專(zhuān)利名稱(chēng)：圓海鏈藻的檢測(cè)探針及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)海洋環(huán)境微生物的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，它涉及可用于檢測(cè)圓海鏈藻的核苷酸序列和以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的核酸分子探針以及利用該分子探針檢測(cè)圓海鏈藻的方法。
背景技術(shù)：
圓海鏈藻(Thalassiosira rotula)是一種世界范圍內(nèi)廣泛存在的廣溫廣鹽性浮游植物，也是我國(guó)近海常見(jiàn)的硅藻優(yōu)勢(shì)種之一，被列為中國(guó)沿岸赤潮生物種類(lèi)名錄。圓海鏈藻增值速度極快，并且能夠產(chǎn)生一些短鏈的醛類(lèi)物質(zhì)，這些醛類(lèi)物質(zhì)能抑制撓足類(lèi)卵的發(fā)育，當(dāng)赤潮發(fā)生時(shí)能夠影響橈足類(lèi)的種群結(jié)構(gòu)，硅藻對(duì)橈足類(lèi)生殖的抑制作用為目前海洋生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。因此，準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)圓海鏈藻及其數(shù)量，了解其在海區(qū)的種群動(dòng)態(tài)，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境及赤潮監(jiān)測(cè)研究具有重要意義。
在分類(lèi)學(xué)上，圓海鏈藻隸屬硅藻門(mén)，圓心硅藻目，海鏈藻科，海鏈藻屬。雖然傳統(tǒng)的從形態(tài)學(xué)上區(qū)分圓海鏈藻并不十分困難，但由于這種方法操作煩瑣，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，當(dāng)樣品量多時(shí)工作量極大。因此，采用新方法新技術(shù)快速識(shí)別圓海鏈藻極具現(xiàn)實(shí)意義。但是，國(guó)際國(guó)內(nèi)目前并沒(méi)有針對(duì)該藻從這方面進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供圓海鏈藻分子生物學(xué)檢測(cè)的遺傳標(biāo)記和方法，它可以從遺傳本質(zhì)上客觀、準(zhǔn)確地對(duì)該藻進(jìn)行檢測(cè)。具體包括1.提供用于圓海鏈藻檢測(cè)的基因片段；2.提供基于前述基因片段的圓海鏈藻的專(zhuān)一性遺傳標(biāo)記，即核酸分子探針；3.提供利用這些遺傳標(biāo)記進(jìn)行快速檢測(cè)圓海鏈藻的方法；4.提供利用這些遺傳標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)圓海鏈藻的方法。
本發(fā)明的最主要理論基礎(chǔ)是核糖體基因及其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列多態(tài)性以及5’核酸酶檢測(cè)法。本發(fā)明的發(fā)明人首先測(cè)定了一株分離自膠州灣的圓海鏈藻的rDNA及ITS區(qū)總長(zhǎng)約3000個(gè)堿基對(duì)的序列，通過(guò)與國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)(Genbank)中所有已經(jīng)公開(kāi)的rDNA區(qū)序列比較發(fā)現(xiàn)，如序列表中SEQ ID NO.1所示的圓海鏈藻rDNA序列與其它生物的相應(yīng)區(qū)域的序列有很大差別。為此發(fā)明人以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出如序列表中SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的總共三個(gè)核酸分子探針。用這三個(gè)探針，發(fā)明人建立了快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)圓海鏈藻的分子生物學(xué)方法。
本發(fā)明所提供的用于圓海鏈藻檢測(cè)的核苷酸序列(T.rotula Seq1.)涵蓋了如圖1所示的18s rDNA部分區(qū)域。其序列及結(jié)構(gòu)特征如序列表SEQ ID NO.1所示。該序列(T.rotula Seq1)可用如實(shí)施例1的方法得到；或者按該序列的核苷酸組成和順序，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上按常規(guī)方法合成得到。
本發(fā)明所述的其中兩個(gè)圓海鏈藻專(zhuān)一性核酸分子探針是以上述序列(T.rotulaSeq1)為基礎(chǔ)，通過(guò)Internet(因特網(wǎng))與國(guó)際分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它所有藻類(lèi)的相應(yīng)序列比較后，用常規(guī)的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)而成的。它們的序列組成及其結(jié)構(gòu)特征分別如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，它們?cè)谛蛄?T.rotula Seq1)中的位置如圖2所示。序列表中SEQ ID NO.2所示的核酸探針(T.rotula primer1)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由21個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或者是由其再經(jīng)修飾、變化，且核苷酸變化量不超過(guò)總核苷酸數(shù)的20％的序列。序列表中SEQ ID NO.3所示的核酸探針(T.rotula primer2)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由25個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或者是由其再經(jīng)修飾、變化，且核苷酸變化量不超過(guò)總核苷酸數(shù)的20％的序列。
