專利名稱：一種雙歧桿菌胞外多糖及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌胞外多糖及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌屬(Bifodobacterium)主要存在于人和動物的腸道內(nèi)，對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、控制內(nèi)毒素血癥、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。它是人體腸道內(nèi)典型的有益細菌，其生長繁殖貫穿在人的整個生命歷程中。雙歧桿菌在厭氧環(huán)境下迅速生長繁殖產(chǎn)生大量乳酸，降低系統(tǒng)pH值而抑制和殺死腸道病原菌，使菌群保持正常的微生態(tài)平衡。雙歧桿菌的存在和含量是人體健康的一個標(biāo)志。如果機體內(nèi)雙歧桿菌停止了生長，人和動物就很難健康生存。也正因為如此，有關(guān)雙歧桿菌優(yōu)良菌株、生理功能及應(yīng)用等相關(guān)研究已成為近20年來長盛不衰的熱點。
胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的粘液或莢膜多糖，易與菌體分離，可通過深層發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物多糖具有植物多糖不具備的優(yōu)良性質(zhì)，它們生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域和病蟲害條件限制，具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。它不僅可以作為膠凝劑、成膜劑、保鮮劑、乳化劑等添加劑用于食品和制藥中來改善產(chǎn)品的硬度和黏度，而且還具有抗氧化、抗衰老以及增強免疫等多種功能。到目前為止，已大量投產(chǎn)的微生物EPS主要有黃原膠(Xanthan gum)、結(jié)冷膠(Gellan gum)、小核菌葡聚糖(Seleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、熱凝多糖(Curdlan)等。
目前有關(guān)胞外多糖的專利報道多集中在真菌多糖和部分細菌多糖，很少見到益生菌胞外多糖的專利。如2000年5月，蘇文金、鄭忠輝、黃耀堅、宋思揚、陳晉安申請中國專利一種海洋細菌胞外多糖的生產(chǎn)工藝及其用途，專利申請?zhí)枮?0106345.6；2004年7月，張俐娜、金勇、陳莉、陳立國、張志強申請中國專利一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法，專利申請?zhí)枮?00410060650.1；2004年5月，張偉云、楊金宇、陳佳萍、施佩花申請中國專利一種真菌胞外多糖復(fù)合物的制備及其應(yīng)用，專利申請?zhí)枮?00410041167.9；2001年4月，J·安巴、J·阿熱日、S·沙尤申請了關(guān)于過度產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌突變體的專利(專利申請?zhí)枮?1808204.1)，但是也并不是對乳酸菌EPS的系統(tǒng)研究。
關(guān)于雙歧桿菌的專利文獻，多集中在功能性雙歧桿菌菌株的開發(fā)利用，如2002年7月，約翰·凱文·柯林斯、杰拉爾德·克里斯托弗·奧沙利文、利亞姆·奧馬霍尼、弗格斯·沙納漢、巴里·基利(營養(yǎng)健康有限公司)申請中國專利益生菌雙歧桿菌菌株，專利申請?zhí)枮?2818577.3；2003年7月，G·C·威斯科米、L·G·羅蒂尼(阿爾法·瓦瑟曼公司)申請中國專利雙歧桿菌和含有它們的制品，專利申請?zhí)枮?3178401.1；2003年2月，王伯瑤、王國興、黃寧、吳琦(四川大學(xué))申請專利雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白在制藥中的應(yīng)用，專利申請?zhí)枮?3117357.8。而關(guān)于雙歧桿菌代謝產(chǎn)物的研究寥寥無幾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株具有較高胞外多糖產(chǎn)量的雙歧桿菌。
本發(fā)明所提供的雙歧桿菌，是星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10，已于2005年04月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1355。
