。重復(fù)肽片段通過甲硫氨酸或Asp-Gly或Asp-Pro連接，最大重復(fù)肽片段數(shù)六片段，即將胰高血糖素樣多肽-1類似物以下述公式重復(fù)連接的形式插入蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒pMFH中-{GLP-1類似物}n-- 其中n＝1-6。
在本發(fā)明中，其中的一個具體化是，利用固相法強化重組胰高血糖素樣多肽-1類似物的純化。先將含胰高血糖素樣多肽-1類似物的融合蛋白利用化學(xué)連接于固相載體表面，再用化學(xué)水解法釋放多肽。
一種利用化學(xué)連接和化學(xué)水解法純化本發(fā)明所述的重組胰高血糖素樣多肽-1類似物的方法，包括以下步驟A)將氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在無水環(huán)境下根據(jù)供應(yīng)商提供的標(biāo)準(zhǔn)程序連接到固相小珠表面；
B)重組融合載體pMFH的N終端設(shè)計有半胱氨酸，將含有重組胰高血糖素樣多肽-1類似物的融合蛋白通過化學(xué)連接法共價連接到固相小珠的表面；C)表達的融合蛋白通過Ni-NTA親合色譜柱純化，在洗脫液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA以增加化學(xué)連接的效率；D)用化學(xué)水解液充分地洗滌固相小珠0.1摩爾濃度鹽酸，6摩爾濃度鹽酸胍；E)以1∶200～400摩爾比加入溴化氰分解融合蛋白釋放重組胰高血糖素樣多肽-1類似物；收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱進行脫鹽。
步驟A中，所述的固相小珠優(yōu)選為化學(xué)修飾過的Affi-Gel10膠凝體。
本發(fā)明的胰高血糖素樣多肽-1類似物可用于制備治療2型糖尿病的緩釋藥物，其緩釋藥物的原型為蛋白載體-連結(jié)體-胰高血糖素樣多肽-1類似物；所述的蛋白載體為人白蛋白(Albumin)或者其他人血液蛋白；所述的連結(jié)體具有如下氨基酸序列Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-Yaa6-Yaa7其中Yaa1Cys或缺失；Yaa2Phe或Leu或缺失；Yaa3Asn或Val或缺失；Yaa4Pro或缺失；Yaa5Arg或缺失；Yaa6Gly或Pro或Ala或缺失；Yaa7Ser或Pro或Ala或缺失。
本發(fā)明利用蛋白載體在體內(nèi)緩釋胰高血糖素樣多肽-1類似物。胰高血糖素樣多肽-1類似物通過可水解的氨基酸序列連接于蛋白載體表面(如人白蛋白或者其他人血液蛋白)?？伤獾陌被嵝蛄锌蛇x擇人凝血酶識別序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明通過開發(fā)對DPP IV有強力抗性的新穎胰高血糖樣肽-1類似物，解決了天然胰高血糖樣肽-1半衰期極短和藥物生物效率不高的問題。本發(fā)明還通過提高非注射療法效率而克服胰高血糖樣肽-1有限的藥物生物效率。


圖1為基因重組合技術(shù)法制備胰高血糖素樣多肽-1化合物的表達質(zhì)粒；圖2為胰高血糖素樣多肽-1類似物抗DPP IV肽酶抗性分析結(jié)果；圖3表示一種用固相法強化重組多肽純化方法；圖4為一種重組胰高血糖素樣多肽-1的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖5為緩釋重組胰高血糖素樣多肽-1衍生物緩釋效果分析。
具體實施例方式
實施例1固相Fmoc化學(xué)法制備胰高血糖素樣多肽-1化合物本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物可用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法制備。多肽合成儀可從商業(yè)公司購買，如美國加州的Applied Biosystems公司。多肽合成單體也可從商業(yè)公司購買，如美國加州NovaBiochem公司。固相肽合成儀的使用根據(jù)制造商提供的說明操作進行保護干擾基團，偶和反應(yīng)，去偶和反應(yīng)，結(jié)合，分離，非反應(yīng)的氨基酸保護反應(yīng)。
