專利名稱：冬蟲(chóng)夏草菌的一種仿生學(xué)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬蟲(chóng)夏草菌的一種仿生學(xué)培養(yǎng)方法，屬于生物領(lǐng)域的微生物培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，屬子囊菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，別名蟲(chóng)草，是寄生于磷翅目蝙蝠蛾Hepialus spp.幼蟲(chóng)的一種蟲(chóng)生真菌，也是一種名貴的藥用真菌。我國(guó)古代民間就對(duì)冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值有一定的認(rèn)識(shí)。蟲(chóng)草味甘性平，可保肺腎、補(bǔ)精髓、化痰止咳，對(duì)治療肺結(jié)核、老人畏寒、咳嗽、衰弱、產(chǎn)婦和老人貧血虛弱、遺精、陽(yáng)痿、自汗盜汗、腰膝酸痛、神經(jīng)衰弱、病后久弱、咯血吐血、慢性腎炎等有很好的效果，常食用可調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)人體免疫力。正是由于冬蟲(chóng)夏草有如此諸多的藥用功能和淵源的藥用歷史，近年來(lái)這一野生資源瀕臨枯竭，使得科研者和開(kāi)發(fā)商都非常關(guān)注冬蟲(chóng)夏草的代用資源的研究。
有三種途徑可以部分地解決此問(wèn)題一是人工栽培子實(shí)體，我國(guó)花了很大的人力物力，雖已經(jīng)掌握了人工栽培的基本技術(shù)，但至今仍無(wú)法商業(yè)化生產(chǎn)；二是利用分子生物技術(shù)克隆編碼這些功能物的基因，在其他生物體內(nèi)表達(dá)這些功能物，但目前對(duì)冬蟲(chóng)夏草的大部分功能的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未研究清楚，基因克隆也就無(wú)從談起；三是利用無(wú)性型菌株進(jìn)行菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)，再?gòu)木z體中提取功能組分，這也許是目前較為現(xiàn)實(shí)和簡(jiǎn)捷的一條開(kāi)發(fā)途徑(莫明和等，菌物系統(tǒng)20(4)482-485，2001)。
冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的研究很為活躍，在世界范圍內(nèi)報(bào)道的冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型有10余種，分屬于10個(gè)屬。可以想象冬蟲(chóng)夏草不可能有如此之多的無(wú)性型，而且分屬于不同的屬。尹定華等(中國(guó)中藥雜志，1995，20(12)707-710)認(rèn)為，冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性階段系一新種，定名為中國(guó)被毛孢H.sinensis。劉作易等(貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31(1)3-5)也證明了中國(guó)被毛孢是冬蟲(chóng)夏草的真正無(wú)性型，其他從冬蟲(chóng)夏草上分離的與冬蟲(chóng)夏草有相同或相似化學(xué)成分、藥理作用和臨床療效的菌株，可作為冬蟲(chóng)夏草的代用品。趙錦等采用分子生物學(xué)手段，從基因水平對(duì)冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性階段進(jìn)行分子鑒定，進(jìn)一步證明其無(wú)性階段是中國(guó)被毛孢，并且認(rèn)為之所以會(huì)重復(fù)分離出某些雜菌，可能是因?yàn)镃.sinensis在自然界中主要分布于喜瑪拉雅山脈附近海拔3000-5000m的高山草地上或較為寒冷的北方地區(qū)，分離者按一般的習(xí)慣將分離物放在較高溫的地方培養(yǎng)，造成C.sinensis菌絲死亡，而培養(yǎng)出那些經(jīng)常與C.sinensis長(zhǎng)在一起的真菌種類(lèi)，并被誤認(rèn)為是C.sinensis的無(wú)性型。
因此，得到冬蟲(chóng)夏草菌的真正無(wú)性型——中國(guó)被毛孢的無(wú)菌純培養(yǎng)是對(duì)其進(jìn)行人工培養(yǎng)的第一步。通常有三種分離途徑，即通過(guò)新鮮蟲(chóng)草僵蟲(chóng)組織、子實(shí)體及子囊孢子進(jìn)行分離，其中以單孢子分離最為可靠。由于冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)環(huán)境的影響，對(duì)采集標(biāo)本的整體滅菌很難得到其無(wú)菌培養(yǎng)物，而對(duì)子實(shí)體中剛剛彈射出的子囊孢子的分離，其成功率遠(yuǎn)高于將標(biāo)本表面消毒后的分離。(莫明和等，菌物系統(tǒng)20(4)482-485)。在已經(jīng)證明所分離菌確為中國(guó)被毛孢的分離方法中，(莫明和等，菌物系統(tǒng)20(4)482-485)(劉錫琎等，真菌學(xué)報(bào)，8(1)35-40，1989)，僅劉錫琎等的方法是以單孢子進(jìn)行分離的。其方法是取含子囊孢子待放的子座進(jìn)行滅菌，在無(wú)菌條件下將整個(gè)子座的兩端使懸于培養(yǎng)皿蓋上，然后將此蓋蓋于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，或?qū)⒆幼眉?xì)線栓其柄部懸吊于胨PDA斜面試管內(nèi)。在子囊孢子彈射之后，經(jīng)鏡檢，挑取萌發(fā)的子囊孢子得到純培養(yǎng)。但其分離程序存在著煩瑣的缺點(diǎn)。
