專利名稱：：一個(gè)來(lái)源于棉花的基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于棉花的植物基因啟動(dòng)子及其在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物細(xì)胞壁主要由多糖組成，它能夠抵抗病原菌的侵入，并在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起重要作用。在雙子植物中，20％的初生細(xì)胞壁由多糖一木葡聚糖組成(DarvillAG，McNeilM，AlbersheimP，DelmerDP.Theprimarycellwallsoffloweringplants.InTolbertN，editor.TheBiochemistryofPlants，Vol.1.AcademicPress，NewYork1980.p.91-162.)。木葡聚糖以β-1，4-葡聚糖為骨架，木糖及木糖-半乳糖-墨角藻糖為側(cè)鏈而組成(HayashiT.Xyloglucansintheprimarycellwall.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol1989；40139-68.)。參與木葡聚糖生物合成的主要酶類可根據(jù)供體、受體以及連接鍵的不同而分成不同的家族。特異的轉(zhuǎn)移酶催化糖基加到木聚糖骨架上形成側(cè)鏈，這些酶包括木糖轉(zhuǎn)移酶、半乳糖轉(zhuǎn)移酶和墨角藻糖轉(zhuǎn)移酶等A，ChilesheC，SterlingJ，MaclachanG.Xyloglucangalactosyl-andfucosyltransferaseactivitiesfrompeaepicotylmicrosomes.PlantPhysiol1997114245-54.)。在細(xì)胞壁半纖維素多糖的生物合成中起重要作用的一類酶被稱為可逆糖基化蛋白(RGPs)，它可能是作為轉(zhuǎn)移一個(gè)單糖殘基到受體分子的中間體而起作用(DhuggaKS，TiwariSC，RayPM.Areversiblyglycosylatedpolypeptide(RGP1)possiblyinvolvedinplantcellwallsynthesispurification，genecloning，andtrans-Golgilocalization.ProcNatlAcadSciUSA1997947679-84.)。最近，從不同的植物品種中分離到一些RGP基因，這些植物包括豌豆、擬南芥、馬鈴薯、小麥、水稻和棉花(ZhaoGR，LiuJY.IsolationofacottonRGPgeneahomologofreversiblyglycosylatedpolypeptidehighlyexpressedduringfiberdevelopment.BiochimBiophysActa20021574370-4.)。研究表明RGPs蛋白為可溶性蛋白或者膜蛋白，定位于高爾基體內(nèi)，可以與UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-半乳糖以可逆的方式結(jié)合，并具有底物特異性。在其糖基化作用中各組分的穩(wěn)定比例大約是10∶7∶3(UDP-葡萄糖∶UDP-木糖∶UDP-半乳糖)，這與典型的木葡聚糖中這些糖的組成比例相似(1.0∶0.75∶0.25)。有研究表明一個(gè)來(lái)自豌豆的RGP1蛋白參與了木葡聚糖的生物合成(DhuggaKS，TiwariSC，RayPM.Areversiblyglycosylatedpolypeptide(RGP1)possiblyinvolvedinplantcellwallsynthesispurification，genecloning，andtrans-Golgilocalization.ProcNatlAcadSciUSA1997；947679-84.)，這個(gè)40kD的二聚體蛋白可以在Mn2+或Mg2+的參與下，將放射性的UDP-葡萄糖(UDP-glucose)糖基化(DhuggaKS，UlvskovP，GallagherSR，RayPM.PlantpolypeptidesreversiblyglycosylatedbyUDPglucose.PossiblecomponentsofGolgibeta-glucansynthaseinpeacells.JBiolChem1991；26621977-84.)。此外，RGP蛋白還可在細(xì)胞壁或者淀粉的合成過(guò)程中起作用(LangeveldSMJ，VennikM，KottenhagenM，vanWijkEL，BuijkA，KijneJW，dePaterS.Glucosylationactivityandcomplexformationoftwoclassesofreversiblyglycosylatedpolypeptides.PlantPhysiol2002；129278-89.)。RGP蛋白僅雙子葉和單子葉植物中存在，在非植物系統(tǒng)中不存在，為植物所特有。據(jù)報(bào)道RGP基因在許多植物品種中具有器官特異性和發(fā)育依賴性的表達(dá)特征。例如，擬南芥AtRGP1基因在根中比莖中更豐富(DelgadoIJ，WangZ，RocherAde，KeegstraK，RaikhelNV.CloningandcharacterizationofAtRGP1.AreversiblyautoglycosylatedArabidopsisproteinimplicatedincellwallbiosynthesis.PlantPhysiol1998；161339-50.)，而棉花GhRGP1基因則在棉纖維細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并且在初生細(xì)胞壁的延伸期及次生細(xì)胞壁的加厚期高水平表達(dá)(ZhaoGR，LiuJY.IsolationofacottonRGPgeneahomologofreversiblyglycosylatedpolypeptidehighlyexpressedduringfiberdevelopment.BiochimBiophysActa2002；1574370-4.)。上述研究表明該類基因可能參與了植物重要的生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控。但至今未見(jiàn)對(duì)其啟動(dòng)子的報(bào)道。植物RGP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以通過(guò)分析其啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)行研究，同時(shí)也將為理解RGP基因的生物學(xué)功能提供重要的依據(jù)。