專利名稱：轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品dna檢測芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
采用現(xiàn)代生物技術(shù)，培育出區(qū)別于傳統(tǒng)育種的轉(zhuǎn)基因作物(genetically modifiedorganism簡記為GMO)，為農(nóng)業(yè)研究方面開創(chuàng)了一個嶄新的時代，為人類提高食物數(shù)量和質(zhì)量打開了一扇前所未有的機遇之門?，F(xiàn)代生物技術(shù)又稱DNA重組技術(shù)，它在改善食物的營養(yǎng)質(zhì)量，提高作物產(chǎn)量和抗病、抗蟲能力、減少農(nóng)藥用量以及人類傳染性疾病疫苗接種方面頗具潛力。近年來轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物成為各國競相研究開發(fā)的熱點。近年來，轉(zhuǎn)基因植物在全球種植面積和銷售額增長迅速。種植轉(zhuǎn)基因作物的國家由1992年的1個增加到目前的17個。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用機構(gòu)(ISAAA)公布的一份報告顯示，2004年全球轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花和其它作物播種面積達到了2億英畝，比2003年的1.67億英畝增長了20％。2004年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積占其總種植面積的百分比大豆56％、棉花28％、油菜19％、玉米14％。美國是種植轉(zhuǎn)基因作物最多的國家，其轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)量已占大豆總產(chǎn)量的一半以上。我國政府十分重視生物技術(shù)的研究，正在研究的轉(zhuǎn)基因生物有130多種，涉及的基因種類超過100種。特別是在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、轉(zhuǎn)基因水稻、基因工程疫苗等領(lǐng)域的研究成果已居世界前列，2002年，我國轉(zhuǎn)基因作物種植面積突破210萬公頃，成為繼美國、加拿大、巴西、阿根廷之后的轉(zhuǎn)基因作物種植大國。自1997年至2003年9月，經(jīng)過安全評價，農(nóng)業(yè)部批準水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、馬鈴薯等10多種轉(zhuǎn)基因植物進入田間環(huán)境釋放，批準轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、甜椒等植物和獸用微生物基因工程疫苗進入商業(yè)化生產(chǎn)。
伴隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的不斷開發(fā)和推廣利用，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題尚未定論，各國政府、學(xué)術(shù)界和消費者關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品安全的爭議不斷。人們擔心這種對生物進行“任意修改”而創(chuàng)造出來的新型遺傳基因和生物可能會有害于人類，對生態(tài)環(huán)境造成新的污染，即所謂的轉(zhuǎn)基因污染，而這種新的污染源又是很難消除的。另外，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)的手段還是不完善的，新基因的插入是隨機的，遠未達到定向插入的程度。面對眾多消費者對GMO的疑慮和反GMO組織的強大壓力，食品制造商和各國政府已經(jīng)做出反應(yīng)。在歐洲，1998年6月，歐共體(EU)規(guī)定要對農(nóng)作物標示其是否含有GMO。2000年EU又提出GMO的混入上限須在0.9％以下。我國已經(jīng)加入WTO，不可避免會面臨轉(zhuǎn)基因食品的貿(mào)易糾紛。國外的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品通過貿(mào)易在沒有標識和申明的情況下大量進入我國市場，對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)濟利益、人民身體健康和生態(tài)環(huán)境帶來了很大的潛在風(fēng)險。針對當前我國加強食品安全管理的形勢，建立我國食品安全急需的檢測方法，便于管理部門對轉(zhuǎn)基因食品進行追蹤管理，進而保護消費者的健康和權(quán)益。盡快研究制定標準對其進行準確、快速檢測顯得十分迫切。2001年國家制定了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》。為保障《條例》的實施，農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》三個配套規(guī)章。自2002.3.20日起施行。要求對大豆、玉米、油菜類轉(zhuǎn)基因食品進行標識。
對食品中的GMOs進行檢測，目前歐盟推薦的官方方法有兩種。一是基于DNA的檢測即PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，二基于蛋白的檢測即LISA(酶聯(lián)免疫反應(yīng))。蛋白檢測靈敏、快速。但是在加工食品中蛋白易發(fā)生變性，另外，有些蛋白只在作物的某一特定組織中表達。相對于蛋白質(zhì)，DNA較穩(wěn)定。即使在深加工產(chǎn)品中如色拉油都能檢測出DNA的存在。PCR十分靈敏，但一次反應(yīng)只能檢測一種轉(zhuǎn)基因成分。隨著世界范圍新的轉(zhuǎn)基因作物不斷涌現(xiàn)，已有的檢測技術(shù)已不能滿足大量的不同品系的轉(zhuǎn)基因食品檢測的需要。迫切需要有新的技術(shù)和設(shè)備滿足高通量和日益增加的各種基因修飾物的低成本檢測。
DNA芯片技術(shù)是轉(zhuǎn)基因食品檢測的最有前途的領(lǐng)域之一。DNA芯片技術(shù)又叫Microarray技術(shù)，是90年代中期以來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)，其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法，將大量DNA探針片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標記的生物樣品中DNA分子雜交，再對雜交信號進行檢測分析，能在短時間內(nèi)快速、準確地獲取大量信息。DNA芯片技術(shù)具有PCR方法的同樣的優(yōu)點?？梢跃_地進行基因修飾物的定性檢測。不同之處在于可以在固體表面固定上千個特定的探針。能夠在一次單獨的分析中篩查、定性樣品中的大量的不同種類的基因修飾物。此外，DNA芯片技術(shù)非常靈活，當有新的基因修飾物出現(xiàn)時可以在陣列中增加布點，將新的基因序列包括在篩查程序中。
英文期刊《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》于2004年11月發(fā)表了一篇關(guān)于用肽核酸做探針檢測轉(zhuǎn)基因大豆的芯片技術(shù)文章。但只是針對轉(zhuǎn)基因大豆的管家基因和外源基因設(shè)計了五個寡肽核酸探針建立了一個芯片模型進行驗證，不足以用于實際應(yīng)用。
中國發(fā)明專利CN1584049A公開了用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測的寡核苷酸芯片技術(shù)。但是該技術(shù)所設(shè)計的檢測探針均為長度在20個堿基左右的寡核苷酸探針。而所要檢測的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的外源基因一般都在幾百個堿基以上，有的在1000個堿基以上。針對一個外源基因僅用一個寡核苷酸探針去檢測，不足以保證檢測結(jié)果的特異性。此外，為減少芯片固相雜交時的空間位阻，該技術(shù)在寡核苷酸的5′端連了一段連接臂。為了將寡核苷酸探針固定在玻片上，還對寡核苷酸的5′端進行了化學(xué)基團的修飾。這使得芯片無法擺脫昂貴的成本費用。《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》于2005年初發(fā)表的一篇應(yīng)用DNA芯片平臺技術(shù)檢測5種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的一篇文章，同樣存在上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的中存在的問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片在檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的方法。
本發(fā)明在使用官方認可的通用引物和特異性引物的同時，根據(jù)從相關(guān)數(shù)據(jù)庫收集和多種途徑獲取的序列資料自行設(shè)計轉(zhuǎn)基因大豆Round-upready、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米GA21、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因油菜籽MS1RF1、轉(zhuǎn)基因油菜籽T45和轉(zhuǎn)基因大米SCK四種轉(zhuǎn)基因作物的7個品系的外源基因的通用引物和特異引物進行退火溫度一致性和特異性的篩選，通過大量的篩選工作建立了穩(wěn)定的PCR體系。通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建含有外源基因片段的質(zhì)粒，并以質(zhì)粒做模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化制備成特異性較高的雙鏈DNA固定探針，對各項指標進行優(yōu)化后，將固定探針布點在氨基化的玻片上，制備成應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測DNA芯片。芯片與多重PCR體系擴增的Cy5標記的待測樣品雜交，12個小時后通過芯片掃描儀進行掃描分析，根據(jù)雜交信號直觀地判讀該樣品中所含有的外源目標基因情況。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，該芯片包括片基和位于片基上的核酸探針，該芯片包括片基和位于片基上的核酸探針，該核酸探針包括以下一系列檢測目標基因的目標檢測探針檢測hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一個，檢測nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一個，檢測pnos的NOs10～13中的至少一個，檢測nos的SEQ ID NOsl4～16中的至少一個，檢測camv35s的SEQ ID NOs17～19中的至少一個，檢測mdb484-mdb501的SEQ ID NO20，檢測barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一個，檢測barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一個，檢測cpti的SEQID NOs27～30中的至少一個，檢測mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一個，檢測cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一個，檢測cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一個，檢測rbcl的SEQ ID NO41，檢測lectin的SEQ ID NOs42～44中的至少一個，檢測zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一個，檢測napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一個。檢測探針序列見表1。
