專利名稱：五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外臨床檢驗(yàn)和生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，確切地說(shuō)，是一種涉及待檢測(cè)者血液樣本處理和病毒檢測(cè)的基因微陣列產(chǎn)品及試劑盒。
背景技術(shù)：
肝炎是在世界范圍內(nèi)廣泛流行的嚴(yán)重危害人體健康甚至生命的嚴(yán)重疾病，目前主要分為甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎，其中乙肝、丙肝的流行性和對(duì)人類的危害最為嚴(yán)重。我國(guó)是世界上乙肝病毒感染最嚴(yán)重的國(guó)家，約有1.2億人為乙肝病毒攜帶者，占世界的三分之一，其中3000萬(wàn)為慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌，每年有30萬(wàn)人死于慢性肝病，其中約13萬(wàn)人為原發(fā)性肝癌患者。我國(guó)每年用于治療乙肝引起的慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接醫(yī)療耗費(fèi)高達(dá)300億元人民幣。丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播、由丙型肝炎病毒引起的嚴(yán)重肝臟疾病。全世界目前有1億丙型肝炎病毒攜帶者，中國(guó)約占四千萬(wàn)人。80％的丙型肝炎病毒攜帶者會(huì)患上慢性肝炎，其中約10-30％的病人將發(fā)展為肝硬化，5-10％的肝硬化患者可發(fā)展成肝癌。每年用于丙肝的醫(yī)療費(fèi)加上病人工作喪失的造成的損失超過(guò)6億美元。預(yù)計(jì)，2010年到2019年治療丙肝相關(guān)疾病的直接醫(yī)療費(fèi)用將超過(guò)130億美元。
一般講甲型肝炎預(yù)后比較好。甲型肝炎雖然起病急，但是只要及時(shí)確診，注意治療，病情會(huì)很快好轉(zhuǎn)，多數(shù)在起病后2周黃疸開始消退，消化道癥狀開始改善，大約經(jīng)過(guò)一個(gè)半月左右休息、治療，多數(shù)病人能恢復(fù)健康，不會(huì)像乙型肝炎那樣容易演變成慢性肝炎，更不會(huì)發(fā)生肝硬化和原發(fā)性肝癌。愈后獲得免疫力，不再會(huì)發(fā)生第二次甲型肝炎。丁型肝炎病毒是種缺陷病毒，只有在乙型肝炎病毒的輔佐下，才能感染人體而引起疾病。雖然我們國(guó)家丁型肝炎抗體陽(yáng)性率僅為1.15％，但以全國(guó)1.2億乙型肝炎病毒攜帶者為基數(shù)進(jìn)行計(jì)算，我國(guó)丁型肝炎病人數(shù)也達(dá)140萬(wàn)人之多。乙型肝炎攜帶者重疊感染丁型肝炎病毒后，往往會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的急性肝炎，甚至發(fā)展成重癥肝炎。乙型肝炎病毒攜帶者孕婦，在分娩過(guò)程可將乙型肝炎病毒傳染給新生兒。新生兒感染乙型肝炎病毒后，約有90％以上的人將成為乙型肝炎病毒持續(xù)攜帶者，其中一部分人進(jìn)入成年后會(huì)發(fā)展成為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌。戊型肝炎發(fā)病經(jīng)過(guò)基本上與甲型肝炎差不多，但平均病情重于甲型肝炎，黃疸發(fā)生率高，病情恢復(fù)較甲型肝炎慢。容易發(fā)生淤膽，肝內(nèi)細(xì)小膽管(稱毛細(xì)膽管)出現(xiàn)管壁水腫，膽管內(nèi)膽汁凝固，形成栓塞，致使黃疸不能順利消退，使黃疸指數(shù)居高不下。部分病人可出現(xiàn)二次黃疸高峰。孕婦，特別是中晚期妊娠婦女罹患戊型肝炎時(shí)，后果較為嚴(yán)重，病死率可達(dá)20％-30％。
目前傳統(tǒng)的肝炎檢測(cè)法為血清檢測(cè)方法(現(xiàn)在市場(chǎng)上占主流地位的是ELISA方法)，每次只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，在進(jìn)行多指標(biāo)檢測(cè)上費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢，難以滿足人數(shù)眾多的體檢市場(chǎng)，不利于體檢的日常化、平民化普及。
在小面積上集成多個(gè)基因進(jìn)行結(jié)果判斷，是最近幾年來(lái)新興的高科技技術(shù)，在多指標(biāo)并行快速檢測(cè)方面有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，具有集成化、高通量、自動(dòng)化、微型化、信息化等特點(diǎn)，是臨床診斷的發(fā)展方向。