另一方面，組織和發(fā)育特異基因啟動(dòng)子及其調(diào)控元件是進(jìn)行植物遺傳工程改良的重要驅(qū)動(dòng)元件。早期的研究表明數(shù)量眾多的mRNA在棉花纖維細(xì)胞的早期發(fā)育中轉(zhuǎn)錄，其中的一部分重要基因已已波成功分離(JiSJ，LuYC，F(xiàn)engJX，WeiG，LiJ，ShiYH，F(xiàn)uQ，LiuD，LuoJC，ZhuYX.IsolationandanalysesofgenespreferentiallyexpressedduringearlycottonfiberdevelopmentbysubtractivePCRandcDNAarray.NuclAcidsRes2003；312534-43.)。例如，一個(gè)在棉花纖維細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的FbL2A基因已被鑒定，并且它的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)異源基因在轉(zhuǎn)基因棉花的纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，受發(fā)育調(diào)控(RinehartJA，PetersenMW，JohnME.Tissue-specificanddevelopmentalregulationofcottongeneFbL2A.Demonstrationofpromoteractivityintransgenicplants.PlantPhysiol1996；1121331-1341.)。棉花纖維是單細(xì)胞的表皮毛，是由胚珠的表皮細(xì)胞經(jīng)極性伸長(zhǎng)形成。由于棉花再生體系的困難，一些研究小組采用模式植物煙草(HsuCY，CreechRG，JenkinsJN，MaDP.AnalysisofpromoteractivityofcottonlipidtransferproteingeneLTP6intransgenictobaccoplants.PlantSci1999；14363-70.)或擬南芥(KimHJ，TriplettBA.Cottonfibergrowthinplantaandinvitromodelsforplantcellelongationandcellwallbiogenesis.PlantPhysiol2001；1271361-6.)來(lái)對(duì)棉花纖維特異性表達(dá)啟動(dòng)子進(jìn)行分析，其研究結(jié)果表明GUS報(bào)告基因完全可以像在其它組織中一樣在表皮毛中表達(dá)。研究表明擬南芥的表皮毛發(fā)育涉及一系列基因，如TRY、MYB、TTG1及GL2基因(GloverBJ.Differentiationinplantepidermalcells.JExpBot2000；51497-505.)。其中的MYB和GL2編碼轉(zhuǎn)錄因子，能特異性地與MYB元件及L1-box(TAAATGCA)結(jié)合，調(diào)控表皮毛的發(fā)育。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到各種脅迫如傷害、病原菌侵染、激發(fā)子和吞食作用等的影響，植物會(huì)在脅迫作用位點(diǎn)建立起一套防御系統(tǒng)來(lái)保護(hù)自身免受進(jìn)一步的傷害。主動(dòng)防御的第一防線是在這些受刺激處的細(xì)胞壁快速合成脅迫應(yīng)答蛋白質(zhì)。一般認(rèn)為在受傷害的位點(diǎn)快速合成的蛋白可以加強(qiáng)和修復(fù)細(xì)胞壁，結(jié)果有效地限制了病原物的擴(kuò)散。因此細(xì)胞壁蛋白會(huì)在植物防御及傷害修復(fù)方面起重要的作用(KieliszewskiMJ，LamportDTA.Extensinrepetitivemotifsfunctionalsitesposttranslationalcodesandphylogeny.PlantJ1994；5157-72.)。最新研究發(fā)現(xiàn)在受到機(jī)械和張力脅迫的位點(diǎn)，來(lái)自煙草(Nicotianaplumbaginifolia)和油菜(Brassicanapus)的細(xì)胞壁基因extensins被誘導(dǎo)表達(dá)(TireC，DeRyckeR，DeLooseM，InzeD，VanMontaguM，EnglerG.ExtensingeneexpressionisinducedbymechanicalstimulileadingtolocalcellwallstrengtheninginNicotianaplumbaginifolia.Planta1994；195175-81.)就是一個(gè)很好的說(shuō)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個(gè)植物基因啟動(dòng)子，在自然狀態(tài)下它是棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子。本發(fā)明所提供的棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子，名稱為pGhRGP1，來(lái)源于陸地棉(Gossypiumhirsutum)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下洗膜。序列表中的SEQID№1由624個(gè)堿基組成。自5’端第575位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；自5’端第473-476位堿基為CAAT盒；自5’端第529-532位堿基為TATA框；自5’端第501-506位堿基為G-box；自5’端第415-419位堿基為W-box；自5’端第66-71位，第217-222位堿基為E-box；自5’端第507-574位堿基為富含堿基C的區(qū)域；自5’端第448-455位堿基為張力(tensilestress)脅迫的負(fù)調(diào)控元件(NRR)；自5’端第173-181位堿基為植物激素應(yīng)答元件(HORE)；自5’端第113-119位，第483-492位堿基為種子特異表達(dá)的調(diào)控元件；自5’端第8-12位，第203-207位，第395-399位堿基為根特異表達(dá)的調(diào)控元件；自5’端第566-572位堿基為bZIP轉(zhuǎn)錄因子DPBF結(jié)合的核心序列。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增pGhRGP1中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供了棉花GhRGP1的啟動(dòng)子pGhRGP1，煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明pGhRGP1能賦予GUS報(bào)告基因在植物幼根和雌蕊中高水平表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因煙草可響應(yīng)干旱和傷害脅迫。