表1

如SEQ ID NOs.1～50所述，本發(fā)明使用的探針多為200個核苷酸以上的長序列，這種長序列，與現(xiàn)有技術(shù)中只有20個核苷酸的寡核苷酸探針相比，保證了雜交的特異性，結(jié)果更為可靠。
另外，為了監(jiān)控雜交反應(yīng)結(jié)果，設(shè)有嚴格的質(zhì)控。50％的DMSO(二甲基亞砜)點樣液做陰性對照，非點樣區(qū)做空白對照。若雜交后陰性對照點和空白對照點檢測無信號，表明正常；若有信號，表明雜交失敗。
為了監(jiān)控雜交反應(yīng)中假陰性的出現(xiàn)，特設(shè)立陽性對照，該陽性對照探針為一段與目標檢測基因無關(guān)的核苷酸片段(例如，鼠傷寒沙門氏菌spvc基因片段，例如SEQ ID NO.51)，且與所有的固定探針的雜交條件一致，可以和其他探針一同固定在芯片上。在每次雜交檢測時，將標記有Cy5的鼠傷寒沙門氏菌spvc基因片段摻比到待測目標基因中同芯片進行雜交，若雜交后檢測有信號，表明正常；若無信號，表明雜交失敗。
其中的管家基因(lectin、zein、napin和rbcl)檢測探針可作為另一陽性對照，不僅可以監(jiān)控雜交體系出現(xiàn)的假陰性，還可以監(jiān)控雜交之前，樣品經(jīng)多重PCR標記體系出現(xiàn)的假陰性。同時還可以解釋待測樣品中所檢出的外源基因的準確來源。因為許多農(nóng)作物產(chǎn)品會被土壤中的細菌污染，而大多數(shù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中所插入的啟動子和終止子是來自土壤中的細菌的，所以管家基因的信號可以準確地辨別出外源基因特別是啟動子和終止子的來源。避免了假陽性結(jié)果。
為了監(jiān)控雜交反應(yīng)中非特異信號出現(xiàn)，芯片上各矩陣中的不同探針可以互為對照。經(jīng)已知的樣品進行驗證表明雜交信號顯示的檢測結(jié)果準確。所述探針在芯片上的布陣沒有特別的限制，可以是任意進行布陣，為了有利于檢測的方便，可以將探針按檢測的外源基因的不同功能進行矩陣排布，例如將檢測具有相同檢測功能的探針分為一個矩陣，如實施例7所述，可以將探針分為有篩選作用的A矩陣；有定性作用的B矩陣，檢測管家基因的C矩陣等；當然，也可以將所述探針按照所檢測的農(nóng)產(chǎn)品的不同進行矩陣排布，例如將用于檢測和鑒定同一農(nóng)產(chǎn)品的探針放在一個矩陣中，如實施例6所示，例如可以將檢測大豆的探針作為一個矩陣，將檢測玉米的所有探針作為一個矩陣，當然，也可以將檢測油菜的探針作為一個矩陣。
為了監(jiān)控雜交結(jié)果的可靠性，每個探針在芯片上至少重復(fù)2個點，例如至少重復(fù)3個點，至少4個點，至少5個點，至少6個點，同時兼顧到經(jīng)濟因素和操作方便，優(yōu)選重復(fù)3、4或5個點。在雜交后同一探針的所有點若信號一致，表明正常；若有的有信號，有的無信號則結(jié)果不可信，需要重新進行實驗來進一步驗證。
本發(fā)明的農(nóng)產(chǎn)品包括農(nóng)產(chǎn)品原材料及其加工食品，所述農(nóng)產(chǎn)品原材料包括大豆、玉米、大米或油菜，以及其他含有或可能含有相關(guān)檢測目標基因的農(nóng)產(chǎn)品，包括但不限于新鮮或干燥的根、莖、葉、花、果實、種子等；所述農(nóng)產(chǎn)品加工食品包括進行簡單的機械加工獲得的產(chǎn)品，例如由種子獲得的面粉、大米、脫殼的大豆、油菜籽等，也包括進行深加工所獲得的產(chǎn)品，例如大豆油、玉米油、菜籽油等，也包括由農(nóng)產(chǎn)品原材料制成的食品，例如糕點、香腸等。
本發(fā)明的檢測范圍涵蓋目前常見的轉(zhuǎn)基因作物的外源目標基因camv35vs啟動子、nos啟動子、nos終止子、標記基因hpt、nptII、外源目標基因cp4epsps、cryIA(b)、mcp4epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作為內(nèi)源參照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法，該方法包括(1)根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的目標基因序列設(shè)計并合成聚合酶鏈式反應(yīng)引物，這些聚合酶鏈式反應(yīng)引物的解鏈溫度大致相同；(2)利用(1)所述的聚合酶鏈式反應(yīng)引物從轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的DNA中擴增目標檢測探針；(3)將所述探針固定在片基上。
本發(fā)明在對芯片探針引物的設(shè)計上的獨特之處在于對于篩選檢測中常見的基因如啟動子、終止子、抗生素抗性基因和標記基因要盡量設(shè)計通用引物，而在定性檢測時所設(shè)計的引物要有很好的特異性且要盡量在目標基因的編碼區(qū)內(nèi)，以避免和其他探針具有同源性，從而減少檢測結(jié)果的假陽性。但為了增加檢測的信息量，為判斷轉(zhuǎn)基因作物種類或品系提供進一步的支持，可以設(shè)計連接區(qū)的一些引物，制得連接區(qū)的探針布點在芯片上，根據(jù)組合的情況對芯片的結(jié)果進行判讀。另外，所有引物必須保證基本上在同一退火溫度，PCR產(chǎn)物的長度要求比較一致，且擴增效率良好。這樣對于樣品的混合PCR放大、標記過程以及芯片的雜交過程中溫度及其他條件的控制極為有利，同時對引物間的相互影響及擴增效率的影響降到最低。
針對以上原則，本研究在盡量使用官方認可的通用引物和特異性引物(詳見表2)的同時，也根據(jù)實驗需要按獲取的序列資料自行設(shè)計通用引物和特異性引物(詳見表3)，這些引物對尚未建立的檢測目標基因是個重要的補充。在設(shè)計出的170對引物中篩選出16個基因的50對引物作為制備探針及多重PCR標記的引物。在今后芯片的實際應(yīng)用中，這50對引物所表達的信息量可以基本滿足目前所研究的轉(zhuǎn)基因食品的檢測標準。檢測范圍涵蓋了以下目前常見的轉(zhuǎn)基因作物的外源目標基因camv35S啟動子、nos啟動子、nos終止子、標記基因hpt、nptII、外源目標基因cp4epsps、cryIA(b)、mcp4epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作為內(nèi)源參照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
經(jīng)過發(fā)明人大量的實驗和研究，本發(fā)明最終確定了適用于本發(fā)明的引物序列，并列表如下參考文獻的引物表2


自行設(shè)計的引物表3



在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法中，優(yōu)選利用聚合酶鏈式反應(yīng)從轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的DNA中擴增目標檢測探針，聚合酶鏈式反應(yīng)的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明中提供一種優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)，其條件為94～95℃預(yù)變性3～5min；94℃變性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；進行40個循環(huán)；72℃延伸5～10min。
將所述探針固定在片基上的方法可以采用本領(lǐng)域常用的點樣方法。點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。現(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點樣裝置出售，例如美國Biodot公司的“噴印”儀，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。在本發(fā)明中，優(yōu)選接觸式點樣。為了本發(fā)明的目的，片基可以使用本領(lǐng)域已知的片基，優(yōu)選使用氨基化的片基。
另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片在檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片可以用于進行品種的檢測(參見實施例4)，可以用于進行外源目標基因的檢測(參見實施例5)，可以用于進行品系鑒定(參見實施例6)，并且可以用于其中的一種或一種以上的組合檢測或鑒定，更為重要的是本發(fā)明提供了一種可對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行初步篩選、品種檢測、品系鑒定一體化的DNA芯片，這對于簡化程序，快速、高通量地進行轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測和鑒定具有重要意義。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述應(yīng)用可以具體包括以下步驟(1)提取待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA；(2)利用本發(fā)明的引物對待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA進行PCR擴增并標記；(3)將經(jīng)標記的擴增產(chǎn)物與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片雜交；(4)確定所述待測農(nóng)產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品。在上述步驟中，可以如實施例7所述，將所述引物分成至少兩個組，然后再用每個組分別進行PCR擴增并標記，這樣可以減少多對引物間的干擾。對這兩組引物分別標記、純化后再混合雜交，這樣既沒有損失檢測信息，且仍可以體現(xiàn)芯片的高通量的特點。此外，上述步驟中對樣品進行標記的方法可以采用熒光標記方法。熒光標記方法基本分為2種，一種是使用熒光標記的引物，一種是使用熒光標記的三磷酸脫氧核糖核苷酸。目前常使用的熒光物質(zhì)有熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根據(jù)標記的方法不同，擴增產(chǎn)物分離的方法也不同進行單引物標記的，其擴增產(chǎn)物通常由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；對一個引物用生物素標記，另一個引物用熒光素標記的，一般用親合素偶聯(lián)的磁珠捕捉其擴增產(chǎn)物，通過變性處理使熒光標記的產(chǎn)物解鏈。此外，也有用生物素殘基標記引物，將生物素標記的擴增產(chǎn)物與芯片雜交，洗滌后加入親合素連接的熒光物，通過生物素與親合素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，然后利用熒光檢測系統(tǒng)對熒光信號進行檢測。在本發(fā)明的實施例中使用Cy5-dUTP進行標記，使用目前已知的熒光檢測技術(shù)進行檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，如何根據(jù)雜交檢測結(jié)果，確定是否為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品。具體可以參見實施例3、4、5、6、7。