星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355分離自廣西巴馬長壽老人腸道。在改良MRS培養(yǎng)基上，星狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumasteroides)BM-10 CGMCC №1355的菌落為乳白色或微帶黃色，略有凸起，且菌落周圍粘稠狀，直徑約1.0-1.5mm。個體形態(tài)為不規(guī)則G+無芽孢桿菌，呈現(xiàn)桿狀，有Y字形、V字形，有的還呈火柴頭狀，均是雙歧桿菌特有的形態(tài)。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種雙歧桿菌胞外多糖及其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)雙歧桿菌胞外多糖的方法，是發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355得到的胞外多糖。
所述方法中，用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培養(yǎng)基中的碳源和氮源分別為蔗糖和大豆蛋白胨。用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的培養(yǎng)基中的無機鹽含有MnSO4。
用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的培養(yǎng)基優(yōu)選由下述成分組成蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，牛肉膏3.00％、吐溫80 0.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％，半胱氨酸鹽酸鹽0.03％，玉米漿3.00％，水1000mL；所述百分數(shù)均為質(zhì)量百分比。
所述方法中的培養(yǎng)溫度可為25-30℃，培養(yǎng)時間可為24-28h，培養(yǎng)基的初始pH值可為5.0-6.0。
所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25℃，培養(yǎng)時間優(yōu)選為24h、培養(yǎng)基的初始pH值優(yōu)選5.5。
所述方法中，得到的雙歧桿菌胞外多糖可按照以下步驟進行純化1)在發(fā)酵上清液中加入無水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷凍離心收集沉淀；2)利用8,000～12,000Da孔徑的透析袋，對去離子水，透析12h后以6000rpm的離心速度離心，收集上清液，得到多糖溶液；3)按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩后靜置，離心，取上清重復(fù)，直至無游離蛋白；4)采用凝膠層析法純化步驟3)得到的上清液，所述凝膠層析法的分離條件為以Sepharose CL-6B為凝膠填料，加樣4mL，樣品濃度為4.0g/L，0.05％NaCl作為洗脫劑，以30mL/h的流速洗脫，收集490nm吸收峰處樣品，得到一分子量為3.92×105Da的雜多糖。
所述方法中，步驟1)中所加入的無水乙醇體積與發(fā)酵上清液的體積相同；步驟3)中用Sevag試劑提取6次，每次振蕩20min；步驟4)中所用的層析柱的柱長為800mm，柱內(nèi)徑為16mm。
上述方法得到的雙歧桿菌胞外多糖也屬于本發(fā)明的保護范圍。
發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355得到的胞外多糖具有較強的粘度，對乳酸菌的生長有一定的促進作用，具有較強的體外清除DPPH自由基的能力和增強星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355對腸上皮細胞Caco-2的粘附作用等優(yōu)良特性。
星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355來源于廣西巴馬長壽老人腸道，具有可靠的安全性，制成活菌制劑，可省去常規(guī)發(fā)酵、提取等繁瑣工藝。對星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC№1355產(chǎn)EPS合成條件進行優(yōu)化后，其產(chǎn)量可達到1.21g/L。本發(fā)明的生產(chǎn)雙歧桿菌胞外多糖的方法原料簡單，對設(shè)備要求低，操作簡單，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的分離和鑒定1、菌株的篩選經(jīng)無菌袋采集回來的廣西巴馬長壽老人腸道樣品，及時移入超凈工作臺，以無菌紙稱取25克，溶解于225mL的生理鹽水中，振蕩均勻，得到10-1的菌懸液。以針管取1mL此菌懸液注入9mL的生理鹽水管中，得到稀釋度為10-2的菌懸液，厭氧條件下逐級稀釋，直到10-10。
每個稀釋度分別取0.4mL，接種到加有0.3％無菌CaCO3粉末的改良MRS培養(yǎng)基(蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，磷酸氫二鉀0.2％，檸檬酸銨0.2％，乙酸鈉0.5％，葡萄糖2％，MgSO4.7H2O 0.058％，MnSO4.7H2O 0.025％，吐溫80 0.1％，半胱氨酸鹽酸鹽0.03-0.04％，玉米漿0.3-0.4％，蒸餾水1000mL，pH 6.2-6.5)的厭氧管內(nèi)，接種后立即于冰浴中滾管，在管壁上形成一層均勻的培養(yǎng)基混合液的薄膜，37℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取出觀察，稀釋度越大的管壁上單個菌落越清晰，在產(chǎn)生溶解圈的菌落(疑為乳酸菌)中，那些菌落表面粘稠或者菌落周圍有擴散現(xiàn)象的菌株為產(chǎn)EPS的可疑菌株。
