專利名稱：一種酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及一種酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術：
對于微生物活體殺菌劑，如何研制高效的發(fā)酵體系，是進行產業(yè)化應用前研究者必須考慮的問題(Powell K A.Biocontrol product fermentation，formulation andmarketing.InTjamos E S(Eds).Biological Control of Plant Disease.New YorkP1enum Press，1992，pp381-387.)。目前的研究表明酵母拮抗菌R.glutinis對蘋果、桃、梨、獼猴桃等果實的主要采后病害均具有明顯抑制效果(Chand-Goyal T，Spotts R A.Control of postharvest pear diseases using natural saprophyticyeast colonists and their combination with a low dosage of thiabendazole.Postharvest Biol.Technol.，1996，751-64；Lima G.，De-Curtis F.，CastoriaR，De-Cicoo V.Activity of the yeast Cryptoccus laurentii and Rhodotorulaglutinis against post-harvest rots on different fruits.Biocontrol Sci.Technol.，1998，8257-267)；可以耐受低溫、低氧和高二氧化碳等果實采后的主要貯藏條件(Qin G Z，Tian S P，Xu Y.Biocontrol of postharvest diseases onsweet cherries by four antagonistic yeasts in different storage conditions.Postharvest Biol.Technol.，2004b，3151-58)，能夠與鉬酸銨、碳酸氫鈉、水楊酸以及低劑量的殺菌劑配合使用(Tian S P，Yao H J，Qin G Z，Xu Y，Feng X Y.Sensitivity of four yeasts to fungicides and CO2concentrations，and theirantagonistic ability in combination with fungicide to pathogenic fungi invitro.Agricultural Sciences in China，2004，3205-215.Wan Y K，Tian S P，Qin G Z.Enhancement of biocontrol activity of yeasts by adding sodiumbicarbonate or ammonium molybdate to control postharvest disease of jujubefruits.Lett.Appl.Microbiol.，2003，371-5.)，并能在采前田間噴施(Tian SP，Qin G Z，Xu Y.Survival of antagonistic yeasts under field conditions andtheir biocontrol ability against postharvest diseases of sweet cherry.Postharvest Biol.Technol.，2004，33327-331)，具有良好的應用前景。但是，目前國內外未見有關于如何規(guī)?；a酵母拮抗菌粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于大量、快速培養(yǎng)酵母拮抗菌粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，包括碳源和氮源；所述碳源選自下述物質中的一種或其任意組合蔗糖，果糖和葡萄糖；所述氮源選自下述物質中的一種或其任意組合大豆蛋白胨，牛肉浸膏，肉蛋白胨和胰酶解蛋白胨。
所述專用培養(yǎng)基還包括無機養(yǎng)分；所述無機養(yǎng)分選自下述物質中的一種或其任意組合MgSO4，CaCl2，NaCl，KH2PO4和K2HPO4。
在上述酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基中，所述碳源的添加量分別為蔗糖20-40g/L，果糖0-10g/L，葡萄糖0-10g/L；所述氮源的添加量分別為大豆蛋白胨15-30g/L，牛肉浸膏0-1g/L，肉蛋白胨0-10g/L，胰酶解蛋白胨0-10g/L；所述無機養(yǎng)分的添加量分別為MgSO40-1.23g/L，CaCl20-0.56g/L，NaCl 0-0.29g/L，KH2PO40-0.68g/L，K2HPO40-1.14g/L。