此外，本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測試劑盒，該轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測試劑盒除了包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片外，還可以包含如SEQ ID NOs.52～153所示的引物中的部分或全部。這些引物可以裝在一個容器內(nèi)，也可以分成幾組，分別裝在不同的容器內(nèi)，或也可以均裝在單獨容器內(nèi)。此外，該試劑盒中還可以包含用于檢測或擴增的一種或多種組分。按照具體檢測方法及擴增方法的不同，試劑盒可含有不同組分。與之同時提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。
此外，本發(fā)明還提供一種檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的方法，該方法包括1)提取待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA；2)利用本發(fā)明的目標檢測探針檢測所述待測產(chǎn)品的DNA；3)根據(jù)所述探針與所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA的結(jié)合情況判斷該待測農(nóng)產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品。
提取待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA方法可以是一類適合本檢測所需的任何提取方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)農(nóng)產(chǎn)品的類型選擇合適的提取方法。在該方法中可以將所述目標檢測探針固定在片基上，制成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，然后再進行檢測；也可以不固定在片基上，直接進行檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測DNA芯片是以DNA芯片為平臺建立起的用以檢測轉(zhuǎn)產(chǎn)品中外源插入基因的新技術(shù)。區(qū)別于普通PCR一次只能檢測一個基因，DNA芯片能夠在高通量地檢測樣品中的大量的不同種類的基因修飾物。和多重PCR相比DNA芯片的雜交檢測更靈敏，結(jié)果判讀更準確。
更為重要的是，本發(fā)明使用的探針多為200個核苷酸以上的長序列，這種長序列，與只有20個核苷酸的寡核苷酸探針相比，保證了雜交的特異性，結(jié)果更為可靠。且本發(fā)明是通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒做模板和PCR擴增技術(shù)制備的檢測探針，由于不存在寡核苷酸探針與玻片間的空間位阻的問題，所以不用對探針再做任何化學(xué)修飾，降低了芯片制備的成本，有利于未來的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
DNA芯片的探針對引物的要求較高，即除了要遵循引物設(shè)計的一般原則外，還要使引物退火溫度盡量保持一致，擴增片段的長度盡量一致，各引物間減少互補序列，這增加了引物設(shè)計和篩選的難度。本發(fā)明通過大量的實驗，篩選出的50對高特異性引物PCR擴增效率較高、擴增的探針同源性較低，用此50對引物進行PCR擴增來制備本芯片的探針可以滿足檢測轉(zhuǎn)基因食品的初步篩查、品種檢測、品系鑒定不同層次的要求。例如camv35s啟動子、nos終止子、nos啟動子、hpt探針、nptII位置處出現(xiàn)陽性信號可以提示檢測的食品可疑為轉(zhuǎn)基因食品。管家基因lectin，zein和napin以及rbcl探針的信號可以幫助我們知道該轉(zhuǎn)基因食品是否是來自大豆、玉米、油菜籽、大米或是其它含有或可能含有相關(guān)檢測目標基因的農(nóng)產(chǎn)品。從外源結(jié)構(gòu)基因cp4epsps，cryIA(b)，mcp4epsps，cpti，barstar和barnase，mdb484-mdb501探針的信號可以知道該轉(zhuǎn)基因食品具有抗除草劑、抗蟲或雄性不育等特性的哪種品性。綜合芯片上所有提供的多種信息可以進一步鑒別轉(zhuǎn)基因食品的品系，知道該轉(zhuǎn)基因食品是哪個公司市售的，含有哪些外源插入基因，便于管理部門對其示蹤管理。
另外，由于本發(fā)明的探針固定在同一片基上，可以通過一次的雜交反應(yīng)同時獲取多種信息。對比目前的PCR技術(shù)進行的初篩、定性等分步檢測，具有高通量，快速的優(yōu)勢。
應(yīng)用結(jié)果顯示本發(fā)明轉(zhuǎn)基因食品DNA檢測芯片可以對上述7種轉(zhuǎn)基因作物的多個目標基因進行識別檢測，具有較高的特異性和較好的重復(fù)性。嚴格的質(zhì)控點保證了芯片結(jié)果判讀的準確，也是本發(fā)明的一大優(yōu)點。
SCK水稻是中國科學(xué)院遺傳與生物發(fā)育研究所研制的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻。插入了表達豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)等的外源基因。本研究以SCK水稻加工后產(chǎn)品SCK大米的S86品系為研究對象，首次建立了S86的芯片檢測方法，經(jīng)過驗證，檢測結(jié)果具有很好的準確性、特異性和重復(fù)性。為具有我國特色并有產(chǎn)業(yè)化前景的轉(zhuǎn)基因水稻提供了安全性研究的基礎(chǔ)資料并建立了cpti和hpt的基因標識方法。


圖1為本發(fā)明的芯片制作流程圖；圖2和圖3為本發(fā)明的芯片對品種檢測的結(jié)果。圖2為玉米；圖3為油菜籽；圖中符號1.rbcl，2.zein，3.lectin，4.napin；圖中四個角的陽性信號是定位的marker；圖4-圖7為本發(fā)明芯片對外源目標基因進行檢測的結(jié)果，其中，圖4為轉(zhuǎn)基因大米S86；圖5為轉(zhuǎn)基因大米S86陰性對照樣品；圖6為轉(zhuǎn)基因Ms1Rf1油菜籽；圖7為轉(zhuǎn)基因油菜籽陰性對照樣品；圖中符號1.barnase，2.mdb484-mdb501，3.cryIA(b)，4.mcp4epsps，5.cp4epsps，6.cpti；圖中四個角的陽性信號是定位的marker；圖8-圖11為本發(fā)明的芯片進行品系鑒定檢測結(jié)果，其中，圖8為轉(zhuǎn)基因大豆RRS40-3-2品系，圖8中符號1.lectin，2.camv35s，3.nos，4.cp4epsps；圖9為轉(zhuǎn)基因玉米GA21；圖10為轉(zhuǎn)基因大米S86；圖9、圖10中符號1.zein，2.camv35s，3.nos，4.mcp4epsps，5.rbcl，6.cpti，7.hpt；圖11為轉(zhuǎn)基因玉米MON810，圖11中符號1.zein，2.camv35s，3.nos，4.mcp4epsps，5.cryIA(b)，6.cp4epsps，7.lectin；圖12-圖15為本發(fā)明一體化DNA檢測芯片的示意圖和檢測結(jié)果，其中圖12為轉(zhuǎn)基因大豆RRS40-3-2的檢測結(jié)果示意圖；圖13為轉(zhuǎn)基因大豆RRS40-3-2的檢測結(jié)果掃描圖；圖14為油菜籽MS1RF1的檢測結(jié)果示意圖；圖15為油菜籽MS1RF1的檢測結(jié)果掃描圖。圖12～圖15中符號1.Hpt，2.nptII，3.pnos，4.nos，5.35s1，6.35s2，7.mdb501-484，8.barstar，9.barnase，10.cpti，11.mcp4epsps，12.cryIA(b)，13.cp4epsps，14.50％DMSO(陰性對照)，15.spvc(陽性對照)，16.rbcl，17.napin，18.zein，19.lectin。
具體實施例方式
實施例1、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測芯片的制備1、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品基因組DNA的提取(CTAB法和硅膠柱純化法)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品樣品和來源轉(zhuǎn)基因大豆40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、GA21、NK603的陽性和陰性樣品由Monsanto公司提供。轉(zhuǎn)基因油菜籽Ms1Rf1和T45的陽性和陰性樣品由Bayer公司提供。轉(zhuǎn)基因大米SCK的S86陽性和陰性樣品由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供。
十六烷基三甲基銨硝酸鹽(CTAB)抽提緩沖液配制方法20g/l CTAB，4.0g；4M NaCl，16.4g；0.1M Tris-HCl，3.15g；20mM乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)，1.5g；加100ml無菌去離子水，用1M NaOH調(diào)PH至8.0，最后定容到200ml高壓滅菌4℃保存6個月。
CTAB沉淀緩沖液配制方法5g/l CTAB，1g；0.04M NaCl，0.5g；加100ml無菌去離子水，用1M NaOH調(diào)PH至8.0，最后定容到200ml高壓滅菌4℃保存6個月。
操作步驟(1)把樣品在陶瓷研缽中輕輕研碎，加入液氮繼續(xù)研磨成細粉。
(2)用藥匙舀取約100mg研磨好的樣品粉末轉(zhuǎn)入滅菌的1.5ml離心管中，加入500～800μlCTAB提取緩沖液混勻。加入20μl蛋白酶K(Promega，20mg/ml)混勻，65℃水浴30～90min。每隔10min攪拌1次。
(3)加入20μl/RNA酶(10mg/mL)混勻，65℃水浴5～10min。
(4)16,000rpm離心10min。離心后將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
(5)向管中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，輕輕混勻后16000rpm離心10min。離心后將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
(6)向管中加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕輕混勻后16000rpm離心5min。離心后將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
(7)重復(fù)步驟(6)一次。
(8)加2倍體積的CTAB沉淀緩沖液，輕輕混勻后，室溫靜置60min。
(9)16,000rpm離心5min，棄上清。加入350μl 1.2M NaCl溶液溶解。
(10)加入350μl氯仿，輕輕混勻30秒，16000rpm離心10min。
離心后將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
(11)向離心管中加入1/10體積的NaAc(3M)混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃放置30min。
(12)16000rpm離心5min，棄上清。加入300ml 70％乙醇16000rpm離心5min，棄上清。
(13)干燥離心管，向管中加入100μl無菌去離子水溶解DNA。
(14)用細胞基因組clean-up試劑盒(Promega公司)純化(操作步驟見試劑盒使用說明書)。
(15)純化過的DNA樣品置于-20℃或更低溫度環(huán)境保存?zhèn)溆谩?br> 取2μl制備的DNA在1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，檢測提取基因組DNA的質(zhì)量和含量。