將產(chǎn)EPS的可疑菌株，分別接種于改良MRS好氧管和厭氧管里，37℃培養(yǎng)，檢測其24h內(nèi)所產(chǎn)EPS的量并進行比較。挑選好氧管內(nèi)不生長、厭氧管內(nèi)生長且EPS產(chǎn)量較大的菌株(確定為嚴格厭氧菌，增加雙歧桿菌的概率)作為目標(biāo)菌株。將其中一株目標(biāo)菌株BM-10進行鑒定。
2、菌株BM-10的鑒定通過果糖-6-磷酸解酮酶試驗，有機酸的測定，有氧生長試驗，細胞形態(tài)觀察，接觸酶試驗，硝酸還原試驗，靛基質(zhì)反應(yīng)等進行屬的鑒定。鑒定結(jié)果如表1所示。確定菌株BM-10為雙歧桿菌屬。
表1.菌株BM-10屬的鑒定指標(biāo)與鑒定結(jié)果


注“+”表示反應(yīng)陽性，“-”表示反應(yīng)陰性。
進一步采用Biolog全自動微生物鑒定儀分析鑒定，結(jié)果表明菌株BM-10為Bifidobacterium asteroides，即星狀雙歧桿菌，該菌株已于2005年04月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1355。
實施例2、利用星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC№1355生產(chǎn)胞外多糖1、多糖的檢測苯酚-硫酸試劑可與游離的糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起顯色反應(yīng)，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。
將星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355在改良MRS液體培養(yǎng)基(同實施例1)中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，在發(fā)酵上清液中加入無水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷凍離心收集沉淀；利用8,000～12,000Da孔徑的透析袋，對去離子水，透析12h后以6000rpm的離心速度離心，收集上清液，得到多糖溶液；按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩后靜置，離心，取上清重復(fù)，直至無游離蛋白，得到粗多糖水溶液，取該粗多糖水溶液0.1mL，加入1.9mL蒸餾水，然后加入1mL 6％苯酚溶液，緩慢加入5mL濃硫酸，靜置10min后，充分振蕩，放置20min后，利用722分光光度計，檢測其在490nm波長下的吸光值，并計算多糖的含量。結(jié)果表明多糖的含量為317.39g/L。
2、胞外多糖生產(chǎn)條件的優(yōu)化選擇適合于雙歧桿菌生長的MRS、改良MRS、PTYG培養(yǎng)基，分別采用2％的接種量，37℃下厭氧培養(yǎng)24h，測定其生長量及EPS的含量，確定基本培養(yǎng)基。
分別對比不同的培養(yǎng)基初始pH值(2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0)、發(fā)酵溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、42℃)及接種量(0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％)對EPS產(chǎn)量的影響，確定最適培養(yǎng)條件。
分別對比不同種類的碳源(蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、蜜二糖、纖維二糖、海藻糖)、氮源(大豆蛋白胨、普通蛋白胨、聚蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)和無機鹽類對EPS產(chǎn)量的影響，確定最佳培養(yǎng)基成分，以待進行下一步試驗。
根據(jù)上述培養(yǎng)基成分選擇的結(jié)果，以合適的因素水平，設(shè)計三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實驗。
表2.三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計因素水平編碼值表