但現(xiàn)有報(bào)道的基因芯片檢測(cè)偏重于單種肝炎病毒的檢測(cè)，及單病毒基因分型的研究，沒(méi)有不同核酸病毒和多種病毒的同時(shí)篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)不能同時(shí)對(duì)五種肝炎進(jìn)行檢測(cè)的局限性，提供了一種五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，可以通過(guò)檢測(cè)血清或血漿中可能存在的HAV，HBV，HCV，HDV，HEV，HFV五種病毒核酸，進(jìn)行五種肝炎的平行預(yù)測(cè)，診斷和預(yù)后判斷。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案提供一種五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，由五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列和配套使用的試劑盒組成；五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列由固相載體和固相載體上偶聯(lián)的探針組成；配套使用的試劑盒包括對(duì)血清樣本進(jìn)行處理的處理液，對(duì)處理樣本進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記的擴(kuò)增液，與微陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)的雜交液，洗滌液，酶標(biāo)工作液，和檢測(cè)液；在血清樣本的檢測(cè)過(guò)程中配套試劑盒與五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列是聯(lián)合使用的。
本發(fā)明的其它技術(shù)特征所述的固相載體是NC膜，尼龍膜，硅膠片，玻片，納米材料，高分子材料，固相載體是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的，固相載體可以是經(jīng)過(guò)醛基化修飾的玻片。
所述的固相載體上偶聯(lián)的探針是可以檢測(cè)出HAV，HBV，HCV，HDV，HEV，HFV五種肝炎的核酸序列，偶聯(lián)的探針序列長(zhǎng)度為15bp以上，所述的檢測(cè)探針序列在每個(gè)微陣列中有2個(gè)以上重復(fù)點(diǎn)樣，所述的檢測(cè)探針序列還包括一個(gè)擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照探針序列，所述的陽(yáng)性對(duì)照探針序列長(zhǎng)度為15bp以上。所述的樣本處理液是可以對(duì)DNA/RAN病毒樣本進(jìn)行平行處理的。
所述的配套使用的試劑盒可以擴(kuò)增標(biāo)記五種肝炎的核酸病毒，所述的樣本擴(kuò)增液由肝炎病互特異性擴(kuò)增引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液組成，所述的引物有生物素標(biāo)記，所述的引物長(zhǎng)度為15bp以上。
所述的與微陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)的雜交液，和用于洗滌的洗滌液主要成分是SSC和SDS。
所述的酶標(biāo)工作液由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素組成，所述的檢測(cè)液由發(fā)光物和過(guò)氧化氫二種試劑組成，使用前混合，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是可以在基因水平上進(jìn)行肝炎類型的檢測(cè)，可以對(duì)五種肝炎進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，節(jié)省時(shí)間和步驟。


圖1是本發(fā)明一種固相載體上五種肝炎病毒基因分類檢測(cè)的15項(xiàng)指標(biāo)和五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的點(diǎn)樣示意圖。
圖2是本發(fā)明的反應(yīng)孔中進(jìn)行的各探針——標(biāo)靶擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)的示意圖具體實(shí)施方式
五種肝炎基因分類檢測(cè)的關(guān)健是對(duì)于病毒感染檢測(cè)的靈敏度和特異性均達(dá)到要求，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，而相應(yīng)的難點(diǎn)是如何將不同病毒肝炎的代表性保守序列整合到一個(gè)反應(yīng)區(qū)域里來(lái)檢測(cè)。經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，本發(fā)明通過(guò)各肝炎病毒保守序列的查找和比對(duì)分析，進(jìn)行了保守序列專一性探針的設(shè)計(jì)，再結(jié)合DNA與RNA平行擴(kuò)增的技術(shù)進(jìn)行樣本處理，經(jīng)過(guò)雜交反應(yīng)和親和反應(yīng)，再結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，達(dá)到對(duì)不同種類的兩種病毒的同時(shí)檢測(cè)。