表1至6中所列有的肽類化合物使用PerSeptive肽自動合成儀采用F-moc化學(xué)固相法合成。固相載體為聚乙烯甘醇多苯乙烯樹脂，使用哌啶二甲基甲酰胺為去保護劑和2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate和1-hydroxyben-zotriazole為連結(jié)劑。起始C-終端酰氨物使用50umole Rink AM樹脂。多肽鏈宿合完畢后，使用90％TFA，5％thioanisole，3％anisol和2％ethanedithiol進行去樹脂裂解和去保護反應(yīng)。粗肽使用C18-HPLC反相疏水層析純化，流動相為含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度純化的樣品由質(zhì)譜進行鑒定。純化肽的純度大于95％。
原料Fmoc-AlaΨCH(OH)-CH2-Glu(OtBu)和Fmoc-GlyΨCH(OH)-CH2-Glu(OtBu)根據(jù)Makowiec等的文獻{Makowiec，S.，& Wisniewska，K.，& Lankiewicz，L.(2004).Peptide bond modification.I.simple and efficient method ofBoc-Gly[CH(OH)CH2]Gly-OH syntesis.Polish J.Chem.78，315-318.}所述常規(guī)方法進行制備，其它Fmoc氨基酸及其它化學(xué)制品和溶劑，均購買于商業(yè)來源。
實施例2基因重組合技術(shù)法制備胰高血糖素樣多肽-1化合物本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物可用重組DNA方法制備。例如，胰高血糖素樣多肽-1基因可可隆到多肽表達載體pMFH中(Su ZD and Ni F.Novelfusion proteins for efficient production of recombinant peptides.PCT/WO2004/015111)。融合蛋白質(zhì)中的胰高血糖素樣多肽-1通過化學(xué)方法裂解后，進一步用HPLC純化。
表1中只含L-型天然氨基酸的胰高血糖素樣多肽-1及突變體也可以按Osborne等文獻(Osborne，M.J.，Su，Z.，Sridaran，V.，& Ni，F(xiàn).(2003).Efficientexpression of isotopically labeled peptides for high resolution NMRstudiesapplication to the Cdc42/Rac binding domains of virulent kinasesin Candida albicans.J.Biomol.NMR 26，317-326.)和Su等專利(Su ZD andNi F.Novel fusion proteins for efficient production of recombinantpeptides.PCT/WO2004/015111)描述的常規(guī)基因重組合技術(shù)來制備。胰高血糖素樣多肽-1及突變體基因片段可單一或同時以多達六個重復(fù)片段形式插入蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒pCMFH中，如圖1所示。片段之間通過甲硫氨酸或Asp-Gly連結(jié)。
如上述Osborne等文獻和Su等專利所述，質(zhì)粒pSGLP中使用的載體蛋白質(zhì)是staphylococcal核酸酶的N-端無甲硫氨酸的突變體片段，并連結(jié)有六個連續(xù)組氨酸標(biāo)記。
融合蛋白質(zhì)用大腸桿菌BL21(DE3)表達。然后按標(biāo)準(zhǔn)程序使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂進行純化了。融合蛋白質(zhì)溶解于70％甲酸中，利用酸或溴化氰水解釋放目標(biāo)肽。晶體溴化氰使用量為融合蛋白質(zhì)摩爾數(shù)100倍。讓反應(yīng)混和物在黑暗狀態(tài)下反應(yīng)24小時。反應(yīng)混和物在中性化以后進行脫鹽處理，脫鹽處理后的樣品經(jīng)Ni NTA層析柱除去MFH融合載體和未水解的融合蛋白質(zhì)。洗脫液流經(jīng)脫鹽后凍干備用。
凍干粉使用C18 HPLC反相層析柱，以水和乙腈混和物(含0.1％三氟乙酸)為梯度進行洗脫。純凈肽由質(zhì)譜核實，如圖4所示。