為了得到更大產(chǎn)量的雙歧桿菌EPS，針對其合成條件進行了優(yōu)化。確定了改良MRS培養(yǎng)基為最適宜生產(chǎn)EPS的基本培養(yǎng)基后，通過單因素試驗，以EPS的合成量為評價指標(biāo)，分別確定了最佳的培養(yǎng)時間24h、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)基的初始pH值5.5和接種量3％，最佳的碳源、氮源和無機鹽類分別為蔗糖、大豆蛋白胨和MnSO4。以蔗糖、大豆蛋白胨和MnSO4為因素設(shè)計三元二次正交回歸旋轉(zhuǎn)試驗，以EPS的合成量為評價指標(biāo)，確定因素最佳組合為蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，培養(yǎng)基中其他組分同改良MRS即牛肉膏3.00％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％，半胱氨酸鹽酸鹽0.03％、玉米漿3.00％，蒸餾水1000mL(以上均為質(zhì)量百分比)。此培養(yǎng)條件下，菌株BM-10胞外多糖的產(chǎn)量可達1.21g/L。
3、星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355胞外多糖純化條件的優(yōu)化(1)殘?zhí)侨コ龡l件的優(yōu)化針對濃縮、醇沉、離心3個提取環(huán)節(jié)進行EPS提取條件的優(yōu)化。采用醇提和透析的方法，分析并確定EPS粗提液中殘?zhí)侨コ龡l件為1)濃縮利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60℃真空濃縮，將發(fā)酵上清液濃縮到原體積的1/3。
2)醇沉在濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，-20℃沉淀12h。然后以8000rpm的離心速度，4℃下冷凍離心3次，收集沉淀。
3)殘?zhí)堑娜コ捎猛肝龇?。用溫水將上述沉淀溶解，利?,000～12,000Da孔徑的透析袋，對去離子水，透析12h后以6000rpm的離心速度離心，收集上清液(多糖溶液)。
(2)蛋白去除條件的優(yōu)化通過加熱法(50℃加熱30min)、等電點法(pH5.0)、Sevag法(按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩20min后靜置，離心，取上清重復(fù)，直至無游離蛋白)、三氯乙酸法(10％TCA振蕩均勻后靜置30min)除蛋白，測定OD280nm檢測殘留的蛋白含量，并檢測EPS產(chǎn)量。結(jié)果表明，Sevag法去蛋白效果最明顯，以Sevag法中的各因素設(shè)計4因素3水平正交試驗，在此選用Sevag試劑中氯仿同正丁醇的比例為A因素，提取次數(shù)為B因素，作用時間為C因素，多糖溶液同Sevag試劑的比例為D因素，各取三個水平，以蛋白去除效果為指標(biāo)，進行下列正交試驗。
表3.Sevag法去蛋白正交試驗L9(34)設(shè)計與結(jié)果


綜合考慮對各因素的影響，應(yīng)優(yōu)先選擇處理7即按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑，V氯仿∶V正丁醇＝4∶1，提取6次，每次振蕩20min，此條件下蛋白質(zhì)的去除率可達到38.39％。
(3)EPS的凝膠色譜純化的優(yōu)化選用Sephacral S-100HR、Sepharose CL 6B兩種分離范圍有一定差異的凝膠填料，分析比較它們對菌株BM-10EPS純化的影響。
選擇不同的加樣量(2mL、4mL、6mL)、樣品濃度(2.0g/L、4.0g/L和6.0g/L)、洗脫速度(15mL/h、30mL/h、45mL/h)，對比其對于EPS分離效果的影響，確定最佳的分離條件。紫外光譜掃描法及高效液相色譜法進行純度鑒定。確定Sepharose CL-6B為凝膠填料，加樣量4mL，樣品濃度4.0g/L，洗脫劑為0.05％NaCl，洗脫速度為30mL/h為最佳的凝膠色譜分離條件。
4、胞外多糖的純化通過對星狀雙歧桿菌BM-10菌株合成的EPS分離純化工藝的摸索，得到了使EPS產(chǎn)量較高且純度較高的純化路線，具體如下1)濃縮利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60℃真空濃縮，將發(fā)酵上清液濃縮到原體積的1/3。
2)醇沉在濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，-20℃沉淀12h。然后以8000rpm的離心速度，4℃下冷凍離心3次，收集沉淀。
3)殘?zhí)堑娜コ捎猛肝龇āＳ脺厮畬⑸鲜龀恋砣芙猓?,000～12,000Da孔徑的透析袋，對去離子水，透析12h后以6000rpm的離心速度離心，收集上清液(多糖溶液)。
4)去蛋白采用Sevag法(按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩20min后靜置，離心，取上清重復(fù)，直至無游離蛋白)，萃取6次，每次振蕩20min。
5)純化采用凝膠層析法。以Sepharose CL-6B為凝膠填料，層析柱的柱長為800mm，柱內(nèi)徑為16mm。加樣4mL，樣品濃度4.0g/L，0.05％NaCl作為洗脫劑，以30mL/h的流速洗脫，10min/管收集。收集490nm吸收峰處樣品，經(jīng)紫外光譜掃描和HPLC檢測，無蛋白質(zhì)和核酸檢出，為單一多糖組分。
