專利名稱：一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高植物利用土壤閉蓄態(tài)磷素能力的方法，尤其涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磷是植物生長所必需的大量元素之一，為了滿足作物生長的營養(yǎng)需求，達(dá)到高產(chǎn)目的，每年在作物生長季節(jié)施加大量磷肥。但大量研究表明，磷肥施入土壤后，能很快地被吸附到土壤顆粒表面或與土壤一些物質(zhì)(Fe、Al、Ca等)生成難溶的磷酸鹽，從而在很大程度上影響磷的釋放和對(duì)植物的有效性。磷的吸附大大降低了磷酸養(yǎng)分的有效性，因此，缺磷是作物生長的障礙因子。在我國，近14.9億畝耕地中，缺磷(速效磷在10ppm以下)土壤約有10.9億畝，占總耕地的74％，其中嚴(yán)重缺磷(速效磷在5ppm以下)土壤占總耕地的40％。
長期以來，我國農(nóng)村廣泛使用化肥，化肥可以增加土壤肥力，但連續(xù)施用則肥效日減，不得不加大化肥用量。而過量施用化肥，則造成土壤板結(jié)，地力減弱，還影響農(nóng)作物品質(zhì)。熱帶、亞熱帶地區(qū)的土壤含有大量的氧化鐵和氧化鋁等化合物，鐵鋁物質(zhì)的積聚，對(duì)土壤中的磷有很強(qiáng)的固定作用。我國當(dāng)季磷肥利用率僅在10％-20％左右。
目前，我國氮、磷化肥用量已占全世界用量的30％。過量的化學(xué)肥料投入，使我國成為世界上單位化肥投入糧食產(chǎn)出最低的國家之一，化肥成本增長超過糧食增產(chǎn)效益，增產(chǎn)不增收，加重了農(nóng)民負(fù)擔(dān)。而且，我國有機(jī)肥資源豐富，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國畜禽糞便年產(chǎn)生量約為17.3億噸，大量的有機(jī)磷隨畜禽糞便排放到土壤中，全國畜禽糞便年排放量超過全國工業(yè)廢渣和城市生活廢棄物排放量之和，已對(duì)周圍環(huán)境造成嚴(yán)重污染。
磷化肥的低效利用，使土壤中積累的磷量逐年增加。畜禽排泄的磷是水質(zhì)污染和湖泊等地表水超營養(yǎng)的原因之一，使農(nóng)業(yè)面源污染成為水系富營養(yǎng)化、土壤酸化與重金屬污染最重要因素，威脅生態(tài)安全與可持續(xù)發(fā)展。由于不合理施肥、動(dòng)物高磷糞便、水土流失等原因引起的江河、湖泊等水體富養(yǎng)化問題也日益加重，我國85％的國控湖泊富營養(yǎng)化問題嚴(yán)重，從內(nèi)陸小水庫到大湖泊以至海灣水域主要污染指標(biāo)，都毫無例外是總磷和總氮。
磷礦是不可再生資源。磷礦在世界范圍內(nèi)瀕臨枯竭，全球低成本的磷肥資源預(yù)計(jì)到2050年將耗盡。我國又是缺磷大國，僅有27億噸磷礦儲(chǔ)量，僅夠維持使用70年左右。我國耕地土壤70％以上是對(duì)磷具強(qiáng)烈化學(xué)固定的酸性與石灰性土壤。由于長期施用磷肥，土壤中已經(jīng)積累了一個(gè)較大的潛在磷庫，包括化學(xué)固定態(tài)磷與家畜糞便中的高機(jī)態(tài)磷。高效活化、利用土壤磷是可以作為替代資源的。農(nóng)田土壤總磷含量高而有效磷缺乏是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的限制性因素。如我國有效磷缺乏的土壤中全磷含量一般在0.04-0.25％(按P2O5計(jì))之間，高的可達(dá)0.4％以上。
植酸酶(Phytase)在植物和微生物中廣泛存在，它是催化植酸(肌醇六磷酸)水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。主要有二種類型，即源于微生物的肌醇六磷酸3-磷酸水解酶(E.C.3.1.3.8)和源于植物的肌醇六磷酸6-磷酸水解酶(E.C.3.1.3.26)。
不同來源的植酸酶的最適pH不同。大多數(shù)純化了的植酸酶的最適pH在2～6之間。微生物植酸酶的最適pH范圍較寬，一般在2.5～6.0。植物來源的植酸酶的最適pH范圍較窄，一般在4.8～6.0，在pH3.0時(shí)活性顯著下降甚至失活(Hayes JE，R.A.，Simpson RJ(2000).″Components of organic phosphorusin soil extracts that are hydrolysed by phytase and acid phosphatase.″Biol.Fertil.Soils(32)279-286.)。
植酸酶能將肌醇六磷酸(植酸)的六個(gè)磷逐一分解生成無機(jī)磷酸。1g植酸完全分解理論上可釋放出無機(jī)磷281.6mg。多數(shù)純的植酸酶對(duì)底物的專一性不強(qiáng)，除能夠水解植酸及植酸鹽外，還能水解其它磷酸酯鍵。
到目前為止，共有十余個(gè)植酸酶編碼基因得到了分離克隆，幾乎所有分離到的植酸酶基因都申請(qǐng)了專利。植酸酶基因主要從微生物中分離克隆。目前唯一報(bào)導(dǎo)的植物來源的植酸酶基因是Maugenest等于1997年從萌發(fā)的玉米種子中克隆的。國內(nèi)，姚斌、范云六等(B.Yao 1998)從產(chǎn)植酸酶的黑曲霉菌株A.niger 963中分離克隆出植酸酶phyA基因，其DNA全序列長1506個(gè)核苷酸，編碼467個(gè)氨基酸。
通過研究低磷脅迫條件下，植物根系的生理生化的變化，發(fā)現(xiàn)根系分泌物種類和數(shù)量以及分泌的磷酸酯酶活性增加(Richardson，A.E.，P.A.Hadobas，et al.(2001).″Extracellular secretion of Aspergillus phytase from Arabidopsisroots enables plants to obtain phosphorus from phytate.″Plant J 25(6)641-9.)。研究表明，自然條件下，植物根系能分泌有機(jī)酸和少量磷酸酯酶(主要是植酸酶)，降低根圍土壤pH，促使土壤難溶性礦物磷酸鹽的溶解和水解土壤中的植酸和其它有機(jī)磷，釋放出無機(jī)磷供植株吸收利用。但植物通過這兩種方式吸收利用土壤中植物難利用磷的能力很弱。據(jù)此，人們正嘗試通過以下兩個(gè)途徑來提高植物吸收利用土壤中閉蓄態(tài)磷的能力。