pGhRGP1在模式植株中的時(shí)空表達(dá)特征表明GhRGP1在細(xì)胞伸長(zhǎng)、花器官發(fā)育及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，pGhRGP1的功能研究可為揭示GhRGP1的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了線索。此外，pGhRGP1還可應(yīng)用于植物(包括單子葉和雙子葉植物，尤其是棉花)的品質(zhì)及抗性的基因工程改良中，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。圖1為pBI-pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時(shí)期GUS活性的組織化學(xué)分析結(jié)果圖2為生長(zhǎng)4周的轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS報(bào)告基因的定量分析結(jié)果圖3為檢測(cè)含GhRGP1啟動(dòng)子pGhRGP1的4周大轉(zhuǎn)基因煙草植株(黑色柱狀線)對(duì)各種非生物脅迫的響應(yīng)的結(jié)果圖4為經(jīng)傷害處理處理的pBI-pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織的GUS活性組織化學(xué)染色結(jié)果具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海生工合成，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子pGhRGP1的克隆及序列分析一、棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子pGhRGP1的克隆參照Paterson等的方法(PatersonAH，BrubakerCL，WendelJF.Arapidmethodforextractioncotton(Gossypiumspp.)GenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep1993；11122-7.)提取棉花(Gossypiumhirsutumcv.CRI12)葉片的核基因組DNA，分別用限制性內(nèi)切酶XbaI、HindIII、DraI對(duì)所提取的核基因組DNA進(jìn)行酶解。然后用染色體步行法克隆棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子序列。采用clontech公司的GenomeWalkerTM試劑盒并按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，具體方法為首先將上述經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶酶解后產(chǎn)生的不同長(zhǎng)度的DNA片段連接各自相應(yīng)的接頭，得到帶有接頭的基因組DNA文庫(kù)；然后以含有接頭的基因組DNA文庫(kù)作為模板，在外側(cè)接頭引物AP15’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’和外側(cè)基因特異引物GSP15’-ATGAGATGGTAAGGCTGGAAAAAG-3’的引導(dǎo)下，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在內(nèi)側(cè)接頭引物AP25’-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3’和內(nèi)側(cè)基因特異引物GSP25’-ACAGAGGAGTTGGAGAGACGGTCG-3’的引導(dǎo)下，進(jìn)行第二輪的PCR擴(kuò)增。第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用Qiagen公司的DNA回收試劑盒III回收并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片段連接至載體pGEM-TEasy(Promega公司)中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，用Qiagen公司的QIAprepSpinMiniProp試劑盒對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行純化后，用ABIPRISMTM377DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果以XbaI酶解的棉花核基因組DNA片段庫(kù)為模板，經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增后，獲得一個(gè)長(zhǎng)度為624bp的DNA片段，具有序列表中SEQID№1的DNA序列。與已克隆的GhRGP1的cDNA序列進(jìn)行比較，結(jié)果該624bp的DNA片段含有GhRGP1cDNA序列5’端非編碼區(qū)的50個(gè)核苷酸，即5’端非編碼區(qū)部分重疊，表明所克隆到的長(zhǎng)度為624bp的DNA片段就是目標(biāo)基因GhRGP1的啟動(dòng)子序列，將該啟動(dòng)子命名為pGhRGP1。而將上述含有pGhRGP1的重組載體命名為pGEM-TEasy-pGhRGP1。將用5’-RACE法擴(kuò)增分離到的GhRGP1cDNA序列的第一個(gè)堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，即序列表中SEQID№1自5’端的第575位堿基。二、pGhRGP1的序列分析用PLACE(HigoK，UgawaY，IwamotoM，KorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA-elements(PLACE).NuclAcidsRes1999；27297-300.)和PlantCARE(LescotM，DéhaisP，ThijsG，MarchalK，MoreauY，VandePeerY，RouzéP，RombautsS.PlantCARE，adatabaseofplantcis-actingregulatoryelementsandaportaltotoolsforinsilicoanalysisofpromotersequences.NuclAcidsRes2002；30325-7.)