實施例3利用固相法強化重組多肽的純化方法圖3描述一種用固相法強化重組多肽的純化方法。固相小珠1，為修飾過的Affi-Gel10膠凝體(Bio-Rad，美國)。盡管可使用其它固相小珠，但Affi-Gel 10膠凝體對尿素，鹽酸胍，熱，溶劑，酸堿(酸堿度2-12)等有良好的抗性，并且具有高容量。首先，將氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在無水環(huán)境下根據(jù)供應(yīng)商提供的標(biāo)準(zhǔn)程序連接到Affi-Gel10膠凝體表面。融合蛋白2通過修飾過的肽表達質(zhì)粒pMFH，在大腸桿菌制備(Su ZD and Ni F.Novel fusion proteinsfor efficient production of recombinant peptides.PCT/WO2004/015111)。重組融合載體MFH的N終端設(shè)計有半胱氨酸以便可將融合蛋白通過化學(xué)連接法共價連接到固相小珠1的表面。在本發(fā)明中，三個化學(xué)水解位點，即Met-Xaa(Xaa為任意氨基酸)，Asp-Pro和Asp-Gly，單獨地插入在融合載體和胰高血糖素樣多肽-1之間。表達的融合蛋白通過Ni-NTA親合色譜柱純化。簡單地，細胞破碎上清液被裝載入用細胞破碎緩沖液平衡過的Ni-NTA親合色譜柱50毫摩爾濃度磷酸鹽，100毫摩爾濃度氯化鈉，6摩爾濃度鹽酸胍，酸堿度8.0，10摩爾濃度TECP。然后使用含50毫摩爾濃度imidozale前述緩沖液充分洗滌親合色譜柱。融合蛋白用含200毫摩爾濃度的imidozale前述緩沖液洗脫收集。洗脫液無需進一步純化而直接用于化學(xué)連接。在洗脫液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA以增加化學(xué)連接的效率。在本發(fā)明中，未觀察到benzymercaptan和thiophenol組合和MESNA之間的區(qū)別，但發(fā)明人更喜歡MESNA，因為它無氣味?；瘜W(xué)連接反應(yīng)在6個小時完全聯(lián)結(jié)。然后使用化學(xué)水解液充分地洗滌小珠0.1摩爾濃度鹽酸，6摩爾濃度鹽酸胍。以1∶200～400摩爾比加入溴化氰分解融合蛋白釋放多肽。當(dāng)需要用酸水解時，使用50％甲酸代替上述水解液。所有水解反應(yīng)以柔和地震動方式25℃在黑暗中進行，水解反應(yīng)過程用HPLC監(jiān)測。水解反應(yīng)效率在24到36小時以后達到95％。先使用重力洗脫水解液，然后以五倍床體積的水解緩沖液洗脫固相小珠。收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱進行脫鹽。多肽的特性由MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定，如圖4所示。三種水解法的多肽產(chǎn)率總結(jié)于表8。
實施例4本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物的酰氨化肽C終端酰氨基團由酶法轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)制備，再用光解法去保護基團。根本上，用羧肽酶(carboxypeptidase)對多肽底物與親核試劑進行酰氨化。轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)一般在含水緩沖溶液(包括50mM HEPES和5mM EDTA，酸堿度7.5或50mMCHES和5mM EDTA，酸堿度9.5)進行。轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)過程由HPLC監(jiān)控。其后，將反應(yīng)混合物的酸堿度降低到酸堿度為1到3以終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)產(chǎn)物利用反相譜色譜法HPLC進行分離。
此外，轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)也可在有機溶液中進行。合適的有機溶液可用dimethylsulfoxide(DMSO)，N，N’-dimethylacetamide，dimethylformamdie和其它相似的溶劑。Henriksen等描述了常規(guī)有機溶液中轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)的方法學(xué)(Henriksen，D.B.，Breddam，K.，& Buchardt，O.(1993).Peptide amidation by enzymatictransacylation and photolysis.Int.J.Pept.Protein Res.41，169-180.)。