具體而言，為提高五種肝炎的雜交檢測(cè)效率，本發(fā)明應(yīng)用微點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合微陣列基因雜交技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)了一種五種肝炎平行檢測(cè)的集成檢測(cè)微陣列。微陣列包括載體和位于載體上的反應(yīng)區(qū)域，所述的反應(yīng)區(qū)域包括5個(gè)以上探針序列，1個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，其特征是每一反應(yīng)區(qū)域上偶聯(lián)著每種肝炎不同的檢測(cè)相應(yīng)病毒的保守基因序列。
在本發(fā)明中，反應(yīng)區(qū)域?yàn)殛嚵行汀?br> 在本發(fā)明中，偶聯(lián)五種肝炎特異性檢測(cè)探針序列的固相載體可以選用本領(lǐng)域常用的各種固相載體，包括(但并不限于)玻璃片，塑料，膜，硅膠片，納米材料，高分子材料，較佳的固相載體包括玻片，硅膠片和高分子材料。
在固相載體上，各探針序列有2個(gè)以上重復(fù)點(diǎn)樣點(diǎn)。此外，較佳地在固相載體上還包括一個(gè)以上定位點(diǎn)(見圖1)。
在本發(fā)明中，各指標(biāo)的檢測(cè)采用基因雜交法，檢測(cè)原理如圖2所示。詳細(xì)敘述如下1)將特異性探針與固相載體連接，形成固相探針。封閉，除去未結(jié)合的位點(diǎn)。
2)用DNA/RNA平行處理試劑盒，處理受檢血清，進(jìn)行BIOTIN標(biāo)記的擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物與反應(yīng)孔內(nèi)的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，與探針形成探針-目標(biāo)核酸產(chǎn)物-BIOTIN的復(fù)合物3)洗滌除去未結(jié)合的目標(biāo)核酸產(chǎn)物，及反應(yīng)雜質(zhì)。
4)與HRP標(biāo)記的親和素進(jìn)行親和反應(yīng)。使已經(jīng)檢測(cè)到的核酸產(chǎn)物間接標(biāo)記上HRP。
5)加底物固相上的酶催化底物，化學(xué)發(fā)光，CCD檢測(cè)，光強(qiáng)度與標(biāo)本中受檢病毒的量呈正相關(guān)。
本發(fā)明巧妙地綜合利用了基因微點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，親和反應(yīng)，以及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了五種肝炎的同時(shí)檢測(cè)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1檢測(cè)反應(yīng)板的制備取醛基化玻片，在每個(gè)反應(yīng)區(qū)域上偶聯(lián)每種肝炎保守區(qū)的3個(gè)基因序列探針，和每種肝炎的標(biāo)準(zhǔn)定位點(diǎn)作為反應(yīng)結(jié)果的陽(yáng)性對(duì)照，組成基因序列微列陣(圖1)。
實(shí)施例2試劑盒制備試劑盒一，用于血清中病毒核酸的抽提制備。
試劑盒二，用于樣本處理獲得核酸病毒的擴(kuò)增和標(biāo)記。
洗滌濃縮液、酶標(biāo)工作液實(shí)施例3五種肝炎檢測(cè)按以下方法對(duì)各測(cè)試血請(qǐng)樣品進(jìn)行檢測(cè)1.按照產(chǎn)品說(shuō)明書對(duì)血清樣本進(jìn)行處理，提取病毒核酸。
2.加入PCR擴(kuò)增液，對(duì)處理得到的核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記，用帶BIOTIN標(biāo)記的引物給產(chǎn)物標(biāo)記上生物素。
3.加入反應(yīng)區(qū)域，10-20ul。
4.42℃保溫保濕反應(yīng)60分鐘。
5.用洗液洗滌4-6次，每次2分鐘，振動(dòng)。
6.加入親和反應(yīng)液，10-20ul。
7.在42℃反應(yīng)15-20min。
8.用洗液洗滌4-6次，每次2分鐘，晃動(dòng)。
9.加檢測(cè)液20ul/孔，使檢測(cè)液均勻分布于反應(yīng)區(qū)域。
10.CCD檢測(cè)，視發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度曝光30-60秒。
反應(yīng)原理如圖2。