優(yōu)選的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，每1000mL水中含有下述物質蔗糖20-40g，大豆蛋白胨15-30g，KH2PO40-0.68g和NaCl 0-0.29g。
更優(yōu)選的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，每1000mL水中含有下述物質蔗糖20g，大豆蛋白胨30g，KH2PO40.68g和NaCl 0.29g。
上述培養(yǎng)基的pH值可為5.0-7.0。
本發(fā)明的另一個目的提供一種酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法，是將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)接種上述的酵母拮抗菌專用培養(yǎng)基中，在22-28℃下通氣培養(yǎng)。
所述粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的初始菌體密度可為2.5×106細胞/mL培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)過程的通氣量可為60-100mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間可為24-72小時。
所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為28℃，通氣量優(yōu)選為100mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間優(yōu)選為24小時。
實驗證明，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基在120L發(fā)酵罐中培養(yǎng)粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)，可得到活菌濃度數大于1.4×109CFU mL-1的菌懸液，具有擴大化生產的可行性。本發(fā)明將在酵母拮抗菌及其相關生物制品的工業(yè)化生產中發(fā)揮巨大作用。


圖1為利用正交實驗優(yōu)化酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)條件的效應曲線2為利用正交實驗優(yōu)化酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)條件的直觀分析3為酵母拮抗菌R.glutinis在120L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時生長動態(tài)的變化曲線具體實施方式
下述實施例中如無特別說明，均為常規(guī)方法。
酵母拮抗菌的總菌數在顯微鏡下采用血球計數板進行觀察、統(tǒng)計。酵母拮抗菌活菌數采用稀釋平板法記數，即將稀釋不同濃度梯度的菌液在NYDA上鋪板，28℃培養(yǎng)48-72小時后統(tǒng)計菌落個數。
實施例1、酵母拮抗菌R.glutinis專用培養(yǎng)基的優(yōu)化一、酵母拮抗菌R.glutinis菌種的活化、保存與培養(yǎng)1、菌種的分離及保存從蘋果果實表面分離獲得酵母拮抗菌R.glutinis菌種，置于甘油中-20℃保存。
2、菌種的活化從-20℃中保存的甘油管中吸取菌液，在NYDA培養(yǎng)基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，瓊脂18，單位gL-1；pH5.5)鋪板并在28℃下培養(yǎng)，72小時后取生長良好的酵母拮抗菌接種在NYDB培養(yǎng)基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，單位gL-1；pH5.5)中進一步活化，鋪板，并在NYDA培養(yǎng)基上分離單菌落。
3、菌種的培養(yǎng)挑取單菌落接入NYDB(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，單位gL-1；pH5.5)培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)(25℃，200rpm)24小時后，將培養(yǎng)液4000g離心10min，去掉上清液，沉淀中加入無菌水，混合均勻后再重復離心并去掉上清液，最后將沉淀用無菌水懸浮，用血球計數板配成濃度為1×107個細胞/mL的接種液，用于下述試驗。