軟件對(duì)棉花可逆糖基化蛋白基因GhRGP1的啟動(dòng)子pGhRGP1的核苷酸序列(序列表中的SEQID№1)進(jìn)行序列分析。用上述軟件對(duì)GhRGP1基因啟動(dòng)子pGhRGP1中的順式作用元件進(jìn)行搜索、預(yù)測(cè)，結(jié)果該啟動(dòng)子中含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列。其中，自5’端第473-475位堿基為CAAT盒；自5’端第529-532位堿基為TATA框。自5’端第501-506位堿基為G-box，被認(rèn)為涉及傷害、紫外線或MeJA(甲基茉莉酸)的響應(yīng)反應(yīng)(Droge-LaserW，KaiserA，LindsayWP，HalkierBA，LoakeGJ，DoernerP，DixonRA，LambC.Rapidstimulationofasoybeanprotein-serinekinasethatphosphorylatesanovelBzipDNA-bindingprotein，G/HBF-1，duringtheinductionofearlytranscription-dependentdefenses.EMBOJ1997；16726-38.；WilliamsME，F(xiàn)osterR，ChuaNH.SequencesflankingthehexamericG-boxcoreCACGTGaffectthespecificityofproteinbinding.PlantCell1992；4485-96.)。自5’端第415-419位堿基為W-box，被認(rèn)為在糖誘導(dǎo)的信號(hào)途徑或/和傷害誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中起作用(SunC，PalmqvistS，OlssonH，BorenM，AhlandsbergS，JanssonC.AnovelWRKYtranscriptionfactor，SUSIBA2，participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugar-responsiveelementsoftheisolpromoter.PlantCell2003；152076-92.；NishiuchiT，ShinshiH，SuzukiK.RapidandtransientactivationoftranscriptionoftheERF3genebywoundingintobaccoleaves.JBiolChem2004；27955355-61.)。自5’端第66-71位，第217-222位堿基為E-box，被認(rèn)為參與干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)反應(yīng)(AbeH，UraoT，ItoT，SekiM，ShinozakiK，Yamaguchi-ShinozakiK.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell2003；1563-78.)。自5’端第507-574位堿基為富含堿基C的區(qū)域(C-rich)，它可能起H-box(CCTACC)的作用，而H-box可能與病原菌侵染引起的基因激活有關(guān)，并且H-box和G-box經(jīng)常成對(duì)出現(xiàn)來(lái)響應(yīng)脅迫刺激(Droge-LaserW，KaiserA，LindsayWP，HalkierBA，LoakeGJ，DoernerP，DixonRA，LambC.Rapidstimulationofasoybeanprotein-serinekinasethatphosphorylatesanovelBzipDNA-bindingprotein，G/HBF-1，duringtheinductionofearlytranscription-dependentdefenses.EMBOJ1997；16726-38.)。此外，據(jù)報(bào)道一個(gè)G-box和一個(gè)C-rich在大豆vspB基因啟動(dòng)子中對(duì)MeJA和傷害產(chǎn)生響應(yīng)反應(yīng)(MasonHS，DeWaldDB，MulletJE.Identificationofamethyljasmonate-responsivedomaininthesoybeanvspBpromoter.PlantCell1993；5241-51.)。自5’端第448-455位堿基為張力(tensilestress)脅迫的負(fù)調(diào)控元件(NRR)。自5’端第173-181位堿基為植物激素應(yīng)答元件(HORE)，它調(diào)節(jié)對(duì)植物激素脫落酸(ABA)的不同反應(yīng)(HimmelbachA，HoffmannT，LeubeM，HohenerB，GrillE.HomeodomainproteinATHB6isatargetoftheproteinphosphataseABI1andregulateshormoneresponsesinArabidopsis.EMBOJ2002；213029-38.)。自5’端第113-119位，第483-492位堿基為種子特異表達(dá)的調(diào)控元件(WuC，WashidaH，OnoderaY，HaradaK，TakaiwaF.QuantitativenatureoftheProlamin-box.ACGTandAACAmotifsinariceglutelingenepromoterminimalcis-elementrequirementsforendosperm-specificgeneexpression.PlantJ2000；23415-21.)。自5’端第8-12位，第203-207位，第395-399位堿基為根特異表達(dá)的調(diào)控元件(ElmayanT，TepferM.EvaluationintobaccooftheorganspecificityandstrengthoftherolDpromoter，domainAofthe35Spromoterandthe35S2promoter.TransgenicRes1995；4388-96.)；而自5’端第566-572位堿基為bZIP轉(zhuǎn)錄因子DPBF結(jié)合的核心序列(DPBFBS)，這是一個(gè)胚胎特異表達(dá)、能被ABA誘導(dǎo)并對(duì)干旱脅迫作早期響應(yīng)的元件(KimHJ，TriplettBA.Cottonfibergrowthinplantaandinvitromodelsforplantcellelongationandcellwallbiogenesis.PlantPhysiol2001；1271361-6.)。GhRGP1啟動(dòng)子pGhRGP1的序列分析結(jié)果表明GhRGP1基因在棉纖維的發(fā)育和脅迫誘導(dǎo)過(guò)程中受復(fù)雜因素的調(diào)控。