5、EPS分子量的檢測得到星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的胞外多糖的純品以后，采用Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，ELSD檢測器，ShodexKS2805凝膠色譜柱進行檢測。標(biāo)準品Dext ran T系列，均為Pharamacia公司產(chǎn)品。先采用標(biāo)準葡聚糖Dext ran T系列制作標(biāo)準曲線，然后根據(jù)多糖樣品在相同色譜條件下的洗脫體積或保留時間，用標(biāo)準曲線計算該樣品的相對分子質(zhì)量。流動相為蒸餾水，流速為1mL/min，柱溫為60℃。經(jīng)檢測EPS的分子量為3.92×105Da。
6、EPS物理特性及生理功能的檢測(1)溶解性的檢測取星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的胞外多糖干粉分別溶于水、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯等溶劑中，觀察試驗結(jié)果。結(jié)果表明，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯等有機溶劑。
(2)EPS粘度性質(zhì)的檢測分別檢測溫度、pH值及NaCl濃度對EPS粘度的影響。結(jié)果如表1、2和3所示，表明星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的胞外多糖具有較高的粘度，其25℃的粘度為3.0578。其粘度隨溫度的升高而降低，對于離子強度穩(wěn)定，對于堿則不穩(wěn)定。
表1EPS粘度隨溫度的變化

表2EPS粘度隨pH值的變化

表3EPS粘度隨離子強度的變化


(3)EPS對病原菌的作用將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌活化，取無菌蒸餾水稀釋，取0.1mL菌液于LB固體培養(yǎng)基表面，用滅菌玻棒抹均勻。
每個平皿放入7個牛津杯。多糖液按倍比稀釋成3個濃度，分別為10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL。中和(pH＝7)前后的多糖溶液均需要經(jīng)0.2μm微孔過濾除菌。每個牛津杯分別注入0.2mL多糖溶液，無菌生理鹽水作空白，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。測量抑菌圈大小，比較中和前后多糖溶液、生理鹽水的抑菌能力。結(jié)果表明EPS對以上致病菌無明顯的抑制作用。
(4)EPS對乳酸菌生長促進作用將保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌分別接入10ml改良MRS培養(yǎng)基中，保加利亞乳桿菌、于酪乳桿菌2種菌分別進行如下四種處理對照(不加糖)、5mLEPS(EPS濃度為100g/L，下面各處理均采用這個濃度)、0.5g葡萄糖、0.5g葡萄糖和5mLEPS，分別培養(yǎng)24h，測定活菌數(shù)，看其最終數(shù)量的變化趨勢。測定0h，10h，24h3個時間點的活菌數(shù)。結(jié)果如表4和表5所示，表明與單獨添加葡萄糖相比EPS對乳酸菌有一定的促進作用。
表4保加利亞乳桿菌不同處理方式的影響

表5干酪乳桿菌不同處理方式的影響


(5)清除自由基參照文獻Nandita S.，Rajini P.S.Free radical scavenging activity ofan aqueous extract of potato peel..Food Chemistry，2004，85611-616和Yinrong L.，Yeap F.Antioxidant activities of polyphenols from sage(Salvia officinalis).Food Chemistry，2001，75197-202進行操作，將0.8mL濃度為100g/L的雙歧桿菌EPS和2.2mL的0.1mM DPPH溶液(含95％乙醇)混合，用力搖勻，于室溫反應(yīng)30min，離心，收集上清液。用等量的重蒸水作對照，2.2mL乙醇與0.8mL重蒸水混合液調(diào)儀器零點，在517nm處測定上清液以及對照溶液吸光值，結(jié)果如表6所示，表明EPS體外清除DPPH作用十分顯著。
表6EPS對DPPH的體外清除作用

(6)細胞粘附試驗將培養(yǎng)好的人腸道上皮細胞Caco-2株進行消化，制成細胞懸液(105個/mL)，接種于含20％胎牛血清但不含抗生素的MEM培養(yǎng)液后，放置入內(nèi)含潔凈細胞飛片的24孔板(Costa公司)中，每孔內(nèi)加入1mL細胞懸液，于5％CO237℃細胞培養(yǎng)箱中孵育至單細胞貼壁。無菌PBS液洗滌3次，每孔加入1mL菌液(含星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355 108cfu/mL)與1mL MEM細胞培養(yǎng)液的混合液，37℃，CO2含量為5％的空氣中孵育2h。用無菌PBS洗滌細胞飛片以除去未結(jié)合的細菌。然后火焰固定，革蘭氏染色，顯微鏡下隨機挑選20個視野，計數(shù)50個細胞上粘附的細菌數(shù)，每個處理作3個平行，再計算平均每個細胞所粘附的細菌數(shù)。結(jié)果如表7所示，表明EPS可明顯增強菌株BM-10對腸上皮細胞Caco-2的粘附作用。