一、提高植株根系分泌物中植酸酶的活性。由于土壤中總有機(jī)磷含量的20-50％是植酸磷，但植物吸收利用植酸磷的能力很弱。Richardson等在擬南芥植株中轉(zhuǎn)入黑曲霉植酸酶基因，使其在擬南芥植株根系組成型表達(dá)并分泌到胞外。轉(zhuǎn)基因植株根部的植酸酶活性顯著提高，且分泌胞外，使根系分泌物中植酸酶的活性也顯著提高。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在含Na2HPO4和植酸磷的培養(yǎng)基上長勢(shì)相同，但非轉(zhuǎn)基因植株在以植酸為磷營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長明顯受阻。這表明植株根系表達(dá)并分泌高活性植酸酶可大大提高植株從植酸中獲取磷的能力。
二、提高植株根系分泌有機(jī)酸的能力。國外不同的研究小組嘗試將不同來源的檸檬酸合成酶(CS citrate synthase)基因分別轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中(López-Bucio，et al，2000；Koyama，et al，2000)，研究表明，表達(dá)CS能促進(jìn)植物檸檬酸的合成，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的根部檸檬酸分泌量增加，植株能更加有效地吸收利用磷。
如何利用土壤中豐富的磷源，一直是土壤學(xué)家和植物營養(yǎng)學(xué)家所關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對(duì)磷素的吸收利用能力，迄今為止，目前的研究還僅停留在以模式植物煙草和擬南芥為研究對(duì)象的水平，尚缺乏一種行之有效的提高農(nóng)作物高效吸收利用植酸磷能力的方法。提高農(nóng)作物對(duì)土壤中磷的利用能力和效率，對(duì)于提高作物產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，節(jié)約磷資源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境乃至提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益等方面都具有重要的意義，所以提供一種提高農(nóng)作物利用土壤植酸磷能力的方法具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法，包括以下步驟將SEQ ID NO.1所示的融合有植酸酶基因和引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌和定位的信號(hào)肽的核苷酸序列可操作的連接到啟動(dòng)子之后，構(gòu)建單子葉植物或雙子葉植物重組表達(dá)載體；將該植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物即可。
上述方法中，其中所述的啟動(dòng)子為植物組織特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選為Ubi啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子；所述的植物重組表達(dá)載體可通過將SEQ ID NO.1所示的核苷酸和信號(hào)肽序列可操作的連接到植物組織特異性啟動(dòng)子之后制備而成，作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述的植物重組表達(dá)載體優(yōu)選為單子葉植物表達(dá)載體pGA1161EAO或雙子葉植物表達(dá)載體pBINPLUSEAO。
所述的植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物的方法可為本領(lǐng)域的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，例如可以是農(nóng)桿菌侵染法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法、電擊穿孔法或微注射法，本發(fā)明優(yōu)選為農(nóng)桿菌侵染法或基因槍法；所述的受體農(nóng)作物優(yōu)選為油菜、玉米、大豆或小麥，更優(yōu)選為油菜或玉米。
為了便于篩選成功轉(zhuǎn)化的作物同時(shí)為了更好的符合安全性要求，上述方法中還包括構(gòu)建植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體，將植物重組表達(dá)載體與植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達(dá)植酸酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物。
所述的植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建可按照常規(guī)方法進(jìn)行，所述的選擇標(biāo)記基因可選自Bar基因(除草劑抗性的選擇性標(biāo)記)、Npt-II基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、DHFR基因(二氫葉酸還原酶基因)、Gent基因(慶大霉素抗性基因)等，優(yōu)選為Bar基因。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)的實(shí)施方案，所述的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體為用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar或用于雙葉植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pBINPLUSBa。
更優(yōu)選為將選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar和單子葉植物表達(dá)載體pGA1161EAO用基因槍法共同轉(zhuǎn)化玉米或?qū)⑦x擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pBINPLUSBar和雙子葉植物表達(dá)載體pBINPLUSEAO用農(nóng)桿菌侵染法共同轉(zhuǎn)化油菜。