例如以水溶液進行轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)，將多肽底物mAla8 GLP 1(7-36)-丙氨酸溶于5％的乙酸溶液。親核試劑(如白氨酸氨化物)溶于在50mM HEPES，5mM EDTA緩沖溶液(最終濃度為500mM)。25ul，40mM的mAla8GLP 1(7-36)-丙氨酸與950ul的親核試劑混合(酸堿度是7.5，20℃)。加入終濃度為每毫升0.002到0.07毫克的羧肽酶。轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)過程由HPLC監(jiān)控。當(dāng)產(chǎn)物不再形成后，加入一體積的三氟乙酸終止反應(yīng)。
轉(zhuǎn)酰氨反應(yīng)的產(chǎn)物，mAla8-GLP-1(7-36)-ONPGA由光解去保護。12.5ml溶于甲醇mAla8-GLP-1(7-36)-ONPGA加入12.5ml，80mM NaHSO3，用5N NaOH調(diào)整酸堿度到9.5。然后用N2將反應(yīng)混合物通氣15分鐘，隨后用紫外光在氮氣保護下進行光解作用。光解樣品在0，30，60和120分鐘定時提取分析。利用HPLC對每個樣品進行分析，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品相比較。
實施例5本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物對胰高血糖素樣多肽-1受體的活化作用當(dāng)前發(fā)明使用由Montrose-Rafizadeh等人描述的常規(guī)方法(Montrose-Rafizadeh，C.，Yang，H.，Rodgers，B.D.，Beday，A.，Pritchette，L.A.，& Eng，J.(1997).High potency antagonists of the pancreaticglucagon-like peptide-1 receptor.J.Biol.Chem.272，21201-21206.)，測定胰高血糖素樣多肽-1和類似物置換CHO/GLP-1R細胞的胰高血糖素樣多肽-1受體結(jié)合的[125I]GLP-1的競爭能力。在實驗之前，CHO/GLP-1R細胞培養(yǎng)至密度為70％后用serum-free HAM’S F-12培養(yǎng)基洗滌2h。用0.5ml緩沖液進行二次洗滌后，細胞置于0.5ml緩沖液(含2％BSA，50mM DPP-IV抑制劑，10mM葡萄糖，1-1,000nM GLP-1或類似物和30,000cpm125I-胰高血糖素樣多肽-1和類似物)在4℃培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)結(jié)束，去除上清液，用冰冷PBS洗滌細胞三次。在室溫加0.5ml 0.5N NaOH和0.1％SDS，并培養(yǎng)10分鐘。細胞水解物的放射線劑量在被了在Apec系列λ-計數(shù)器測量。專一性結(jié)合力定為總結(jié)合力減去用過量非標(biāo)記的胰高血糖素樣多肽-1(1μM)測定的放射線劑量。其IC50值列于表7。
實施例6細胞內(nèi)cAMP濃度的測定當(dāng)CHO/GLP-1R細胞培養(yǎng)至密度為60-70％時，以磷酸鹽緩沖液洗滌了三次。加1ML含有0.1％BSA的磷酸鹽緩沖液，置濕潤空氣孵化器中于37℃培養(yǎng)2h。然后加1ML含有0.1％BSA和IBMX(1mM)的磷酸鹽緩沖液后繼續(xù)培養(yǎng)，并加入胰高血糖素樣多肽-1和類似物?？瞻讟右粤姿猁}緩沖液代替。30分鐘后，以冰冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次停止反應(yīng)。用1ML冰冷高氯酸溶液(0.6M)處理5分鐘，提取細胞中的cAMP。用碳酸鉀(5M，84U1)調(diào)整樣品的酸堿度至7，短暫振蕩樣品管，并且離心去沉淀物(5分鐘，2000xg，4℃)。上清液經(jīng)真空干燥后溶于0.05M含4MM EDTA的Tris鹽緩沖液(酸堿度7.5)。加入碳酸鈉(0.15μM)和硫酸鋅(0.15μM)于樣品，然后放置于冰上15分鐘。離心去鹽沉淀物(5分鐘，2000xg，4℃)。使用[3H]cAMP競爭約束分析用試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech)測定樣品。EC50值列表7。