實(shí)施例2、檢測(cè)pGhRGP1在轉(zhuǎn)基因煙草中的活性一、含有pGhRGP1和GUS基因的煙草表達(dá)載體pBI-pGhGal1::GUS的構(gòu)建為檢測(cè)GhRGP1啟動(dòng)子pGhRGP1在轉(zhuǎn)基因煙草中的活性，現(xiàn)構(gòu)建含有pGhRGP1和GUS基因的煙草表達(dá)載體，具體方法為以實(shí)施例1構(gòu)建的含有pGhRGP1的重組載體pGEM-TEasy-pGhRGP1為模板，在正向引物1(5’-CAAGCTTTCTAGATATATTTCAGTTACC-3’，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII的識(shí)別位點(diǎn))和反向引物2(5’-CGGATCCTGGAGAAAAACTTGGACTTTTC-3’，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增pGhRGP1，并在序列兩段分別添加上限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化約624bp的目的片段，對(duì)回收片段用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pBI121(Clontech公司)連接，將pGhRGP1取代載體pBI121中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，并位于GUS報(bào)告基因的上游，得到含有pGhRGP1和GUS基因的煙草表達(dá)載體，命名為pBI-pGhGal1::GUS。同時(shí)，以含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子和GUS基因(35S::GUS)的載體pBI121作為陽(yáng)性對(duì)照，以不含啟動(dòng)子、僅含有GUS報(bào)告基因(promoterless::GUS)的載體pBI101(Clontech公司)作為陰性對(duì)照。二、將煙草表達(dá)載體pBI-pGhGal1::GUS轉(zhuǎn)化煙草將步驟一構(gòu)建的雙元植物表達(dá)載體載體pBI-pGhRGP1::GUS，陽(yáng)性對(duì)照pBI121和陰性對(duì)照pBI101分別通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)篩選得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，再用葉盤法將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化煙草(N.tabacumcv.shangxi)。將轉(zhuǎn)化植株在含有500mg/L羧芐青霉素和150mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選。3周后，從葉盤的邊緣產(chǎn)生卡那霉素抗性芽，然后將抗性芽轉(zhuǎn)移至MS生根培養(yǎng)基中，獲得卡那霉素抗性小苗。根據(jù)GUS基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)部引物(正向引物35’-CTCATTACGGCAAAGTGTGGG-3’和反向引物45’-GTGCACCATCAGCACGTTATCG-3’)，以卡那霉素抗性小苗的基因組DNA為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到665bp擴(kuò)增片段，表明GUS報(bào)告基因已整合進(jìn)再生苗。篩選陽(yáng)性T0代植株，在25℃、16h光照/8h黑暗的溫室內(nèi)培植、開(kāi)花、結(jié)籽。三、GUS活性的組織化學(xué)定位分析和熒光定量測(cè)定取步驟二在溫室中生長(zhǎng)3d和4周的pBI-pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的幼苗，將轉(zhuǎn)基因煙草的不同組織分別置于研缽中加入液氮研磨成勻漿。然后將勻漿懸浮于GUS提取緩沖液(含50mMNa3PO4緩沖液(pH7.0)，0.1％TritonX-100，10mMβ-巰基乙醇，10mM1，2-diaminocyclohexane-N，N，N，N-tetraaceticacid以及0.1％月桂酸鈉)中，在12,000g、4℃離心10min后收集上清。參考Jefferson等的熒光組織化學(xué)定位法(JeffersonRA，KavanaghTA，BevanMW.GUSfusionsp-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ1987；63901-7.)測(cè)定GUS活性，具體方法為將待測(cè)上清樣品在含0.5％多聚甲醛的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中固定30min，然后置于GUS反應(yīng)液(含0.1mol/LNaPO4緩沖液(pH7.0)，10mmol/LEDTA，5mmol/L鐵氰化鉀，1.0mmol/LX-gluc及0.1％TritonX-100)中3-12h，直至著色達(dá)到足夠強(qiáng)度，再將光合組織用70-100％系列乙醇脫色以去掉葉綠素，最后用尼康8700相機(jī)(Nikon公司)或體視鏡(Leica公司)照相，進(jìn)行觀察。GUS熒光的定量測(cè)定方法為參昭Bradford的方法(BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalBiochem1976；72248-54.)對(duì)提取液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃度定量，用牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分鐘產(chǎn)生的pmol4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)為單位。GUS活性數(shù)據(jù)是5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定值的平均值。收集的樣品可置于液氮中速凍，于-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ＩL(zhǎng)3d的轉(zhuǎn)基因煙草不同組織中GUS活性的熒光組織化學(xué)定位法檢測(cè)結(jié)果如圖1中的A和B所示，轉(zhuǎn)基因植株根部GUS染色主要集中于根分生組織區(qū)和根毛區(qū)，根尖沒(méi)有GUS著色(圖1中的A圖，長(zhǎng)度＝1mm，rh根毛)；當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至4周時(shí)，GUS著色出現(xiàn)在莖部維管束組織(圖1中的B圖，長(zhǎng)度＝1mm，va維管束)，葉柄的木質(zhì)部、韌皮部和表皮層(圖片未顯示)。