本發(fā)明所述的兩個(gè)圓海鏈藻專(zhuān)一性核酸分子探針(T.rotula primer1和T.rotulaprimer2)可按照本發(fā)明已描述過(guò)的序列，通過(guò)常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀合成)。這兩個(gè)探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明所述的兩個(gè)圓海鏈藻專(zhuān)一性核酸分子探針具有較好的種特異性。以它們?yōu)橐粚?duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，結(jié)果只能從含有圓海鏈藻的材料的DNA提取物中擴(kuò)增出大小為83bp的PCR產(chǎn)物。因此，以這兩個(gè)核酸分子探針為引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，通過(guò)判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無(wú)可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)圓海鏈藻，而且所需的樣品量很少。
以T.rotula Seq1的序列為基礎(chǔ)，通過(guò)Internet(因特網(wǎng))與國(guó)際分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它所有藻類(lèi)的相應(yīng)序列比較后，本發(fā)明的發(fā)明人還設(shè)計(jì)出了另一個(gè)圓海鏈藻專(zhuān)一性核酸分子探針，其序列組成和結(jié)構(gòu)特征如序列表中SEQ ID NO.4所示(名稱(chēng)為T(mén).rotula TaqMan Probe)；其在序列(T.rotula Seq1)中的位置如圖2所示。它是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由24個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或者是由其再經(jīng)修飾、變化，且核苷酸變化量不超過(guò)總核苷酸數(shù)的20％的序列。該探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。將該序列的5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)等標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)如TAMRA或Dabcyl等標(biāo)記后即可用于對(duì)圓海鏈藻進(jìn)行定性和定量分析的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)反應(yīng)。
以T.rotula primer1和T.rotula primer2兩個(gè)圓海鏈藻專(zhuān)一性核酸分子探針作為引物，以標(biāo)記好的T.rotula TaqMan Probe(5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)如FAM等標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)如TAMRA或Dabcyl等標(biāo)記)為T(mén)aqMan探針，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)明了一種可同時(shí)對(duì)圓海鏈藻進(jìn)行檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)分析方法，即RQ-PCR反應(yīng)。這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。


圖1為圓海鏈藻核糖體DNA(rDNA)及轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)(ITS)在染色體上的排列順序。其中18s rDNA區(qū)域?yàn)楸景l(fā)明所涉及的核苷酸序列存在的區(qū)域。圖中，SSU為小亞基，LSU為大亞基，ITS為轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)。
圖2為PCR結(jié)果。其中，所用引物為T(mén).rotula primer1和T.rotula primer2。各電泳道所對(duì)應(yīng)的藻種為L(zhǎng)ane2.尖刺偽菱形藻；Lane3，14.圓海鏈藻；Lane4.旋鏈角毛藻；Lane5.柔弱角毛藻；Lane6.纖細(xì)角毛藻；Lane7.微型角毛藻；Lane8米氏裸甲藻；Lane9.裸甲藻；Lane11.赤潮異灣藻；Lane12.塔瑪亞歷山大藻；Lane13.新月菱形藻；Lane15.中肋骨條藻；Lane16.微小原甲藻；Lane17.直鏈藻；Lane18.膜質(zhì)周形藻；Lane19.H2O；Lane1，10.DNA標(biāo)記DL2,000(從上到下各條帶大小依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
圖3為各稀釋度DNA溶液熒光信號(hào)曲線(xiàn)。圖中橫座標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱座標(biāo)為熒光強(qiáng)度，與橫座標(biāo)平行的雙箭頭粗線(xiàn)為T(mén)hreshold.從左至右各曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)的圓海鏈藻細(xì)胞濃度(個(gè)細(xì)胞/μlDNA)依次為1.1×106、1.1×105、1.1×104、1.1×103、1.1×102，每個(gè)濃度上樣三次。