實施例7本發(fā)明所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物抗DPP IV肽酶抗性分析胰高血糖素樣多肽-1或類似物(最終濃度為2uM)與DPP IV(1.25mU)或人血漿(7.5ul)混合，在37℃，50mM Tris-Cl緩沖液，酸堿度7.8的條件下，分別反應(yīng)0，2，4，6和12h。在初步實驗中確定DPP IV和人的血漿的濃度，使大約50％的多肽在4-6h之內(nèi)水解，以便在12h內(nèi)定時觀察多肽的水解過程。加入TFA溶液(15ul，10％(v/v))終止反應(yīng)了。反應(yīng)液經(jīng)離心澄清后(12,000轉(zhuǎn)/每分鐘，10分鐘)，使用Vydac C18分析層析柱定量測定水解的較大的肽片段(即GLP-1(9-36)amide)。分析層析柱預(yù)先使用TFA/H2O(0.12％)(v/v)平衡，流速為1.0ml/min。使用乙腈進行濃度梯度洗脫(從10％到40％，30分鐘)。樣品吸收峰使用278納米波長監(jiān)測，收集后使用ESI質(zhì)譜儀鑒定。
胰高血糖素樣多肽-1由DPP IV降解半衰期(t1/2)為40min，在12hrs后，78-82％多肽已經(jīng)被水解，主要吸收峰經(jīng)ESI質(zhì)譜儀鑒定為GLP-1(9-36)短肽。相反，含有非肽鍵的胰高血糖素樣多肽-1類似物，即mAla8-GLP-1(7-36)-NH2，mAla8GLP 1(7-37)OH，mGly8-GLP-1(7-36)-NH2，mGly8GLP 1(7-37)OH，在與DPP IV反應(yīng)后不產(chǎn)生第二個吸收峰，表明對DPP IV水解具有完全的抵抗性(圖2和表7)。
如圖2所示，如果延長胰高血糖素樣多肽-1〖GLP-1(7-36)〗的N-端氨基酸序列，也可以改善胰高血糖素樣多肽-1對DPP IV水解的抵抗性。添加Gly-Pro序列(此序列可視為Asp-Gly-Pro的酸水解產(chǎn)物)可將胰高血糖素樣多肽-1對DPP IV水解的抵抗性提高3.7倍。添加Phe-Asn-Pro-Arg序列可將胰高血糖素樣多肽-1對DPP IV水解的抵抗性延長超過24小時。與GLP-1(7-37)相比，本發(fā)明中其他的胰高血糖素樣多肽-1類似物也不同程度地提高了對DPP IV水解的抵抗性。詳細的結(jié)果列于表7。
實施例8胰高血糖素樣多肽-1類似物的緩釋分析緩釋分析采用如下方式進行。目標(biāo)胰高血糖素樣多肽-1類似物按常規(guī)方法與人白蛋白共價交聯(lián)。交聯(lián)蛋白溶于50毫摩爾濃度磷酸緩沖液(終濃度為1毫摩爾濃度)。將1毫升交聯(lián)蛋白溶液移入Float ALyzerTM透析袋(1毫升，MWCO10KD)。再將透析袋置入裝有3毫升同樣濃度的磷酸緩沖液試管中，透析袋應(yīng)完全浸入緩沖液中，并用磁力攪拌器勻速攪拌。隔時抽取試管中溶液測定透析袋釋放胰高血糖素樣多肽-1類似物的劑量。在對比試驗中分別添加小劑量人凝血酶(thrombin)和二肽酶IV(DPP IV)，以測定胰高血糖素樣多肽-1類似物緩釋效果?？瞻自囼炛泻?毫摩爾濃度的胰高血糖素樣多肽-1類似。實驗結(jié)果表明交聯(lián)蛋白人-胰高血糖素樣多肽-1類似物在凝血酶或DPP IV作用下有明顯的緩釋效果，如圖5所示。
表1、胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列

表2、第八位氨基酸變異的胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列


表3、可用基因重組技術(shù)制備的胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列

表4、環(huán)狀胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列

表5、用于同白蛋白交聯(lián)的胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列


表6、二聚體胰高血糖素樣多肽-1氨基酸序列

表7、胰高血糖素樣多肽-1及衍生物在CHO/GLP-1R中的受體結(jié)合力和cAMP分析以及抗DPPIV分析


表8、三種水解法制備胰高血糖素樣多肽-1的比較

權(quán)利要求