二、酵母拮抗菌R.glutinis對不同碳源利用能力的鑒定及最佳碳源的篩選為篩選出最適于酵母拮抗菌利用的碳源，本試驗首先考察酵母拮抗菌R.glutinis對葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、丙三醇、檸檬酸(鈉)、麥芽提取物或可溶性淀粉等工業(yè)上常用的碳源的利用能力，供試碳源的濃度均為10g L-1，以不含氨基酸的酵母基礎氮源(Yeast Nitrogen Base，YNB，Sigma，6.7gL-1)為氮源，將不同碳源與YNB組合的培養(yǎng)基初始pH值調為5.5；同時以YNB(pH5.5)作為對照。將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)分別接入上述培養(yǎng)液，使其初始菌體密度均為1×105細胞/mL培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)48小時，每個處理設三個重復。
利用SPSS軟件，通過ANOVA方式，采用鄧肯式多重差異分析(Duncan’s multiplerange tests)對不同處理之間的差異性在P＜0.05水平上進行數據分析。結果如表1所示，在所檢測的十種碳源中，酵母拮抗菌R.glutinis對蔗糖的利用能力最強，但對同樣是二糖的乳糖和海藻糖卻幾乎不能利用。兩種單糖(果糖和葡萄糖)均能被酵母拮抗菌R.glutinis有效地利用且兩者之間沒有顯著性差異，但均顯著低于對蔗糖的利用(P＜0.05)。相比之下，拮抗菌R.glutinis不能利用丙三醇、檸檬酸、淀粉和玉米粉，R.glutinis在這些碳源中培養(yǎng)48小時后的生長量與對照沒有明顯差別。雖然酵母拮抗菌R.glutinis也能夠有效地利用麥芽提取物，但對其利用能力顯著低于蔗糖與單糖(P＜0.05)。由于酵母拮抗菌R.glutinis以蔗糖為碳源時的生長密度最大，因此將其作為酵母拮抗菌R.glutinis大量快速培養(yǎng)的碳源。
表1 酵母拮抗菌R.glutinis對不同碳源的利用能力

注a時在同一列內，標有不同字母的處理表示采用Duncan多重差異性比較在P＜0.05的水平上具有顯著性差異，b對照指僅以YNB作為培養(yǎng)基。
三、酵母拮抗菌R.glutinis對不同氮源利用能力的鑒定及最佳氮源的篩選以步驟二篩選出的蔗糖為碳源(10gL-1)，驗證拮抗菌R.glutinis對各種氮源的利用能力，實驗選取了牛肉浸膏、酵母提取物、多價胨、大豆蛋白胨、魚蛋白胨、肉蛋白胨、胰化蛋白胨、尿素、硫酸銨或硝酸鈉等常用的發(fā)酵氮源，所有供試氮源的濃度均為15gL-1，不同碳源與YNB組合的培養(yǎng)基初始pH值均調為5.5。將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)分別接入上述培養(yǎng)液，使其初始菌體密度均為1×105細胞/mL培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)48小時，每個處理設三個重復。
利用SPSS軟件，通過ANOVA方式，采用鄧肯式多重差異分析(Duncan’s multiplerange tests)對不同處理之間的差異性在P＜0.05水平上進行數據分析。結果如表2所示，表明牛肉浸膏、大豆蛋白胨、肉蛋白胨與胰酶解蛋白胨四種有機氮源均能被酵母拮抗菌R.glutinis有效利用，在這些氮源中培養(yǎng)48小時后，酵母拮抗菌R.glutinis的生長密度都超過了1×108CFU mL-1，其中以大豆蛋白胨為氮源時生長密度最大(3.59×108CFU mL-1)。相比之下，拮抗菌R.glutinis對多價胨、魚蛋白胨和酵母提取物的利用能力較差，其中以酵母提取物為氮源培養(yǎng)48小時后生長密度沒有達到1×107CFU mL-1。而在尿素、硫酸銨、硝酸鈉等氮源中R.glutinis則不能生長。因此，選擇大豆蛋白胨作為R.glutinis大量快速培養(yǎng)的最適氮源。
表2 酵母拮抗菌R.glutinis對不同氮源的利用能力

注a在同一列內，標有不同字母的處理表示采用Duncan多重差異性比較在P＜0.05的水平上具有顯著性差異，b不生長指酵母濃度低于培養(yǎng)開始時的濃度。
四、酵母拮抗菌R.glutinis對無機鹽的篩選及最適培養(yǎng)基成分優(yōu)化在篩選出最適碳源與最適氮源的基礎上，設計了七因素、兩水平的正交實驗L8(27)，以進一步鑒定酵母拮抗菌R.glutinis對不同無機鹽的需求，以及不同濃度的營養(yǎng)成分(碳源、氮源和無機鹽)對酵母拮抗菌生長速度的影響，各實驗因素及水平的設計如表3所示。每個處理三個重復，實驗進行兩次。
表3 R.glutinis培養(yǎng)基配方優(yōu)化的正交實驗L8(27)的因素與水平表

對最佳營養(yǎng)配方篩選的實驗數據處理采用一般正交實驗的統(tǒng)計分析方法進行(Montagomery，D C.Design and analysis of experiments，4thed.New YorkWiley，1996，pp 627-631)。直觀分析結果如表4所示。根據極差(R)的大小，可以確定各營養(yǎng)成分對R.glutinis生長影響的程度依次為大豆蛋白胨＞硫酸鎂＞蔗糖＞磷酸二氫鉀＞氯化鈉＞磷酸氫二鉀＞氯化鈣，表明大豆蛋白胨是影響R.glutinis生長的最關鍵因素。