表7EPS對人腸道上皮細胞Caco-2株的粘附作用

權(quán)利要求
1.星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355。
2.一種生產(chǎn)雙歧桿菌胞外多糖的方法，是發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355，得到胞外多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中，用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC№1355的培養(yǎng)基中的碳源和氮源分別為蔗糖和大豆蛋白胨。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培養(yǎng)基中的無機鹽含有MnSO4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用于培養(yǎng)星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培養(yǎng)基由下述成分組成蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，牛肉膏3.00％、吐溫80 0.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％，半胱氨酸鹽酸鹽0.03％，玉米漿3.00％，水1000mL；所述百分數(shù)均為質(zhì)量百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中的培養(yǎng)溫度為25-30℃，培養(yǎng)時間為24-28h，培養(yǎng)基的初始pH值為5.0-6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)基的初始pH值5.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，得到的雙歧桿菌胞外多糖按照以下步驟進行純化1)在發(fā)酵上清液中加入無水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷凍離心收集沉淀；2)利用8,000～12,000Da孔徑的透析袋，對去離子水，透析12h后以6000rpm的離心速度離心，收集上清液，得到多糖溶液；3)按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑進行提取，然后離心，直至上清液中無游離蛋白；所述Sevag試劑由氯仿和正丁醇組成，所述氯仿和正丁醇的體積比為4∶1；4)采用凝膠層析法純化步驟3)得到的上清液，所述凝膠層析法的分離條件為以Sepharose CL-6B為凝膠填料，加樣4mL，樣品濃度為4.0g/L，0.05％NaCl作為洗脫劑，以30mL/h的流速洗脫，收集490nm吸收峰處樣品，得到單一多糖組分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，步驟1)中所加入的無水乙醇體積與發(fā)酵上清液的體積相同；步驟3)中用Sevag試劑提取6次，每次振蕩20min；步驟4)中所用的層析柱的柱長為800mm，柱內(nèi)徑為16mm。
10.由權(quán)利要求2至7中任一所述的方法得到的雙歧桿菌胞外多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙歧桿菌胞外多糖及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。本發(fā)明所提供的雙歧桿菌胞外多糖，是發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM－10 CGMCC№1355，得到的胞外多糖。星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM－10 CGMCC№1355來源于廣西巴馬長壽老人腸道，具有可靠的安全性，制成活菌制劑，可省去常規(guī)發(fā)酵、提取等繁瑣工藝。對星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM－10 CGMCC№1355產(chǎn)EPS合成條件進行優(yōu)化后，其產(chǎn)量可達到1.21g/L。本發(fā)明的生產(chǎn)雙歧桿菌胞外多糖的方法原料簡單，對設(shè)備要求低，操作簡單，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/00GK1769425SQ20051010546
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者李平蘭, 歐陽清波, 李偉欣, 張篪, 鄭海濤, 馬長偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)