對(duì)中國(guó)被毛孢菌絲體進(jìn)行人工發(fā)酵培養(yǎng)并采用其發(fā)酵物代替野生冬蟲(chóng)夏草，國(guó)內(nèi)有30多個(gè)單位的科學(xué)工作者在進(jìn)行研究，已取得較為理想的結(jié)果。所用方法均為深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，一般用發(fā)酵罐攪拌供氧及搖床供氧的方式進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)提高產(chǎn)量(郭宏春等，微生物學(xué)雜志，2003，1，23(1)，50-54)。張顯恥、何道珍探索出發(fā)酵工藝為原種-搖床培養(yǎng)-一級(jí)培養(yǎng)-二級(jí)培養(yǎng)-三級(jí)培養(yǎng)-四級(jí)培養(yǎng)-菌液分離-干燥。(張顯恥等，藥物分析雜志，1999，7(5)5-6)。由于中華被毛孢生長(zhǎng)環(huán)境海拔高，溫度低，具有嗜低溫、生長(zhǎng)極慢的特點(diǎn)，并且生長(zhǎng)過(guò)程需要氧氣。用發(fā)酵罐、搖床等設(shè)備培養(yǎng)周期長(zhǎng)，耗能很大，而且發(fā)酵罐、搖床等設(shè)備本身投入的造價(jià)也很高，因此，用此方法生產(chǎn)出的產(chǎn)品價(jià)格昂貴，市場(chǎng)難以接受。很難用于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用低投入、高產(chǎn)出的方法培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲體，使生產(chǎn)的產(chǎn)品價(jià)格便宜，能夠?yàn)槭袌?chǎng)所接受。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法，是以冬蟲(chóng)夏草菌的菌絲段細(xì)胞或組織進(jìn)行液體靜置培養(yǎng)。
本發(fā)明通過(guò)冬蟲(chóng)夏草菌的菌絲段細(xì)胞或組織進(jìn)行液體靜置培養(yǎng)，極大的提高了菌絲段生物量的增長(zhǎng)速度，大幅度降低了生產(chǎn)成本，使其更利于大規(guī)摸生產(chǎn)。
本發(fā)明的培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟培養(yǎng)基配置，菌絲段的接種(接種量為培養(yǎng)基體積百分比的5％-30％)，菌絲段的收獲，培養(yǎng)過(guò)程中溫度為10-20℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
本發(fā)明所用的菌絲段細(xì)胞或組織是由無(wú)菌的單個(gè)子囊孢子萌發(fā)所形成的。
本發(fā)明的單孢子分離步驟為(一)蟲(chóng)草菌種的采集采挖子實(shí)體粗壯飽滿、可妊部發(fā)育明顯的冬蟲(chóng)夏草完整菌蟲(chóng)復(fù)合體，放入13-16℃培養(yǎng)箱中養(yǎng)護(hù)，保持合適的濕度，以手輕捏泥土后不結(jié)塊為宜。
(二)子囊孢子的收集和萌發(fā)清除子實(shí)體表面雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水沖洗，用75％的酒精進(jìn)行表面消毒，置13-16℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待子囊開(kāi)始彈射子囊孢子時(shí)，將開(kāi)始彈射孢子的子實(shí)體伸入滅菌的生理鹽水中，充分洗脫子囊孢子，將洗脫的子囊孢子放在13-16℃培養(yǎng)箱中3-5天，以便萌發(fā)。
(三)接種針的制備將最小號(hào)縫衣針針尖磨鈍，再將頭部?jī)蛇叡M量磨薄，形成小鏟狀，然后套入普通接種棒中固定。
(四)單孢子分離和純培養(yǎng)在無(wú)菌操作下，將含有子囊孢子的液體搖勻，倒少量于滅菌的分離培養(yǎng)基平板中，靜置5-10min，待水被吸入瓊脂后，在低倍顯微鏡下用(三)制備的接種針挑取單個(gè)發(fā)芽的子囊孢子，接入滅菌的分離培養(yǎng)基平板中，每個(gè)平板均勻接入6-8個(gè)，將接種部位作好標(biāo)記，放入13-16℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天，用消毒手術(shù)刀挖取未污染的帶有子囊孢子的培養(yǎng)基放入新的分離培養(yǎng)基平板中，每平板一株，用膠帶封口防止水分散失，放入13-16℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，45-55天左右形成肉眼可見(jiàn)的菌落。