結(jié)果判定依據(jù)不同指標(biāo)的CutOff值，參考標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線，判定樣品血清的陰陽(yáng)性。
與此同時(shí)，用常規(guī)方法對(duì)測(cè)試的血清樣品進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。結(jié)果表明，用本發(fā)明的試劑盒得出的測(cè)試結(jié)果與常規(guī)方法相同。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)力要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，由五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列和配套使用的試劑盒組成，其特征在于五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列由固相載體和固相載體上偶聯(lián)的探針組成；配套使用的試劑盒包括對(duì)血清樣本進(jìn)行處理的處理液，對(duì)處理樣本進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記的擴(kuò)增液，與微陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)的雜交液，洗滌液，工作液，和檢測(cè)液；在血清樣本的檢測(cè)過(guò)程中配套試劑盒與五項(xiàng)肝炎集成檢測(cè)基因微陣列是聯(lián)合使用的。
2.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，固相載體為玻片、硅片、膜、納米材料、高分子材料；所述的載體可以是不修飾也可以是經(jīng)過(guò)特殊修飾的。
3.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的固相載體上偶聯(lián)的探針是可以檢測(cè)出HAV，HBV，HCV，HDV，HEV五種肝炎病毒核酸的長(zhǎng)度為12bp以上的DNA，同時(shí)還包括兩個(gè)個(gè)長(zhǎng)度為15bp以上擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照探針序列；陰性對(duì)照探針用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或者污染，陽(yáng)性對(duì)照探針用于檢測(cè)是否正常雜交。
4.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的樣本處理液可以對(duì)含有DNA/RNA病毒的血清樣本平行抽提核酸。
5.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的配套使用的擴(kuò)增液可以以不對(duì)稱方式，通過(guò)ONE-STEP RT PCR方法同時(shí)擴(kuò)增和以生物素標(biāo)記五種肝炎病毒的核酸，其包含的引物為有生物素標(biāo)記的15bp以上的DNA，每一對(duì)病毒特異性引物能夠擴(kuò)增出GENEBANK中記錄的所有該種病毒的相應(yīng)片斷。
6.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，工作液由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素組成，能在4攝氏度和60攝氏度之間正常工作。
7.如權(quán)利要求1所述的五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的檢測(cè)液由發(fā)光物和過(guò)氧化氫二種試劑組成，使用前混合，該發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)試劑盒，用本產(chǎn)品可以對(duì)五種肝炎病毒進(jìn)行平行的處理和檢測(cè)。本發(fā)明包括五項(xiàng)肝炎集成基因檢測(cè)芯片，和配套的試劑盒。所述的基因檢測(cè)芯片由固相載體和偶聯(lián)在上面的五種肝炎的特異性基因探針序列組成。所述的試劑盒由樣本處理液，樣本擴(kuò)增液，雜交反應(yīng)液，親和反應(yīng)液，洗滌液，發(fā)光液組成。本發(fā)明可簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)多人份五種肝炎病毒疾病的同時(shí)診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1869248SQ200510102469
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2005年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者穆海東 申請(qǐng)人:穆海東