圖4為定量計(jì)數(shù)圓海鏈藻的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1.用于檢測(cè)圓海鏈藻的核苷酸序列的制備本發(fā)明所用的圓海鏈藻分離自膠州灣天然海水樣品。通過(guò)反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的F/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照/黑暗周期為12h/12h，光照強(qiáng)度為4000Lx，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃。
用0.45μm的微孔濾膜或10000r/min離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的圓海鏈藻藻細(xì)胞，用TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)洗下藻體，加入2倍體積的預(yù)熱至55℃的抽提緩沖液(3％(w/v)CTAB，1％(w/v)sarkosyl，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl pH 8.0，1％(v/v)2-mercaptoethanol)，55℃處理1小時(shí)，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘，取上相；向上相中加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，重復(fù)上步一次；之后的操作同常規(guī)的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE buffer溶解。
取提取的DNA溶液1μl加入49μl的PCR反應(yīng)液中(在50μl的反應(yīng)體系中包括50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.5U polymerase，正反向引物各3μM)進(jìn)行第一輪PCR。其中正向引物的序列是5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC-3’，反向引物的序列為5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’?；靹蚝螅湃胗袩嵘w的PCR儀中。PCR程序?yàn)?4℃3分鐘；94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。將所得的PCR產(chǎn)物用Watson公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，取1μl加入如上所述的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行第二輪PCR。此輪PCR所用的引物分別是5’-CCTTTGTACACACCGCCC-3’(正向)，5’-CACGGTACTTGTWYRCTATCGGT-3’(反向)。PCR程序?yàn)?4℃3分鐘；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。第二輪的PCR產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，割膠切下最亮的條帶克隆入pMD18-T載體，于XL1-Blue大腸桿菌中無(wú)性繁殖后，用M13/pUC(-20和M13/pUC(-48)引物對(duì)在商用的自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序，從測(cè)出的序列中即可獲得如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸組成和排列。
實(shí)施例2.T.rotula primer1和T.rotula primer2的設(shè)計(jì)和合成通過(guò)與Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相應(yīng)區(qū)域的序列做比較，發(fā)現(xiàn)如序列表中SEQ ID NO.1所示的序列與其他生物的相應(yīng)序列有很大差別，為此發(fā)明人以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的兩個(gè)核酸分子探針。根據(jù)這兩個(gè)探針或其互補(bǔ)序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA合成儀上即可獲上述的核苷酸序列。
實(shí)施例3.用常規(guī)PCR法檢測(cè)圓海鏈藻本實(shí)施例選用了本實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)的幾株優(yōu)勢(shì)浮游植物作為參照藻，它們是分離自膠州灣的旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纖細(xì)角毛藻(C.gracile)、微型角毛藻(C.minimum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、尖刺偽菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、膜質(zhì)舟形藻(Navicula membranacea)、直鏈藻(Melosirasp.)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、分離自渤海灣的微小原甲藻(Prorocentrem minimun)，分離自大鵬灣的塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarens)，分離自大連灣的赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)，它們均通過(guò)反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)這些藻和提取這些藻及圓海鏈藻的DNA。