本發(fā)明單孢子分離時(shí)所用的分離培養(yǎng)基為8-12g/L蛋白胨、14-23g/L葡萄糖、13-16g/L瓊脂、180-230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。
參照陳月琴等報(bào)道的鑒定方法，(Biochemical Systematics and Ecology，2001，29，597-607)，證明由此分離方法分離得到的冬蟲(chóng)夏草菌株是中國(guó)被毛孢。
本發(fā)明中國(guó)被毛孢菌絲體的液體靜置培養(yǎng)方法是指液體深度為1-5cm的淺層液體靜置培養(yǎng)。
本發(fā)明采用的淺層液體靜置培養(yǎng)的培養(yǎng)基是適合中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
本發(fā)明采用的適合中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是大豆粉4-7g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖90-120g/L、酵母膏0.2-0.6g/L、K2HPO40.7-1.1g/L、MgSO40.3-0.8g/L，pH6，培養(yǎng)溫度是10-20℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
本發(fā)明菌絲段細(xì)胞或組織每培養(yǎng)一段時(shí)間在無(wú)菌條件下用機(jī)械的方法搗碎一次。
本發(fā)明所述的一段時(shí)間是指一個(gè)月。
本發(fā)明菌絲段細(xì)胞或組織機(jī)械搗碎的程度是單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括以下步驟單孢子分離及純培養(yǎng)，培養(yǎng)基配置，菌絲體純培養(yǎng)菌種的接種，每培養(yǎng)一個(gè)月在無(wú)菌條件下用機(jī)械的方法將菌絲體打碎成單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段，培養(yǎng)六個(gè)月后收獲，培養(yǎng)過(guò)程中溫度為15-18℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.冬蟲(chóng)夏草菌具有兩型現(xiàn)象，寄生在幼蟲(chóng)體內(nèi)時(shí)呈酵母型，蟲(chóng)菌體是以出芽或斷裂的方式進(jìn)行增殖。(李泉森等，冬蟲(chóng)夏草菌世代交替的初步研究，中國(guó)中藥雜志1998，23(4)，210-212)。其絲狀真菌每個(gè)細(xì)胞都有分化成同樣菌株的生物學(xué)特點(diǎn)。寄主死后腐生時(shí)呈菌絲型，以正常的菌絲形態(tài)生長(zhǎng)。由于絲狀真菌的生長(zhǎng)只能通過(guò)頂端延長(zhǎng)的方式進(jìn)行，不能象其在幼蟲(chóng)體內(nèi)的菌絲段是通過(guò)分生組織的分裂而形成，生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢。如果在菌絲體的體外培養(yǎng)中模仿蟲(chóng)菌體寄生幼蟲(chóng)體內(nèi)的增殖方式，人工促使中國(guó)被毛孢菌絲型向酵母型轉(zhuǎn)變，以增加菌株數(shù)和生長(zhǎng)點(diǎn)，將會(huì)大幅度提高生長(zhǎng)極慢的中國(guó)被毛孢的生長(zhǎng)速度。本發(fā)明在菌絲段液體靜置培養(yǎng)中，采用仿生學(xué)的方法，每培養(yǎng)一段時(shí)間通過(guò)人工的方法將菌絲打碎成小片段，甚至單細(xì)胞，以充分增加菌株數(shù)和生長(zhǎng)點(diǎn)，提高了菌絲段的生長(zhǎng)速度，使菌絲產(chǎn)量大大提高。本工藝對(duì)普通真菌--生長(zhǎng)速度快的真菌的培養(yǎng)價(jià)值不大，但對(duì)冬蟲(chóng)夏草這類(lèi)生長(zhǎng)極慢的真菌來(lái)說(shuō)，效果極為顯著。單純從生產(chǎn)量來(lái)講，用搖床100ml液體培養(yǎng)基培養(yǎng)一個(gè)月可得2克左右干菌絲體，按本發(fā)明方法，100ml液體培養(yǎng)基可得5.7克干菌絲體。
2.本發(fā)明通過(guò)冬蟲(chóng)夏草菌的單孢子對(duì)其進(jìn)行分離，所得到的純培養(yǎng)最為可靠。分離方法的步驟簡(jiǎn)單，擺脫了污染率高，篩選過(guò)程煩瑣、周期長(zhǎng)的困境。通過(guò)本發(fā)明的分離方法分離得到的冬蟲(chóng)夏草菌株已經(jīng)證明是其唯一的無(wú)性型--中國(guó)被毛孢。