由于熒光組織化學(xué)分析不能給出報(bào)告基因的量化指標(biāo)，因而用上述方法對(duì)生長(zhǎng)4周的轉(zhuǎn)基因煙草(圖2中的A圖)的根(rt)、莖(st)和葉(lf)中的GUS報(bào)告基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖2中的C圖(長(zhǎng)度＝3mm，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤差值表示)所示，GUS活性主要存在于轉(zhuǎn)基因煙草的根部，在葉片中的含量非常低。其中根中的GUS含量分別比莖和葉中高1.13倍和6.65倍。上述結(jié)果與擬南芥中AtRGP1蛋白表達(dá)的免疫雜交分析結(jié)果相一致，即最高水平的AtRGP1蛋白表達(dá)于根部，其次是莖部，根部表達(dá)量最低(DelgadoIJ，WangZ，RocherAde，KeegstraK，RaikhelNV.CloningandcharacterizationofAtRGP1.AreversiblyautoglycosylatedArabidopsisproteinimplicatedincellwallbiosynthesis.PlantPhysiol1998；161339-50.)。該結(jié)果也與GhRGP1RNA的點(diǎn)雜交分析結(jié)果相一致，GhRGP1更易在根中檢測(cè)到(ZhaoGR，LiuJY，DuXM.MolecularcloningandcharacterizationofcottoncDNAsexpressedindevelopingfibercells.BiosciBiotechBioch2001；652789-93.)。pGhRGP1自5’端第8-12位，第203-207位，第395-399位堿基為根特異表達(dá)的調(diào)控元件，推斷它們與GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的根部強(qiáng)表達(dá)有關(guān)。由于GhRGP1能在花器官中表達(dá)，因而在生殖生長(zhǎng)階段，對(duì)pBI-pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草花的各個(gè)器官也進(jìn)行了GUS活性測(cè)定。熒光組織化學(xué)定位法檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(圖1中的C圖表示GUS染色集中在成熟轉(zhuǎn)基因煙草花梗表皮毛的腺體狀細(xì)胞中，長(zhǎng)度＝1mm，tr表皮毛；圖1中的D圖表示GUS在花柱頭的表皮層著色，長(zhǎng)度＝300um；圖1中的E圖表示雌蕊的縱切面，長(zhǎng)度＝300um，GUS主要在運(yùn)輸組織中著色，而不是外皮層，tt運(yùn)輸組織，co皮層；圖1中的F圖表示柱頭的橫切面，長(zhǎng)度＝300um，GUS仍然在運(yùn)輸組織中著色，ep表皮；圖1中的G圖表示GUS在花粉囊上著色，長(zhǎng)度＝1mm，an花粉囊；圖1中的H圖表示GUS在花粉粒中著色，長(zhǎng)度＝50um，po花粉粒；圖1中的I圖表示開(kāi)花當(dāng)天(ODAF)子房縱切面，長(zhǎng)度＝3mm；圖1中的J圖表示開(kāi)花后5天(5DAF)子房，長(zhǎng)度＝3mm；圖1中的K圖表示開(kāi)花后10天(10DAF)子房橫切面，長(zhǎng)度＝3mm)，GUS在柱頭、花絲、花粉囊、花粉、種子和表皮毛中高水平表達(dá)，但在成熟葉片或負(fù)對(duì)照(pBI101的轉(zhuǎn)基因植株)花瓣中對(duì)照花中沒(méi)有任何GUS著色(圖1中的L圖，長(zhǎng)度＝3mm)。對(duì)上述成熟轉(zhuǎn)基因植株的花器官(圖2中的B圖，花粉囊(an)、柱頭(sti)、花絲(sty)、萼片(se)、花瓣(pet)、子房(ov)、花托(re)和花梗(ped))進(jìn)行GUS活性定量分析，結(jié)果如圖2中的C圖所示，結(jié)果在雌蕊中(柱頭和花絲)表達(dá)水平最高，在花粉囊、花托和花梗中次之，而在萼片、花瓣和子房中最低。其中，在柱頭和花絲中GUS的平均活性相似，至少高于葉片23.97倍，高于子房17.60倍。暗示GhRGP1啟動(dòng)子pGhRGP1能指導(dǎo)報(bào)告基因在花雌蕊(不含子房)中高效表達(dá)。據(jù)報(bào)道通過(guò)RNA雜交試驗(yàn)已經(jīng)證明GhRGP1在棉花纖維發(fā)育的延長(zhǎng)期和幼根中高水平表達(dá)，在種子、胚珠和花中表達(dá)水平相對(duì)較低(ZhaoGR，LiuJY.IsolationofacottonRGPgeneahomologofreversiblyglycosylatedpolypeptidehighlyexpressedduringfiberdevelopment.BiochimBiophysActa2002；1574370-4.)。與棉花中的雜交結(jié)果相吻合，GhRGP1啟動(dòng)子pGhRGP1指導(dǎo)報(bào)告基因除在以上部位表達(dá)外，還在花的雌蕊和花粉中高表達(dá)。在陰性對(duì)照的相應(yīng)部位末能檢測(cè)到任何GUS活性(圖片末顯示)。與GUS活性相一致，該啟動(dòng)子pGhRGP1區(qū)域含有幾個(gè)重要的與種子和胚胎特異表達(dá)相關(guān)的元件，如自5’端第113-119位，第483-492位堿基的種子特異表達(dá)的調(diào)控元件和自5’端第566-572位堿基的bZIP轉(zhuǎn)錄因子DPBF結(jié)合元件(WuC，WashidaH，OnoderaY，HaradaK，TakaiwaF.QuantitativenatureoftheProlamin-box，ACGTandAACAmotifsinariceglutelingenepromoterminimalcis-elementrequirementsforendosperm-specificgeneexpression.PlantJ2000；23415-21.)。此外，柱頭和花絲中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被認(rèn)為主要含有一些分泌物質(zhì)，如單糖、多糖、氨基酸、糖蛋白、糖脂和阿拉伯半乳糖蛋白類(AGP)等(CheungAY，WangH，WuHM.Afloraltransmittingtissue-specificglycoproteinattractspollentubesandstimulatestheirgrowth.Cell1995；82383-93.)