1.胰高血糖素樣多肽-1類似物，其特征在于具有如下氨基酸序列Xaa5-Xaa6-His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Arg-Xaa37或藥物學(xué)可接受的鹽；其中Xaa5是Pro，Gly，Ac，NH2或者缺失；Xaa6是Pro，Ala，Ser或者缺失；Xaa8是Ala，bAla，Gly，Cys，-NH-CH(CH3)-CH2-，-NH-CH2-CH2-，Cys(Acm)或者Cys(SO3)；Xaa34是Lys或者Pro或者缺失；Xaa35是Gly或者Pro或者缺失；Xaa37是βAla，Met，homoserine，Gly，Asp，NH2或者缺失；但是，所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物不包括以下序列GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)NH2，Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物，其特征在于所述類似物為通過連接Xaa37和Xaa5形成的環(huán)狀肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物，其特征在于所述類似物為通過Cys5或Cys8二硫鍵形成的二聚體肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物，其特征在于所述類似物為C-端酰胺化胰高血糖素樣多肽-1類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物，其特征在于所述類似物為天然氨基酸。
6.一種權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物的制備方法，其采用重組DNA技術(shù)制備將胰高血糖素樣多肽-1類似物以下述公式重復(fù)連接的形式插入蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒pMFH中，片段之間通過甲硫氨酸或Asp-Gly或Asp-Pro連結(jié)--{GLP-1類似物}n--其中n＝1-6。
7.一種純化權(quán)利要求6所述重組胰高血糖素樣多肽-1類似物的方法，其特征在于利用化學(xué)連接和化學(xué)水解法，包括以下步驟A)將氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在無水環(huán)境下連接到固相小珠表面；B)重組融合載體pMFH的N終端設(shè)計有半胱氨酸，將含有重組胰高血糖素樣多肽-1類似物的融合蛋白通過化學(xué)連接法共價連接到固相小珠的表面；C)表達的融合蛋白通過Ni-NTA親合色譜柱純化，在洗脫液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA；D)用化學(xué)水解液充分地洗滌固相小珠，化學(xué)水解液為0.1摩爾濃度鹽酸，6摩爾濃度鹽酸胍；E)以1∶200～400摩爾比加入溴化氰分解融合蛋白釋放重組胰高血糖素樣多肽-1類似物；收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱進行脫鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟A中，所述的固相小珠為Affi-Gel10膠凝體。
9.權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣多肽-1類似物在制備用于治療2型糖尿病的緩釋藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述緩釋藥物的原型為蛋白載體—連結(jié)體—胰高血糖素樣多肽-1類似物；所述蛋白載體為人白蛋白或者其他人血液蛋白；所述連結(jié)體具有如下氨基酸序列Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-Yaa6-Yaa7其中Yaa1Cys或缺失；Yaa2Phe或Leu或缺失；Yaa3Asn或Val或缺失；Yaa4Pro或缺失；Yaa5Arg或缺失；Yaa6Gly或Pro或Ala或缺失；Yaa7Ser或Pro或Ala或缺失。
全文摘要
本發(fā)明公開了胰高血糖素樣多肽－1類似物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了在第5位，第6位，第8位，第34位，第35位和/或在第37位進行修飾后的胰高血糖素樣多肽－1類似物。本發(fā)明提供了該多肽的化學(xué)制備和分離方法和通過采用重組DNA技術(shù)制備與純化該多肽方法。該多肽在臨床上可用于治療2型糖尿病和肥胖癥。本發(fā)明還提供了該多肽用于制備治療2型糖尿病的緩釋藥物的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/09GK1786031SQ20051010236
公開日2006年6月14日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者李弘劍, 周天鴻, 蘇正定 申請人:暨南大學(xué)