3.本發(fā)明液體薄層培養(yǎng)的液體深度不超過(guò)5cm，因此可以自然給氧，獲氧較充足，不需動(dòng)力攪拌，不需要發(fā)酵罐、搖床等昂貴設(shè)備的投入。同時(shí)培養(yǎng)基的用量相對(duì)較少。在培養(yǎng)的六個(gè)月中，只接種一次，省去了發(fā)酵罐培養(yǎng)的反復(fù)接種、放大培養(yǎng)的人力，減少了污染的機(jī)會(huì)。極大的降低了成本。只需定做無(wú)毒、耐高溫的薄層塑料容器或玻璃容器及常用的高壓滅菌設(shè)備、投資10余萬(wàn)元即可進(jìn)行生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益極為顯著。
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一將無(wú)菌的冬蟲(chóng)夏草菌絲體按15％的體積百分比接種于大豆粉6g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖100g/L、酵母膏0.4g/L、K2HPO40.8g/L、MgSO40.4g/L，pH6的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中，靜置于培養(yǎng)架上，培養(yǎng)溫度為18℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
六個(gè)月后收獲菌絲體。
實(shí)施例二培養(yǎng)程序均按實(shí)施例一進(jìn)行，所不同之處在于培養(yǎng)期間每個(gè)月將培養(yǎng)容器放在磁力攪拌器上攪拌0.5小時(shí)(攝氏18℃)，使菌絲體打碎。
實(shí)施例三1.冬蟲(chóng)夏草菌中國(guó)被毛孢的分離(一)采集蟲(chóng)草菌種2002年7月在四川康定由當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)幫助從雅家埂采挖多株子實(shí)體粗壯飽滿、可妊部發(fā)育明顯的冬蟲(chóng)夏草完整菌蟲(chóng)復(fù)合體，放入15℃培養(yǎng)箱中養(yǎng)護(hù)，特別注意保持合適的濕度，泥土以手輕捏后不結(jié)塊為宜。
(二)子囊孢子的收集和萌發(fā)清除子實(shí)體表面雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水沖洗，用75％的酒精進(jìn)行表面消毒，置15℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天記錄觀察。待子囊開(kāi)始彈射子囊孢子時(shí)，將開(kāi)始彈射孢子的子實(shí)體伸入盛有滅菌生理鹽水的青霉素小瓶中，充分洗脫子囊孢子，將洗脫的子囊孢子放在15℃培養(yǎng)箱中4天，以便萌發(fā)。
(三)接種針的制備用磨刀石將最小號(hào)縫衣針針尖磨鈍，再將頭部?jī)蛇叡M量磨薄，形成小鏟狀，然后套入普通接種針中固定。
(四)單孢子分離和純培養(yǎng)將低倍顯微鏡放入超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外照射1小時(shí)，無(wú)菌操作將(二)處理的青霉素小瓶搖勻，倒少量于滅菌的分離培養(yǎng)基(11g/L蛋白胨、22g/L葡萄糖、14g/L瓊脂、190g去皮土豆煎水汁/L、pH6)平板中，靜置8min，待水被吸入瓊脂后，在低倍顯微鏡下用(三)制備的接種針挑取單個(gè)發(fā)芽的子囊孢子，接入滅菌的分離培養(yǎng)基平板中，每個(gè)平板均勻接入6個(gè)，將接種部位作好標(biāo)記，放入15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用消毒手術(shù)刀挖取未污染的帶有子囊孢子的培養(yǎng)基放入新的分離培養(yǎng)基平板中，每平板一株，用膠帶封口防止水分散失，放入15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察生長(zhǎng)狀況。50天形成肉眼可見(jiàn)的菌落，90天左右形成的菌落直徑可達(dá)1.5-2.5cm，菌落由致密的菌絲體組成，堅(jiān)硬；菌落表面不平，象蚯蚓糞狀；菌落周?chē)幸蝗υ摼置诘淖睾稚镔|(zhì)，背面也呈棕褐色。菌絲半透明狀，不易挑取。后期菌絲深入培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基吸收，形成中空的突起，培養(yǎng)5個(gè)月，氣生菌絲發(fā)達(dá)。
2.菌絲大規(guī)模培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制備大豆粉6g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖105g/L、酵母膏0.5g/L、K2HPO40.9g/L、MgSO40.7g/L，pH6，115℃高壓30min。
3.中國(guó)被毛孢的淺層液體靜置培養(yǎng)將上述純化的菌種剔除瓊脂部分，在無(wú)菌條件下研磨成單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段(肉眼可見(jiàn)為段棒狀)，加適量滅菌水，按5％的體積百分比接種到培養(yǎng)容器中冷卻到18℃以下的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液深度為4cm，18℃下靜置培養(yǎng)，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光，培養(yǎng)期間，每個(gè)月無(wú)菌操作取出培養(yǎng)器皿中的菌絲體置于滅菌的勻漿機(jī)中勻漿兩分鐘，再將混合物重新放會(huì)原培養(yǎng)器皿中，6個(gè)月收獲。