取各種藻的DNA提取物1μl，按實(shí)施例1所述的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，以序列表2(T.rotula primer1)和序列表3(T.rotula primer2)所述的核苷酸序列作為正反向引物。PCR程序?yàn)?4℃3分鐘；94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳后拍照，得到如圖3所示的結(jié)果。從圖3中可知，從圓海鏈藻DNA模板中擴(kuò)增出一條大小為83bp的PCR產(chǎn)物；從其它藻的DNA模板基本未見(jiàn)到特異性擴(kuò)增。
因此，對(duì)于某待檢樣品，以其DNA提取物為模板，以T.rotula primer1和T.rotulaprimer2為引物，以本實(shí)施例所述的PCR程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果PCR產(chǎn)物中有大小為83bp的條帶，即可判定該樣品中有圓海鏈藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為圓海鏈藻。
本方法的優(yōu)點(diǎn)由于本方法使用的是圓海鏈藻的專(zhuān)一性引物并通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，因此該方法能非常準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否存在圓海鏈藻，只要有相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，即可判定待檢樣品中有圓海鏈藻存在，而且根據(jù)PCR產(chǎn)物量的多少，還可初步估計(jì)樣品中圓海鏈藻的多少。同時(shí)本方法靈敏度很高，只要有很少的待檢材料即可進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。
實(shí)施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探針的制備根據(jù)序列表中SEQ ID NO.4所示序列，用FAM熒光物質(zhì)標(biāo)記其5’端，用TAMRA標(biāo)記其3’端。整個(gè)合成和標(biāo)記過(guò)程可在商用的探針合成和標(biāo)記儀上即可一次性完成。
實(shí)施例5.圓海鏈藻的RQ-PCR檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(培養(yǎng)了1周)的圓海鏈藻培養(yǎng)物計(jì)數(shù)，其細(xì)胞濃度為2.2×105個(gè)/ml，收集200ml培養(yǎng)物，于4℃10000r/min離心10分鐘，小心吸棄上清，沉淀用TE buffer溶解，再加入400μl預(yù)熱至55℃的抽提緩沖液(配方見(jiàn)實(shí)施例1)，55℃處理1小時(shí)，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入800μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；之后的操作完全按照Watson公司的植物葉DNA提取試劑盒的有關(guān)操作進(jìn)行，只是最后一步用40μl TE液從吸附柱上洗下DNA(每1μl DNA溶液對(duì)應(yīng)1.1×106個(gè)細(xì)胞。
取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度(各稀釋度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度依次為1.1×106個(gè)/μl、1.1×105個(gè)/μl、1.1×104個(gè)/μl、1.1×103個(gè)/μl、1.1×102個(gè)/μl。然后分別取1μl DNA溶液加入49μlRQ-PCR反應(yīng)體系(10×Ex TaqBuffer10μl；25mmol/L MgCl28μl；dNTP mixture(各2.5mmol/L)6μl；20mmol/LTh.rotula primer1 1μl；20mmol/L Th.rotula primer2 1μl；20mmol/L Th.rotulaProbe 0.4μl，0.5U/μl Ex Taq 0.5μl，于Bioer Line-gene FQD-33A儀中，按PCR程序(94℃5分鐘(94℃15秒60℃50秒)40個(gè)循環(huán))反應(yīng)，并實(shí)時(shí)記錄熒光信號(hào)，得到如圖4示結(jié)果。該圖顯示了各DNA溶液在PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)增加的變化曲線(xiàn)。根據(jù)RQ-PCR的原理，臨界線(xiàn)(Threshold)與各DNA溶液熒光信號(hào)曲線(xiàn)的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為該DNA溶液的CT值。從圖4獲得各稀釋度DNA溶液的CT值。結(jié)合各DNA溶液的稀釋度、各向稀釋度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度和CT值，得到如表1所示的數(shù)據(jù)。
表1.各DNA溶液的稀釋度及其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度和CT值、實(shí)際用于RQ-PCR的細(xì)胞數(shù)

以用于RQ-PCR的實(shí)際細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫座標(biāo)，以相應(yīng)的CT值為縱座標(biāo)，即可繪制出如圖5示的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。該曲線(xiàn)的方程式為y＝-3.4857x+40.174；其回歸系數(shù)為R2＝0.9962。
對(duì)于某一待測(cè)樣品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，測(cè)出其CT值。以其CT值即可在圖5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上算出該待測(cè)樣品的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而推算出其中圓海鏈藻的細(xì)胞濃度。