2.檢測探針的制備將上述實施例1的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品基因組DNA作為模板，采用表2和表3的相應(yīng)引物(由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司、上海生工生物工程有限公司和北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)進行PCR擴增(TaqDNA聚合酶，購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)，將獲得的產(chǎn)物切膠回收后重組到PMD-18T(Takara寶生物工程(大連)有限公司)載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。提取大腸桿菌的質(zhì)粒，再以稀釋的質(zhì)粒做模板進行PCR擴增，得到產(chǎn)物純化后做為固定探針布點在芯片上。
操作步驟(1)、PCR反應(yīng)擴增外源目標基因片段PCR反應(yīng)體系20μlPCR緩沖液，2.0μl；引物(上、下游各5μM)，1.6～2.0μl；dNTP(10mM)，0.4μl；模板DNA(上述某一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品基因組DNA)，1.0～2.0μl；Taq(5U/μl)，0.1～0.2μl；去離子水補齊至20μl。
PCR反應(yīng)條件94～95℃預(yù)變性3～5min；94℃變性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；進行40個循環(huán)；72℃延伸5～10min。
PCR產(chǎn)物的檢測擴增完畢后，取2.0μl反應(yīng)液與0.4μl6×溴酚藍緩沖液混合，在2％瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)中電泳，用讀膠儀觀察結(jié)果并照相。
對所要目的片段進行切膠回收(切膠回收試劑盒購于QIAGEN公司)純化。
(2)、CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌。操作步驟見《分子克隆實驗指南》(第三版)。
(3)、構(gòu)建含有該DNA序列的重組質(zhì)粒。操作步驟見《分子克隆實驗指南》(第三版)。
(4)、抽提質(zhì)粒。操作步驟見《分子克隆實驗指南》(第三版)。
(5)、將所抽提質(zhì)粒稀釋1000倍后用做模板進行PCR反應(yīng)制備固定探針。
PCR反應(yīng)體系20μlPCR緩沖液，2.0μl；引物(上下游引物各5μM)，1.6～2.0μl；dNTP(10mM)，0.4μl；模板DNA(質(zhì)粒)，0.4～1.0μl；Taq(5U/μl)，0.1～0.2μl；去離子，補齊至20μl。
PCR反應(yīng)條件同步驟(1)。
(6)、檢測探針的純化和定量乙醇沉淀法純化檢測探針，具體操作如下(a)取200μl PCR反應(yīng)液，加400μl無水乙醇及20μl乙酸鈉(終濃度為0.3mol/L)，-20℃1小時。
(b)4℃12,000rpm離心10min，棄上清。
(c)70％乙醇，4℃12,000rpm離心2min，棄上清。
(d)37℃干燥后，溶于10μl無菌去離子水中。
(e)取1μl溶液2％瓊脂糖凝膠電泳，檢驗探針質(zhì)量。
(f)取2μl溶液稀釋到50μl在紫外分光光度計下測定探針濃度。
(g)用無菌去離子水將探針濃度稀釋到500～1000ng/μl。
(h)加入等體積的100％DMSO溶液(100％DMSO為點樣液)混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.檢測探針在氨基化玻片上的固定操作步驟(1)將固定探針放入384孔板中，每孔5μl，濃度為250～500ng/μl。
(2)將384孔板及硅烷化好的玻片(氨基化玻璃片(購于上海百奧公司))放在指定位置。
(3)設(shè)置點樣程序用點樣儀(Perkin Elmer公司，美國)點樣。
(4)點樣后處理濕化50～60℃蒸汽濕化30～50s；干烤80℃1小時；紫外交聯(lián)將玻片上打印有DNA的面朝上，紫外釋放能量為250mJ，將DNA固定在玻片上；2％十六烷基磺酸鈉(SDS)洗2～10min。超純水(Ω≥17兆歐)沖洗2～10min；變性90℃水中煮1～5min，立即浸入冰無水乙醇中3min；晾干待雜交。
(5)矩陣排列在濕化的過程中可以顯現(xiàn)，由此可通過肉眼判斷芯片是否有漏點的情況。將芯片和標準參考物質(zhì)或已知轉(zhuǎn)基因成分的樣品雜交后，可通過陽性參照、陰性參照和空白參照等質(zhì)控的結(jié)果及檢測結(jié)果判斷，如果結(jié)果符合預(yù)期則表明芯片已制備成功。
實施例2、待測樣品的制備1、待測樣品基因組DNA提取方法方法參見實施例1中“轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品基因組DNA的提取方法”。
2、待測樣品的標記(多重PCR熒光素標記)25μl體積PCR緩沖液，2.5μl；Primer(混合引物)表2和3所列的混合引物濃度和混合比例見下面具體實施例)；dNTP(10mM，無dTTP)，0.5μl；Cy5-dUTP(1mM)(Pharmacia公司)，0.5μl；dTTP(1mM)，2.0μl；模板DNA(上述待測樣品的基因組DNA)，1.0～2.0μl；Taq(5U/μl)，0.3～0.5μl；dH2O，補齊至25μl。
PCR反應(yīng)條件同實施例1。
實施例3、待測產(chǎn)品的檢測1、玻片的雜交和洗滌操作步驟(1)將玻片放置在雜交倉內(nèi)。
(2)將裝有標記探針的微離心管加熱變性100℃沸水煮3min。
(3)向管中加入100μl高效雜交液(鼎國公司)，吹打混勻后注入雜交倉。42℃雜交12～18小時。
(4)12～18小時后將玻片取出，放入洗膜I液(2×SSC、0.1％SDS)中洗滌2min。
(5)洗膜II液(0.1×SSC、0.1％SDS)洗滌2min。
(6)無菌高純水洗滌2min，晾干待掃描。
2、掃描儀下觀察雜交結(jié)果檢測結(jié)果根據(jù)掃描儀(Perkin Elmer公司，美國)讀取的信號進行判斷。在扣除背景信號的基礎(chǔ)上陽性信號判定為陽性，陰性信號判定為陰性。
實施例4、管家基因DNA檢測芯片方法按照實施例1、2、3的方法制備轉(zhuǎn)基因檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。其中以轉(zhuǎn)基因大豆特異性管家基因lectin的414bp基因片段(SEQ ID NO.42)、轉(zhuǎn)基因玉米特異性管家基因zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)、轉(zhuǎn)基因油菜籽特異性管家基因napin的325bp基因片段(SEQ ID NO.50)，真核植物特異性管家基因rbcl的433bp基因片段(SEQ ID NO.41)為探針(濃度為250～500ng/μl)制備芯片。所述探針的排布如下表4所示表4、管家基因檢測矩陣探針排布

①rbcl②zein③lectin④napin⑤marker
多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(體系參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；其中引物為混合引物12.5μM用于檢測rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，各0.1μl；用于檢測lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各0.1μl；用于檢測zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各0.1μl；用于檢測napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，各0.1μl。模板DNA為待測農(nóng)產(chǎn)品DNA；擴增條件等同樣見實施例1。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
利用該芯片檢測轉(zhuǎn)基因玉米NK603，檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米NK603的管家基因zein和rbcl的雜交信號為陽性而轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因油菜籽的管家基因信號為陰性；與預(yù)期結(jié)果一致，見圖2。對轉(zhuǎn)基因油菜籽T45的檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因油菜籽的管家基因napin和rbcl的雜交信號為陽性而轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米的管家信號為陰性；與預(yù)期結(jié)果一致，見圖3。管家基因通常在轉(zhuǎn)基因食品檢測時起內(nèi)源參照作用。用以檢測樣品DNA的抽提質(zhì)量及作為芯片系統(tǒng)的雜交體系的陽性對照。特別是當檢測芯片在實際應(yīng)用中檢測混合樣品或不知作物來源的樣品時尤為重要，其可對樣品的種類進行鑒定。
實施例5、外源目標基因DNA檢測芯片方法按照實施例1、2、3的方法制備外源目標基因DNA檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。其中通過篩選出轉(zhuǎn)基因油菜籽Ms1Rf1的barnase基因的213bp基因片段(SEQID NO.25)，轉(zhuǎn)基因油菜籽T45的mdb484-mdb501基因的220bp基因片段(SEQ ID NO.20)，轉(zhuǎn)基因玉米MON810的cryIA(b)基因的354bp基因片段(SEQ ID NO.37)，轉(zhuǎn)基因玉米GA21的mcp4epsps基因的236bp基因片段(SEQ ID NO.32)，轉(zhuǎn)基因玉米NK603和轉(zhuǎn)基因大豆共有的cp4epsps基因的294bp基因片段(SEQ ID NO.38)，轉(zhuǎn)基因大米S86的cpti基因的209bp基因片段為探針(SEQ ID NO.29)(濃度為250～500ng/μl)制備芯片。所述探針的排布如下所示表5、外源目標基因檢測芯片矩陣探針排布

①barnase②mdb484-mdb501③crylA(b)④mcp4epsps⑤cp4epsps⑥cpti⑦marker多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(請參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；其中的引物為混合引物12.5μM用于擴增barnase的引物(SEQ ID NO.136和137)，各0.1μl；用于擴增mdb484-mdb501的引物(SEQ ID NO.64和65)，各0.1μl；用于擴增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，各0.1μl；用于擴增mcp4epsps的引物(SEQID NO.114和115)，各0.1μl；用于擴增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各0.1μl；用于擴增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，各0.1μl。模板DNA為待測農(nóng)產(chǎn)品DNA；擴增條件等同樣見實施例1。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