實(shí)施例四培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于在無(wú)菌操作下將待接種的冬蟲(chóng)夏草菌絲和滅菌的磁力棒放入培養(yǎng)容器中，封好口后，放在磁力攪拌器上，18℃攪拌10小時(shí)，將菌絲攪成單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段(肉眼可見(jiàn)為段棒狀)，接種到培養(yǎng)容器中冷卻到18℃以下的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液深度為4cm，18℃下靜置培養(yǎng)，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光，培養(yǎng)期間每個(gè)月將培養(yǎng)容器放在磁力攪拌器上攪拌0.5-1小時(shí)(攝氏18度)，六個(gè)月收獲菌絲體。
實(shí)施例五培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于單孢子分離培養(yǎng)基為9g/L蛋白胨、18g/L葡萄糖、15g/L瓊脂、230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。
菌絲體大規(guī)摸培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基為大豆粉4g/L、蛋白胨3g/L、葡萄糖90g/L、酵母膏0.2g/L、K2HPO40.7g/L、MgSO40.4g/L，pH6，培養(yǎng)溫度是17℃，實(shí)施例六培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于單孢子分離培養(yǎng)基為10g/L蛋白胨、14g/L葡萄糖、16g/L瓊脂、180g去皮土豆煎水汁/L、pH6。
菌絲體大規(guī)摸培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基為大豆粉5g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖120g/L、酵母膏0.3g/L、K2HPO40.9g/L、MgSO40.3g/L，pH6，培養(yǎng)溫度是16℃，實(shí)施例七培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于單孢子分離培養(yǎng)基為11g/L蛋白胨、16g/L葡萄糖、15g/L瓊脂、220g去皮土豆煎水汁/L、pH6。
菌絲體大規(guī)摸培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基為大豆粉7g/L、蛋白胨2g/L、葡萄糖100g/L、酵母膏0.6g/L、K2HPO41.1g/L、MgSO40.7g/L，pH6，培養(yǎng)溫度是18℃。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲(chóng)夏草菌的仿生學(xué)培養(yǎng)方法，其特征在于以所述菌的菌絲段細(xì)胞或組織進(jìn)行液體靜置培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟培養(yǎng)基配置，菌絲段的接種，菌絲段的收獲，培養(yǎng)過(guò)程中溫度為10-20℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
3.按照權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的菌絲段細(xì)胞或組織是由無(wú)菌的單個(gè)子囊孢子萌發(fā)所形成的。
4.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的單孢子分離步驟為(一)采集蟲(chóng)草菌種采挖子實(shí)體粗壯飽滿、可妊部發(fā)育明顯的冬蟲(chóng)夏草完整菌蟲(chóng)復(fù)合體，放入13-16℃培養(yǎng)箱中養(yǎng)護(hù)，保持合適的濕度，(二)子囊孢子的收集和萌發(fā)清除子實(shí)體表面雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水沖洗，用75％的酒精進(jìn)行表面消毒，置13-16℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待子囊開(kāi)始彈射子囊孢子時(shí)，將開(kāi)始彈射孢子的子實(shí)體伸入滅菌的生理鹽水中，充分洗脫子囊孢子，將洗脫的子囊孢子放在13-16℃培養(yǎng)箱中3-5天，以便萌發(fā)，(三)接種針的制備用磨刀石將最小號(hào)縫衣針針尖磨鈍，再將頭部?jī)蛇叡M量磨薄，形成小鏟狀，然后套入普通接種棒中固定，(四