。雌蕊胞外基質(zhì)中這些豐富物質(zhì)可能會(huì)作為花粉管在運(yùn)輸組織中生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)或起合成作用的底物(LordEM，SandersLC.Rolesfortheextracellularmatrixinplantdevelopmentandpollinationaspecialcaseofcellmovementinplants.DevBiol1992；15316-28.)。因而在運(yùn)輸組織中GhRGP1基因的高水平表達(dá)可能與細(xì)胞的伸長(zhǎng)生理需要相關(guān)。本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果證明pGhRGP1啟動(dòng)子能指導(dǎo)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因煙草的表皮毛中表達(dá)，并且含有一些特異性的與表皮毛形態(tài)建成相關(guān)的一些元件。如一個(gè)TAAATACA序列(自5’端第247-254位堿基)，一個(gè)反向互補(bǔ)序列TGCAATTA序列(自5’端第171-178位堿基)以及一個(gè)CAGTTA序列(MYB元件之一，自5’端第14-19位堿基)，它們與L1-box和MYB元件相似。用熒光組織化學(xué)定位法和定量分析GUS活性的結(jié)果表明，pGhRGP1指導(dǎo)報(bào)告基因在煙草發(fā)育過(guò)程中具有不同的時(shí)空表達(dá)特征。實(shí)施例3、檢測(cè)pGhRGP1轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)非生物脅迫的影響取在溫室中生長(zhǎng)4周的T1代pBI-pGhGal1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草，做下述脅迫處理1)傷害處理(Wo)，經(jīng)轉(zhuǎn)基因煙草植株的莖和從頂端向下的第4張葉片及其周圍的莖用刀片劃傷，然后將它們浸在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中，24小時(shí)后進(jìn)行GUS染色和活性分析(NishiuchiT，HamadaT，KodamaH，IbaK.WoundingchangesthespatialexpressionpatternoftheArabidopsisplastidw-3fattyaciddesaturasegene(FAD7)throughdifferentsignaltransductionpathways.PlantCell1997；91701-12.)；2)脫水脅迫(干旱，Deh)處理，將整個(gè)植株置于15cm培養(yǎng)皿中讓水分慢慢蒸發(fā)，直至重量下降大約25％(StockingerEJ，GilmourSJ，ThomashowMF.ArabidopsisthaiianaCBF1encodesanAP2domain-containingtranscriptionalactivatorthatbindstotheC-repeat/DRE，acis-actingDNAregulatoryelementthatstimulatestranscriptioninresponsetolowtemperatureandwaterdeficit.ProcNatlAcadSciUSA1997；941035-40.)；3)其它非生物脅迫處理，將整個(gè)植株分別置于下列水溶液中200mM蔗糖(Suc)、200mM葡萄糖(Glu)、5μM生長(zhǎng)素(IAA)、5μM赤霉素(GA)、50μM脫落酸(ABA)和2mM乙烯(ETH)，放在25℃的培養(yǎng)箱中處理24h，然后測(cè)定GUS活性，水溶液被設(shè)為對(duì)照(CK)，所有GUS活性數(shù)據(jù)是5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定值的平均值±SE(標(biāo)準(zhǔn)誤)。檢測(cè)經(jīng)上述脅迫處理的植株中GUS報(bào)告基因的活性(以含GhRGP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株水溶液處理的GUS活性作為100％，每個(gè)相對(duì)活性值為5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因植株測(cè)定的平均比值，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤表示)，結(jié)果如圖3所示(pBI101轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照(白色柱狀線))，經(jīng)干旱處理植株的平均GUS活性是水處理對(duì)照的1.76倍；ABA處理同樣也增加了植株的GUS活性，其活性比對(duì)照高31％。而經(jīng)IAA，GA和乙烯處理，沒(méi)有引起GUS報(bào)告基因活性的顯著變化，E-box和DPBF結(jié)合序列的存在說(shuō)明了pGhRGP1可能參與了干旱脅迫響應(yīng)。更進(jìn)一步，GUS染色結(jié)果顯示著色在花粉囊和花粉(圖2)，表明其成熟過(guò)程也有一個(gè)脫水過(guò)程(LushWM，SpurckT，JoostenR.Pollentubeguidancebythepistilofasolanaceousplant.AnnBot2000；85(SupplementA)39-47.)。同時(shí)存在一個(gè)植物激素(ABA)響應(yīng)元件(HORE，自5’端第173-181位堿基)，ABA參與了許多生理過(guò)程，包括對(duì)干旱的響應(yīng)(ShinozakiK，Yamaguchi-ShinozakiK.MolecularresponsestodehydrationandlowtemperatureDifferencesandcross-talkbetweentwostresssignalingpathways.CurrOpinPlantBiol2000；3217-23.)。推測(cè)GhRGP1基因可能在棉花纖維的發(fā)育過(guò)程中也與干旱(脫水)作用相關(guān)。此外，用葡萄糖處理比用蔗糖處理有更好的作用效果，可能的原因之一是葡萄糖比蔗糖更容易變成RGPs蛋白的反應(yīng)底物之一UDP-葡萄糖(UDP-glucose)。