結(jié)果本芯片對轉(zhuǎn)基因大米S86的檢測結(jié)果表明只有轉(zhuǎn)基因大米S86外源結(jié)構(gòu)基因cpti的雜交信號為陽性而其他作物的外源結(jié)構(gòu)基因的雜交信號為陰性，見圖4。同時對轉(zhuǎn)基因大米S86陰性對照樣品的檢測顯示外源結(jié)構(gòu)基因cpti未檢出，見圖5。本芯片轉(zhuǎn)基因油菜籽Ms1Rf1的外源結(jié)構(gòu)基因的檢測結(jié)果表明只有外源基因barnase的雜交信號陽性而其他作物的外源結(jié)構(gòu)基因的雜交信號為陰性，見圖6。同時對轉(zhuǎn)基因油菜籽Ms1Rf1陰性對照樣品的檢測顯示外源結(jié)構(gòu)基因barnase未檢出，見圖7。在轉(zhuǎn)基因食品定性檢測中最重要的檢測目標基因是外源結(jié)構(gòu)基因，即引入某一轉(zhuǎn)基因作物中編碼蛋白使轉(zhuǎn)基因作物具有抗除草劑或抗蟲等新的性狀的基因。
實施例6、品系鑒定芯片1)轉(zhuǎn)基因大豆RRS40-3-2品系方法按照實施例1、2、3的方法制備轉(zhuǎn)基因檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。其中通過篩選出的camv35s啟動子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos終止子的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，cp4epsps的294bp基因片段(SEQ ID NO.38)為探針(濃度為250～500ng/μl)對轉(zhuǎn)基因大豆40-3-2進行檢測。同時以大豆管家基因lectin的414bp基因片段(SEQ ID NO.42)為內(nèi)源參照。排布如下表6所示表6、轉(zhuǎn)基因大豆RRS品系

①lectin②camv35s③nos④cp4epsps多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(請參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；其中的引物為混合引物2μM用于擴增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各1.0μl；用于擴增camv35s①(SEQ ID NO.58和59)的引物，各1.0μl；用于擴增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，各1.0μl；用于擴增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各1.0μl。模板DNA為待測農(nóng)產(chǎn)品DNA；擴增條件等同樣見實施例1。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
結(jié)果表明，本芯片可以從Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆40-3-2(RRS)中檢測到camv35s啟動子、nos終止子、cp4epsps和大豆管家基因lectin。與預(yù)期結(jié)果一致。雜交結(jié)果見圖8。
2)轉(zhuǎn)基因玉米GA21檢測芯片矩陣A和轉(zhuǎn)基因大米S86檢測芯片矩陣B探針排布方法按照實施例1、2、3的方法制備轉(zhuǎn)基因檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。其中，通過篩選出的camv35s啟動子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，外源結(jié)構(gòu)基因mcp4epsps的引物mcp4epsps擴增的236bp基因片段(SEQ ID NO.32)為探針(濃度為250～500ng/μl)對轉(zhuǎn)基因玉米GA21進行檢測；同時以玉米管家zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)為內(nèi)源參照。在本芯片中，也將檢測轉(zhuǎn)基因大米S86的探針(250～500ng/μl)同時在此一并研究即將外源結(jié)構(gòu)基因cpti的209bp基因片段(SEQ ID NO.29)，抗生素標記基因hpt的215bp基因片段(SEQ ID NO.2)及管家基因rbcl的433bp基因片段(SEQ ID NO.41)也布點在芯片上，和檢測GA21玉米的探針互為參照，相互驗證探針的特異性。所述探針的排布如下表7所示表7

①點樣液50％DMSO②zein③camv35s④nos⑤mcp4epsps⑥r(nóng)bcl⑦cpti⑧hpt⑨marker多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(請參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；引物為混合引物2μM用于擴增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各1.0μl；用于擴增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，各1.0μl；用于擴增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，各1.0μl；用于擴增mcp4epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，各1.0μl。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
結(jié)果本芯片可以從轉(zhuǎn)基因玉米GA21中檢測到nos終止子、mcp4epsps和玉米管家基因zein，這與轉(zhuǎn)基因玉米GA21的預(yù)期結(jié)果一致；而互為對照的SCK的探針的雜交信號則為陰性，說明檢測GA21的探針具有很好的特異性。見圖9。
多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(請參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；其中的引物為混合引物2μM用于擴增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，1.0μl；用于擴增rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，1.0μl；用于擴增hpt的引物(SEQ ID NO.92和93)，1.0μl。模板DNA為待測農(nóng)產(chǎn)品DNA；擴增條件等同樣見實施例1。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
從轉(zhuǎn)基因大米S86中可以檢測到cpti、hpf和管家基因rbcl，這與轉(zhuǎn)基因大米S86的預(yù)期結(jié)果一致；而互為對照的GA21的探針的雜交信號則為陰性，說明檢測S86的探針具有很好的特異性。見圖10。
3)轉(zhuǎn)基因玉米MON810檢測芯片矩陣探針排布方法按照實施例1、2、3的方法制備轉(zhuǎn)基因檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。其中，通過篩選出的camv35x啟動子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos終止子的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，外源結(jié)構(gòu)基因cryIA(b)的引物cryIA(b)的354bp基因片段(SEQ ID NO.37)為探針(濃度為250～500ng/μl)，對轉(zhuǎn)基因玉米MON810進行檢測；同時以玉米管家zein的引物zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)為內(nèi)源參照。與此同時，將檢測轉(zhuǎn)基因玉米GA21探針(同上)，轉(zhuǎn)基因玉米NK603探針(包括camv35s啟動子的195bp基因片段、nos終止子的213bp基因片段，外源結(jié)構(gòu)基因cp4epsps的294bp基因片段(SE9 ID NO.38)和玉米管家zein的引物zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46))和轉(zhuǎn)基因大豆40-3-2的探針(同上)布點在芯片上，和檢測MON810玉米的探針互為參照，相互驗證探針的特異性。所述探針的排布見表8。
表8A矩陣GA21玉米 B矩陣MON810玉米


C矩陣NK603玉米 D矩陣40-3-2大豆


①點樣液50％DMSO②zein③camv35s④nos⑤mcp4epsps⑥marker⑦cryIA(b)⑧cp4epsps⑨lectin
多重PCR熒光素標記樣品PCR反應(yīng)體系25μl(參見實施例2中的“待測樣品的標記”部分)；其中引物為混合引物2μM用于擴增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各1.0μl；用于擴增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，各1.0μl；用于擴增nos的引物(SEQID NO.52和53)，各1.0μl；用于擴增m cp4epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，各1.0μl；用于擴增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，1.0μl；用于擴增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各1.0μl；用于擴增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各1.0μl。模板DNA為待測農(nóng)產(chǎn)品DNA；擴增條件等同樣見實施例1。
樣品經(jīng)多重PCR擴增標記、純化后與芯片雜交。
結(jié)果表明，本芯片可以從轉(zhuǎn)基因玉米MON810中檢測到camv35s啟動子、nos終止子、cryIA(b)和玉米管家基因zein。而互為對照的矩陣中的相同探針雜交信號陽性，不同探針的雜交信號陰性，說明各檢測探針有很好的特異性。見圖11。
實施例7、一體化DNA檢測芯片方法按照實施例1、2、3的方法制備轉(zhuǎn)基因檢測芯片、制備待測樣品以及進行檢測。芯片上的所布探針序列見表1。探針是按外源基因的不同功能進行矩陣排布。見表9。有篩選作用的A矩陣，主要是檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的啟動子、終止子和標志基因。有定性作用的B矩陣，來確定該作物的主要性征。C矩陣主要是些管家基因用來區(qū)分物種的種屬，可以確定外源基因的來源。同時還有嚴格的質(zhì)控矩陣。50％的DMSO點樣液做陰性對照，鼠傷寒沙門氏菌spvc做陽性對照，非點樣區(qū)做空白對照。各矩陣中的不同探針可以互為對照。檢測范圍含蓋了以下目前常見的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的外源目標基因camv35S啟動子、nos啟動子、nos終止子、標記基因hpt、nptII、外源目標基因cp4 epsps、crylA(b)、mcp4 epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作為內(nèi)源參照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
表9、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片矩陣設(shè)計
1)轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready 40-3-2的檢測多重PCR熒光素標記體系中上、下游混合引物對比例、體系見實施例2。
引物1(各引物濃度均為2μM)用于擴增camv35s(SEQ ID NO.58和59)的引物，1.5μl；用于擴增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，1.0μl；用于擴增cp4 epsps的引物(SEQ IDNO.106和107)，1.5μl；用與擴增rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，0.5μl；用于擴增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，0.5μl。