方差分析的結果(表5)表明，增加大豆蛋白胨的濃度，或添加氯化鈉、磷酸二氫鉀等無機鹽成分都能顯著提高R.glutinis的生長速度(P＜0.05)，其中大豆蛋白胨的影響達到了極顯著水平(P＜0.01)。相反，添加硫酸鎂濃度，則能極顯著抑制R.glutinis的生長(P＜0.01)。而磷酸氫二鉀和氯化鈣對酵母拮抗菌R.glutinis的生長沒有顯著影響。
根據上述分析，本實驗確定R.glutinis規(guī)?；囵B(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為(g·L-1)蔗糖20，大豆蛋白胨30，磷酸二氫鉀0.68，氯化鈉0.29；pH5.5。
表4 酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實驗結果及直觀分析表


aKiA＝∑菌體密度Ai.實驗數據為三個重復實驗的平均值bkiA＝KiA/2.實驗數據為三個重復實驗的平均值cRiA＝最大(kiA)-最小(kiA).實驗數據為三個重復實驗的平均值表5 酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實驗L8(27)方差分析結果

注NS表示不顯著；*表示顯著水平P＜0.05；**表示顯著水平P＜0.01 df＝1；F0.05＝161.0；F0.01＝405.0實施例2、酵母拮抗菌R.glutinis的最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化在上述實驗篩選出的最適培養(yǎng)基成分的基礎上，設計了三因素、三水平的正交實驗L7(33)，以進一步確定酵母拮抗菌R.glutinis的最適培養(yǎng)條件，各實驗因素及水平的設計如表3所示。每個處理三個重復，實驗進行兩次。
表6 酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交實驗L9(34)的因素與水平

對利用正交實驗進行最佳營養(yǎng)配方的實驗數據處理采用一般正交實驗的統(tǒng)計分析方法進行(Montagomery，D C.Design and analysis of experiments，4thed.NewYorkWiley，1996，pp 627-631)。從正交實驗結果(表7)及其效應曲線圖(圖1)可以看出，當酵母拮抗菌R.glutinis在25-28℃下培養(yǎng)時，大多數處理的活菌數高峰在培養(yǎng)72小時出現，而在31℃下，活菌數在培養(yǎng)48小時便達到高峰，說明升高溫度能夠縮短R.glutinis達到生長高峰的時間。但在相同時間內，R.glutinis在31℃下的活菌數均低于25℃和28℃下培養(yǎng)的活菌數。圖1中，A1、A2和A3分別表示培養(yǎng)溫度25℃、28℃和31℃，B1、B2和B3分別表示初始pH4.0、5.8和7.0，C1、C2和C3分別表示接種濃度0.05％、0.25％和2.00％。
直觀分析圖(圖2，A為溫度，B為初始pH，C為接種濃度)的極差(R)結果表明，在培養(yǎng)的最初24小時內，各因素對酵母拮抗菌R.glutinis生長影響的程度依次為接種濃度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)液初始pH，表明在培養(yǎng)初期接種量是影響拮抗菌R.glutinis生長的最關鍵因素。而在隨后的培養(yǎng)階段各因素影響的主次關系變?yōu)榕囵B(yǎng)溫度＞培養(yǎng)液初始pH＞接種濃度，表明隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)溫度成為最主要影響因素，培養(yǎng)液初始pH的影響次之，而接種濃度的影響最小。綜合考慮活菌量與培養(yǎng)成本，確定酵母拮抗菌R.glutinis的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃；初始pH5.8；接種濃度2％(即初始菌體密度為2.5×106細胞/mL培養(yǎng)基)。在上述培養(yǎng)條件下R.glutinis的最佳培養(yǎng)時間為72小時。
表7 利用正交設計優(yōu)化酵母拮抗菌R.glutinis培養(yǎng)條件的實驗結果

實施例3、酵母拮抗菌R.glutinis的發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)將經過平板活化的酵母拮抗菌R.glutinis菌種，在500mL三角瓶中(含100mL培養(yǎng)液蔗糖20，大豆蛋白胨30，KH2PO40.68，NaCl 0.29(g L-1)；pH5.8)，在28℃、200rpm下預培養(yǎng)12-18小時后，以接種到120L發(fā)酵罐(BioFlo 5000，NewBrunswick Scientific Co.Inc)中(含有80L培養(yǎng)液)，使初始菌體密度為2.5×106細胞/mL培養(yǎng)基，在28℃，通氣量為100mM O2L-1h-1進行擴大培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)階段取樣鋪板，觀測酵母拮抗菌的生長動態(tài)。