)單孢子分離和純培養(yǎng)在無(wú)菌操作下，將含有子囊孢子的液體搖勻，倒少量于滅菌的分離培養(yǎng)基平板中，靜置5-10min，待水被吸入瓊脂后，在低倍顯微鏡下用(三)制備的接種針挑取單個(gè)發(fā)芽的子囊孢子，接入滅菌的分離培養(yǎng)基平板中，每個(gè)平板均勻接入6-8個(gè)，將接種部位作好標(biāo)記，放入13-16℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天，用消毒手術(shù)刀挖取未污染的帶有子囊孢子的培養(yǎng)基放入新的分離培養(yǎng)基平板中，每平板一株，用膠帶封口防止水分散失，放入13-16℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，45-55天形成肉眼可見(jiàn)的菌落。
5.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于分離培養(yǎng)基為8-12g/L蛋白胨、14-23g/L葡萄糖、13-16g/L瓊脂、180-230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。
6.按照權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的冬蟲(chóng)夏草菌是中國(guó)被毛孢。
7.按照權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述液體靜置培養(yǎng)是指液體深度為1-5cm的淺層液體靜置培養(yǎng)。
8.按照權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述淺層液體靜置培養(yǎng)的培養(yǎng)基是適合中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
9.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述適合中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是大豆粉4-7g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖90-120g/L、酵母膏0.2-0.6g/L、K2HPO40.7-1.1g/L、MgSO40.3-0.8g/L，pH6，培養(yǎng)溫度是10-20℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
10.按照權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的菌絲段細(xì)胞或組織每培養(yǎng)一段時(shí)間在無(wú)菌條件下用機(jī)械的方法搗碎一次。
11.按照權(quán)利要求10所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的一段時(shí)間是指一個(gè)月。
12.按照權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述菌絲段細(xì)胞或組織機(jī)械搗碎的程度是單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段。
13.按照權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)方法包括以下步驟單孢子分離及純培養(yǎng)，培養(yǎng)基配置，菌絲體純培養(yǎng)菌種的接種，每培養(yǎng)一個(gè)月在無(wú)菌條件下用機(jī)械的方法將菌絲體打碎成單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段，培養(yǎng)六個(gè)月后收獲，培養(yǎng)過(guò)程中溫度為15-18℃，壓力為常壓，光強(qiáng)為室內(nèi)自然光。
全文摘要
本發(fā)明涉及冬蟲(chóng)夏草菌絲體的一種仿生學(xué)培養(yǎng)方法。培養(yǎng)過(guò)程包括，單孢子分離及純培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的配置，菌絲體純培養(yǎng)菌種的接種，淺層液體靜置培養(yǎng)，六個(gè)月后收獲菌絲體。培養(yǎng)過(guò)程中每一個(gè)月用機(jī)械的方法將菌絲體打碎成單細(xì)胞或多細(xì)胞菌絲段。本發(fā)明的單孢子分離方法得到的純培養(yǎng)，證明是冬蟲(chóng)夏草菌唯一的無(wú)菌型－中國(guó)被毛孢。本發(fā)明的培養(yǎng)方法，不需要發(fā)酵罐、搖床等昂貴設(shè)備的投入，極大的降低了成本。與深層液體發(fā)酵培養(yǎng)相比，1g干菌絲體的生產(chǎn)成本降低50％以上。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1766083SQ20051010483
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者田向榮, 田紹進(jìn), 劉彥威, 蘇敬良, 韓博 申請(qǐng)人:田向榮