引物2(各引物濃度均為5μM)用于擴增pnos的引物(SEQ ID NO.98和99)，0.5μl；用于擴增camv35s(SEQ ID NO.60和61)的引物，0.5μl；用于擴增hpt的引物(SEQ IDNO.92和93)，0.5μl；用于擴增nptII的引物(SEQ ID NO.82和83)，0.5μl；用于擴增barstar的引物(SEQ ID NO.142和143)，0.5μl；用于擴增barnase(SEQ ID NO.136和137)的引物，0.5μl；用于擴增mcp4 epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，0.5μl；用于擴增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，0.5μl；用于擴增mdb501-mdb484的引物(SEQ ID NO.64和65)，0.5μl；用于擴增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，0.5μl；用于擴增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，0.5μl；用于擴增napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，0.5μl。
陽性對照spvcPCR擴增熒光素標記25μl體系PCR buffer，2.5μl；用于擴增spvc的引物(SEQ ID NO.152和153)(上、下游混合引物5μM)，2.5μl；dNTP(10mM，無dTTP)，0.5μl；Cy5-dUTP(1mM)，0.5μl；dTTP(1mM)，2.0μl；模板DNA(鼠傷寒沙門氏菌STM)，0.5μl；Taq(5U/μl)，0.5μl；dH2O，16μl。
引物1和引物2為17對引物拆分成兩組的引物對混合體系。目的是減少多對引物間的干擾。本發(fā)明是對這兩組引物分別標記、純化后再混合雜交，這樣既沒有損失檢測信息，且仍可以體現(xiàn)芯片的高通量的特點。同理spvc陽性參照探針是單引物對熒光素標記、純化后以1/5的比例摻混到已標記好的待測樣品中起陽性對照作用。實施例7的步驟2)也是相同方法。
結(jié)果顯示A2矩陣中有camv35s①、camv35s②和nos 3個檢測探針出現(xiàn)陽性信號，表明有camv35s啟動子基因和nos終止子基因的存在?？梢猿醪脚袛啻郎y樣品是轉(zhuǎn)基因樣品。B2矩陣中只有cp4 epsps 1個檢探針出現(xiàn)陽性信號，表明此轉(zhuǎn)基因樣品是具有抗草苷磷除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因樣品。C2矩陣中只有rbcl和lectin 2個探針出現(xiàn)陽性信號，由此可以判斷外源基因片段來自真核植物大豆，而非其它物種。C1矩陣的陽性對照探針出現(xiàn)陽性信號，陰性對照探針顯示的是陰性信號。空白處均無信號。說明多重PCR體系，雜交體系結(jié)果可靠。綜合所有矩陣的結(jié)果可以判斷待測樣品是轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready 40-3-2。結(jié)果示意圖，見圖12。結(jié)果掃描圖，見圖13。
2)MS1RF1油菜籽的檢測多重PCR熒光素標記體系中上、下游混合引物對比例、體系見實施例2。
引物1(各引物濃度均為5μM)用于擴增camv35s的引物(SEQ ID NO.58和59)，0.4μl；用于擴增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，0.4μl；用于擴增pnos的引物(SEQ ID NO.98和99)，0.5μl；用于擴增nptII的引物(SEQ ID NO.82和83)，0.4μl；用于擴增barstar的引物SEQ ID NO.142和143)，0.5μl；用于擴增barnase的引物SEQ ID NO.136和137)，0.5μl；用于擴增napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，0.2μl；用于擴增rbcl的引物(SEQID NO.66和67)，0.2μl。
引物2(各引物濃度均為5μM)用于擴增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，0.5μl；用于擴增hpt的引物(SEQ ID NO.92和93)，0.5μl；用于擴增cp4 epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，0.5μl；用于擴增mcp4 epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，0.5μl；用于擴增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，0.5μl；用于擴增mdb501-mdb484的引物SEQ ID NO.64和65)，0.5μl；用于擴增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，0.5μl；用于擴增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，0.5μl；用于擴增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，0.5μl。
方法和操作步驟見實施例1、2、3和7的步驟1。
結(jié)果顯示A2矩陣中有camv35s①、camv35s②、nos和pnos 4個檢測探針出現(xiàn)陽性信號，表明有camv35s啟動子基因、nos終止子基因和nos啟動子的存在?？梢猿醪脚袛啻郎y樣品是轉(zhuǎn)基因樣品。B1矩陣中只有barstar 1個檢探針出現(xiàn)陽性信號，表明此轉(zhuǎn)基因樣品是具有育性恢復(fù)性狀的轉(zhuǎn)基因樣品。C2矩陣中只有rbcl和napin 2個探針出現(xiàn)陽性信號，由此可以判斷外源基因片段來自真核植物油菜，而非其它物種。C1矩陣的陽性對照探針出現(xiàn)陽性信號，陰性對照探針顯示的是陰性信號。空白處均無信號。說明多重PCR體系，雜交體系結(jié)果可靠。綜合所有矩陣的結(jié)果可以判斷待測樣品是轉(zhuǎn)基因油菜籽MS1RF1。結(jié)果示意圖，見圖14。結(jié)果掃描圖，見圖15。
序列表<110>中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所<120>轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片及其制備方法和應(yīng)用<130>GBI05CN0369<160>153<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>283<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>1tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca 60ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggagt ttagcgagag 120cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac 180cgaactgccc gctgttctac aaccggtcgc ggaggctatg gatgcgatcg ctgcggccga 240tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa gga283<210>2<211>215<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>2cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 60ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 120tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 180atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacat 215<210>3<211>488<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>3cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 60ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 120caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 180gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 240atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 300cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 360ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 420tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 480atgttcgg 488
<210>4<211>441<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>4acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg 60actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg 120acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat 180acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc 240gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc acgactccgg gcgtatatgc 300tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag 360cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta 420cacaaatcgc ccgcagaagc g441<210>5<211>486<212>DNA<213>大腸桿菌E.coli<400>5ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 60cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 120aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 180acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 240gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 300gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 360agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 420tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 480tcagtg 486<210>6<211>364<212>DNA<213>大腸桿菌E.coli<400>6ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 60cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 120ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 180tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 240cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 300gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 360cacc 364<210>7<211>489<212>DNA<213>大腸桿菌E.coli<400>7ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 60cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 120