因?yàn)镽GPs蛋白可以可逆地結(jié)合UDP-glucose、UDP-xylose和UDP-galactose，而與UDP-glucose的結(jié)合能被UDP-xylose和UDP-galactose抑制，并且穩(wěn)定的糖基化比例大約是10∶7∶3(UDP-Glc/-Xyl/-Gal)(DhuggaKS，TiwariSC，RayPM.Areversiblyglycosylatedpolypeptide(RGP1)possiblyinvolvedinplantcellwallsynthesispurification，genecloning，andtrans-Golgilocalization.ProcNatlAcadSciUSA1997；947679-84.)，表明GhRGP1基因可能受不同種類的糖不同程度地調(diào)節(jié)。實(shí)施例4、檢測(cè)啟動(dòng)子pGhRGP1對(duì)傷害脅迫的響應(yīng)特性檢測(cè)GhRGP1啟動(dòng)子是否含有傷害誘導(dǎo)表達(dá)的特性，方法為對(duì)pBI-pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因T1代煙草植株用實(shí)施例3的方法進(jìn)行傷害脅迫，然后測(cè)定莖部的GUS活性，以未經(jīng)脅迫處理的轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照，結(jié)果GUS活性明顯增加，平均的GUS活性比非誘導(dǎo)對(duì)照增加了1.09倍(圖3)；再對(duì)經(jīng)傷害脅迫處理和未經(jīng)傷害脅迫處理的轉(zhuǎn)基因植株的葉片組織進(jìn)行GUS化學(xué)染色并拍照，以經(jīng)傷害脅迫處理的pBI101轉(zhuǎn)基因煙草植株為陰性對(duì)照，以經(jīng)傷害脅迫處理的pBI121轉(zhuǎn)基因煙草植株為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如圖4所示(A和B為經(jīng)傷害脅迫處理的pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因植株的葉片，C為經(jīng)傷害脅迫處理的pBI101轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片，D為經(jīng)傷害脅迫處理的pBI121轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片)，GUS著色主要集中在pGhRGP1::GUS轉(zhuǎn)基因植株葉片傷害部位的周圍；在pBI101轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片中，沒(méi)有GUS著色；而在pBI121轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片中，整個(gè)葉片均被均勻著色。GhRGP1有3個(gè)和傷害誘導(dǎo)相關(guān)的元件，它們分別是W-box(自5’端第415-419位堿基)、G-box(自5’端第501-506位堿基)和一個(gè)和傷害/張力相關(guān)的負(fù)調(diào)控元件(NRR，自5’端第448-455位堿基)，另外還有一個(gè)富含C的區(qū)域與傷害有關(guān)(自5’端第507-574位堿基)。GUS的活性分析結(jié)果與該啟動(dòng)子中含傷害響應(yīng)元件相符。傷害誘導(dǎo)表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明GhRGP1參與了細(xì)胞壁的生物合成。序列表<160>1<210>1<211>624<212>DNA<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>1tctagatatatttcagttaccaatttgatcatactttataaagattaatttcgattatgg60ttattcaaatgtattctttataattttaatcctaataaattatgtaatttcaaacaaact120tacattaaaggttaacacactctctattatttttttccattaatatctaatgcaattatt180atcatcattcgtccctaaaaaaatattattatcattcaaatgctacaaaaattaattttt240gaatagtaaatacacgtatattgaaaattaatgaaaaaataatggtgtagtttgaactca300ttaattaaaaaataatgaaatttataatttaatttattaaacgaatttttcatcaaatat360agaaaggatttaaaagcatagtatgaaaaaatagatatttttatgcaaattaaatgactt420ccccaaaagaacatgacacaatgaatctagtggatgtgttttccatactttccaattaaa480acgccacctcatttactttgcacgtgccacccatgctctttcctcccctatacaaacccc540ccatttccccctttcctcccctctcacactcgaccttccatcccctctccctgctttgct600ctgaaaagtccaagtttttctcca62權(quán)利要求1.一種植物基因啟動(dòng)子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子具有序列表中SEQID№1的DNA序列。3.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體。4.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的宿主菌。6.權(quán)利要求1所述的棉花基因啟動(dòng)子在植物品質(zhì)改良及植物抗性改良中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為棉花。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)植物基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子除了在基因的功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究中將起到重要作用外，還可應(yīng)用于植物(包括單子葉和雙子葉植物，尤其是棉花)的品質(zhì)及抗性的基因工程改良中，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/63GK1763198SQ20051010243公開(kāi)日2006年4月26日申請(qǐng)日期2005年9月9日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者劉進(jìn)元,吳藹民申請(qǐng)人:清華大學(xué)