本方法最大的優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，通過(guò)該方法既可知道待檢樣品中是否有圓海鏈藻存在，還可同時(shí)知道有多少該藻種存在。
本方法另一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，這是由實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法本身以及本方法擴(kuò)增的針對(duì)的靶片段所決定的。對(duì)于某一物種來(lái)說(shuō)，核糖體基因在染色體上的拷貝數(shù)是恒定的，不會(huì)隨著細(xì)胞的生理狀態(tài)、生活環(huán)境的不同而改變，也就是說(shuō)樣品中細(xì)胞的數(shù)量與樣品中染色體DNA上核糖體基因的數(shù)量是呈線(xiàn)性相關(guān)的，由于本方法擴(kuò)增的靶片段是染色體DNA上的核糖體基因，因此擴(kuò)增信號(hào)的強(qiáng)弱直接反映了待檢樣品中細(xì)胞數(shù)量的多少。
另外本方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單、省時(shí)，整個(gè)過(guò)程4個(gè)小時(shí)內(nèi)即可全部完成，可以實(shí)現(xiàn)海區(qū)中圓海鏈藻動(dòng)態(tài)的跟蹤監(jiān)測(cè)。
序列表<110>中國(guó)海洋大學(xué)<120>圓海鏈藻的檢測(cè)探針及檢測(cè)方法<160>4<210>1<211>200<212>DNA<213>圓海鏈藻(Thalassiosira rotula)<400>1accctttgta cacaccgccc gtcgcaccta ccgattgaat ggtccggtga 50ggactcggga ttgtggcttg gctccttcat tggggcctga ccgcgagaac100ttgtccgaac cttatcattt agaggaaggt gaagtcgtaa caaggtttcc150gtaggtgaaa tctctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat200<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2ttgtggcttg gctccttcat t 21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3ttgttacgac ttcaccttcc tctaa 25<210>4
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4ggcctgaccg cgagaacttg tccg 2權(quán)利要求
1.一種圓海鏈藻的檢測(cè)探針，其特征是該探針來(lái)源于如SEQ ID NO.1所示的圓海鏈藻rDNA核苷酸序列中的兩段寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)探針，其特征是這兩個(gè)探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.2所示，序列為5’ttgtggcttggctccttcatt，或其互補(bǔ)序列5’-aatgaaggagccaagccacaa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.3所示，序列為5’ttgttacgacttcaccttcctctaa，或其互補(bǔ)序列5’ttagaggaaggtgaagtcgtaacaa。
5.一種圓海鏈藻的分子檢測(cè)方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3兩個(gè)核酸分子探針為一對(duì)PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)檢測(cè)圓海鏈藻。
6.一種圓海鏈藻的快速檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)方法，其特征是采用熒光定量PCR方法，以SEQID NO.2和3兩個(gè)核酸分子探針為PCR引物，以一條用熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列為T(mén)aqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示5’-ggcctgaccgcgagaacttgtccg，或其互補(bǔ)序列5’-cggacaagttctcgcggtcaggcc。
8.按照權(quán)利要求7所述的用熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)環(huán)境微生物的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了以圓海鏈藻核糖體DNA(rDNA)核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，以該核酸分子探針為一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無(wú)可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)圓海鏈藻。本發(fā)明還公開(kāi)了用這些探針采用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)圓海鏈藻的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1786196SQ200510104328
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 何閃英, 米鐵柱, 蔡青松, 甄毓 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)