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<223>引物<400>138aatcagaagc acaagccctc g21<210>139<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>139aggtctgata atggtccgtt gtt 23<210>140<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>140tcagcgacct ccaccagaca t21<210>141<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>141tatgatggtg atgtcgcagc 20<210>142<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>142aagtatcagc gacctccacc ag 22<210>143<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>143tcgcagcctt ccgctttcg 19<210>144<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>144ggggaacaaa tcagaagtat 20<210>145<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>145gaaagtatga tggtgatgtc gc 22<210>146<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>146ctcgccttgt tcttccttc 19<210>147<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>147ctgttgtcta acggctttg 19<210>148<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>148ctcgccttgt tcttccttct c21<210>149<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>149caaatgctaa cttgcctgat g21<210>150<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>150cttccttctc accaatgcct c21<210>151<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>151ggttgggcaa acgcaaagtg 20<210>152<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>152gtagctgctt atgatggg18<210>153<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>153attgccgtgt cttgtggag 19
權(quán)利要求
1. 一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，該芯片包括片基和位于片基上的核酸探針，該核酸探針包括以下一系列檢測目標基因的目標檢測探針檢測hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一個，檢測nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一個，檢測pnos的NOs10～13中的至少一個，檢測nos的SEQ ID NOs14～16中的至少一個，檢測camv35s的SEQID NOs17～19中的至少一個，檢測mdb484-mdb501的SEQ ID NO20，檢測barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一個，檢測barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一個，檢測cpti的SEQ ID NOs27～30中的至少一個，檢測mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一個，檢測cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一個，檢測cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一個，檢測rbcl的SEQ ID NO41，檢測lectin的SEQID NOs42～44中的至少一個，檢測zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一個，檢測napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一個。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，該芯片還包括陰性對照和陽性對照，該陽性對照為如SEQ ID NO.51所示的序列。
3.如權(quán)利要求1或2任一項所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，其中所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品為大豆、玉米、水稻或油菜，以及其他含有或可能含有相關(guān)檢測目標基因的農(nóng)產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，其中所述的水稻為SCK水稻。
5.一種如權(quán)利要求1～4任一項所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法，該方法包括(1)根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的目標基因序列設(shè)計并合成聚合酶鏈式反應(yīng)引物，這些聚合酶鏈式反應(yīng)引物的解鏈溫度大致相同；(2)利用(1)所述的聚合酶鏈式反應(yīng)引物從轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的DNA中擴增目標檢測探針；和(3)將所述探針固定在片基上。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法，其中所述的聚合酶鏈式反應(yīng)引物包括用于擴增hpt的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于擴增nptII的以下引物對中的至少一對SEQ IDNO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ ID NO83、SEQ ID NO84和SEQ IDNO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于擴增pnos的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO98和SEQ ID NO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ ID NO103、SEQ ID NO104和SEQ ID NO105；用于擴增nos的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于擴增camv35s的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO58和SEQ ID NO59、SEQ ID NO60和SEQ IDNO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于擴增mdb484-mdb501的以下引物對SEQ IDNO64和SEQ ID NO65；用于擴增barstar的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ ID NO144和SEQ IDNO145；用于擴增barnase的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于擴增cpti的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO126和SEQ ID NO127、SEQ ID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ ID NO132和SEQ IDNO133；用于擴增mcp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO112和SEQ ID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ IDNO118和SEQ ID NO119；用于擴增cryIA(b)的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ IDNO125；用于擴增cp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO106和SEQ ID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于擴增rbcl的以下引物對SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于擴增lectin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于擴增zein的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于擴增napin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQ ID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151。
7.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法，該方法還包括根據(jù)陽性對照spvc設(shè)計并合成聚合酶鏈式反應(yīng)引物，并利用該聚合酶鏈式反應(yīng)引物擴增spvc檢測探針，所述引物為以下引物對SEQ ID NO152和SEQ ID NO153。
8.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法，其中步驟(2)包括利用聚合酶鏈式反應(yīng)從轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的DNA中擴增目標檢測探針，聚合酶鏈式反應(yīng)的條件為94～95℃預(yù)變性3～5min；94℃變性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；進行40個循環(huán)；72℃延伸5～10min。