酵母拮抗菌R.glutinis在120L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時生長動態(tài)的變化曲線如圖3所示，結果表明接種到發(fā)酵罐后，R.glutinis不經過延滯期而直接進入對數生長期，培養(yǎng)24小時后，細胞濃度達到1.4×109CFU mL-1，此后R.glutinis便生長停止并逐漸進入穩(wěn)定期，R.glutinis的衰亡期在培養(yǎng)48小時后開始出現。在120L發(fā)酵罐中拮抗菌R.glutinis采用上述最佳培養(yǎng)條件得到活菌濃度數大于1.4×109CFU mL-1的菌懸液，具有擴大化生產的可行性。
權利要求
1.一種酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，包括碳源和氮源；所述碳源選自下述物質中的一種或其任意組合蔗糖，果糖和葡萄糖；所述氮源選自下述物質中的一種或其任意組合大豆蛋白胨，牛肉浸膏，肉蛋白胨和胰酶解蛋白胨。
2.根據權利要求1所述的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述專用培養(yǎng)基還包括無機養(yǎng)分；所述無機養(yǎng)分選自下述物質中的一種或其任意組合MgSO4，CaCl2，NaCl，KH2PO4和K2HPO4。
3.根據權利要求1或2所述的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源的添加量分別為蔗糖20-40g/L，果糖0-10g/L，葡萄糖0-10g/L；所述氮源的添加量分別為大豆蛋白胨15-30g/L，牛肉浸膏0-1g/L，肉蛋白胨0-10g/L，胰酶解蛋白胨0-10g/L；所述無機養(yǎng)分的添加量分別為MgSO40-1.23g/L，CaCl20-0.56g/L，NaCl 0-0.29g/L，KH2PO40-0.68g/L，K2HPO40-1.14g/L。
4.根據權利要求3所述的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中，每1000mL水中含有下述物質蔗糖20-40g，大豆蛋白胨15-30g，KH2PO40-0.68g和NaCl 0-0.29g。
5.根據權利要求4所述的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述每1000mL水中含有下述物質蔗糖20g，大豆蛋白胨30g，KH2PO40.68g和NaCl 0.29g。
6.根據權利要求1或2所述的酵母拮抗菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH為5.0-7.0。
7.粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的一種培養(yǎng)方法，是將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)接種到權利要求1-6中任一所述的酵母拮抗菌專用培養(yǎng)基中，在22-28℃下通氣培養(yǎng)。
8.根據權利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)的初始菌體密度為2.5×106細胞/mL培養(yǎng)基。
9.根據權利要求7或8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)過程的通氣量為60-100mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間為24-72小時。
10.根據權利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為28℃，通氣量為100mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間為24小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。包括碳源和氮源；所述碳源選自下述物質中的一種或其任意組合蔗糖，果糖和葡萄糖；所述氮源選自下述物質中的一種或其任意組合大豆蛋白胨，牛肉浸膏，肉蛋白胨和胰酶解蛋白胨。該酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法，是按2％的比例將酵母拮抗菌接種到權利要求4所述的酵母拮抗菌專用培養(yǎng)基中，在22－28℃下通氣培養(yǎng)。本發(fā)明將在酵母拮抗菌及其相關生物制品的工業(yè)化生產中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C12N1/16GK1766084SQ200510103029
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月15日 優(yōu)先權日2005年9月15日
發(fā)明者田世平, 王友升 申請人:中國科學院植物研究所