9.權(quán)利要求1～4任一項所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片在檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中包括以下步驟(1)提取待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA；(2)用如下引物對待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA進行PCR擴增并標記，所述引物包括用于擴增hpt的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于擴增nptII的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ ID NO83、SEQ ID NO84和SEQ ID NO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于擴增pnos的以下引物對中的至少一對SEQ IDNO98和SEQ ID NO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ IDNO103、SEQ ID NO104和SEQ ID NO105；用于擴增nos的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQ ID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于擴增camv35s的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO58和SEQ IDNO59、SEQ ID NO60和SEQ ID NO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于擴增mdb484-mdb501的以下引物對SEQ ID NO64和SEQ ID NO65；用于擴增barstar的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ ID NO144和SEQ ID NO145；用于擴增barnase的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于擴增cpti的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO126和SEQ IDNO127、SEQ ID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ IDNO132和SEQ ID NO.133；用于擴增mcp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO112和SEQ ID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ ID NO118和SEQ ID NO119；用于擴增cryIA(b)的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ ID NO125；用于擴增cp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO106和SEQ ID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于擴增rbcl的以下引物對SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于擴增lectin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于擴增zein的以下引物對中的至少一對SEQ IDNO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于擴增napin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151；(3)將經(jīng)標記的擴增產(chǎn)物與權(quán)利要求1～4任一項的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片雜交；和(4)確定所述待測農(nóng)產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中將所述引物分成至少兩個組，然后再用每個組分別進行PCR擴增并標記。
12.一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測試劑盒，該試劑盒含有如權(quán)利要求1～4任一項所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片；和用于PCR擴增的引物，該引物包括用于擴增hpt的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于擴增nptII的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ IDNO83、SEQ ID NO84和SEQ ID NO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于擴增pnos的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO98和SEQ IDNO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ ID NO103、SEQ IDNO104和SEQ ID NO105；用于擴增nos的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQ ID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于擴增camv35s的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO58和SEQ ID NO59、SEQ IDNO60和SEQ ID NO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于擴增mdb484-mdb501的以下引物對SEQ ID NO64和SEQ ID NO65；用于擴增barstar的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ IDNO144和SEQ ID NO145；用于擴增barnase的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于擴增cpti的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO126和SEQ ID NO127、SEQID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ ID NO132和SEQ ID NO133；用于擴增mcp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO112和SEQID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ ID NO118和SEQ ID NO119；用于擴增cryIA(b)的以下引物對中的至少一對SEQID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ ID NO125；用于擴增cp4epsps的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO106和SEQID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于擴增rbcl的以下引物對SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于擴增lectin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于擴增zein的以下引物對中的至少一對SEQ IDNO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于擴增napin的以下引物對中的至少一對SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151。
13.一種檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的方法，該方法包括(1)提取待測農(nóng)產(chǎn)品的DNA，所述農(nóng)產(chǎn)品包括農(nóng)產(chǎn)品原材料和/或農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)品；(2)利用以下目標檢測探針檢測所述待測產(chǎn)品的DNA，所述目標檢測探針包括檢測hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一個，檢測nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一個，檢測pnos的NOs10～13中的至少一個，檢測nos的SEQ ID NOs14～16中的至少一個，檢測camv35s的SEQ ID NOs17～19中的至少一個，檢測mdb484-mdb501的SEQ IDNO20，檢測barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一個，檢測barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一個，檢測cpti的SEQ ID NOs27～30中的至少一個，檢測mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一個，檢測cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一個，檢測cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一個，檢測rbcl的SEQ ID NO41，檢測lectin的SEQ ID NOs42～44中的至少一個，檢測zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一個，檢測napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一個；和(3)根據(jù)所述探針與所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA的結(jié)合情況判斷該待測農(nóng)產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片，該芯片包括片基和位于片基上的核酸探針，該核酸探針包含用于檢測目標基因的目標檢測探針，該目標檢測探針是一系列如SEQ ID NOs.1～50所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片的制備方法。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測芯片在檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA檢測試劑盒。此外，本發(fā)明提供一種檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1786195SQ20051010254
公開日2006年6月14日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者吳永寧, 張建中, 周萍萍 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所