本發(fā)明將來源于微生物的植酸酶基因[優(yōu)選采用專利號(hào)為ZL 97121731.9中的來源于Aspergillus sp.98(曲霉)的植酸酶基因]置于啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)之下，加上引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌和定位的信號(hào)肽序列，控制基因產(chǎn)物的定位(該信號(hào)肽序列可以引導(dǎo)植酸酶分泌到細(xì)胞外)，構(gòu)建包含有植酸酶核苷酸序列的植物重組表達(dá)載體，將該植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到植物尤其是重要的農(nóng)作物中，所得到的轉(zhuǎn)基因植物可以在根部高效表達(dá)植酸酶，在植物的整個(gè)生長過程中持續(xù)產(chǎn)生植酸酶，并向根外分泌，以降解土壤中大量存在的植酸磷，使其分解為植物可以利用的無機(jī)磷源，從而滿足作物對(duì)磷的需求。
本發(fā)明方法可以有效提高作物對(duì)土壤閉蓄態(tài)磷素尤其是植酸磷的利用能力，從而大大減少對(duì)土壤中礦物磷肥的需求，有效緩解磷源匱乏的局面，同時(shí)可分解消耗土壤中形成的潛在磷庫，減輕由此帶來的水質(zhì)污染和湖泊、地表水超營養(yǎng)等一系列威脅生態(tài)安全與可持續(xù)性發(fā)展的問題。
本發(fā)明所要解決的另外一個(gè)技術(shù)問題是提供一種檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物利用植酸磷能力的方法。
本發(fā)明所要解決的該技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的一種檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物利用植酸磷能力的方法，包括以下步驟將固體或液體MS培養(yǎng)基中的無機(jī)磷全部替換為等量的植酸磷，將轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的后代種子表面消毒、萌發(fā)后置于MS固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間；向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的培養(yǎng)基中加入由FeCl3.6H2O和磺基水楊酸所配制成的染色劑；如染色劑顏色無明顯變化，表明轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物利用植酸磷能力高，如果染色劑顏色變?yōu)闇\紅色至無色，表明轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物利用植酸磷能力低。
上述方法中，優(yōu)選的，向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的固體MS培養(yǎng)基中加入的染色劑由以下重量百分比的組分組成FeCl3.6H2O 0.03％、磺基水楊酸0.3％、余者為水；向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的液體MS培養(yǎng)基中加入為液體培養(yǎng)基1/7體積的染色劑，其中該染色劑以下重量百分比的組分組成FeCl3.6H2O 0.12％、磺基水楊酸1.2％、余者為水。
本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確的檢測出轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對(duì)植酸磷利用能力的高低，具有結(jié)果準(zhǔn)確、步驟簡捷、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為植酸酶基因單子葉植物表達(dá)載體PGA1161EAO的酶切電泳圖；11Kb Ladder；2pGA1161EAO質(zhì)粒；3pGA1161EAO經(jīng)BamHI酶切。
圖2為表達(dá)載體PHP17042的物理示意圖；圖3為選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar的酶切電泳圖；1PHP17042Bar經(jīng)PstI酶切；21Kb Ladder。
圖4為轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA的PCR結(jié)果；1-15轉(zhuǎn)基因再生玉米植株(其中4，5，7PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性)；16100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；17陽性對(duì)照；18陰性對(duì)照。
圖5為轉(zhuǎn)基因玉米植株的Southern-blot結(jié)果；11Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)；2陽性對(duì)照；13陰性非轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)照3；4植株1的基因組DNA分別用EcoRV，BamHI酶切；5，6植株2的基因組DNA分別用EcoRV，BamHI酶切；7，8植株3的基因組DNA分別用EcoRV，BamHI酶切；9，10植株4的基因組DNA分別用EcoRV，BamHI酶切；11，12植株5的基因組DNA分別用EcoRV，BamHI酶切。
圖6為轉(zhuǎn)基因玉米植株的SDS-PAGE結(jié)果；1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3不同稀釋倍數(shù)的陽性對(duì)照；4，5，6株系C83，C43，C76；7陰性對(duì)照(黃早四)；8，9，10株系C47，C36，C84。
圖7為轉(zhuǎn)基因玉米植株的Western-blot結(jié)果；1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3不同稀釋倍數(shù)的陽性對(duì)照；4，5，6株系C83，C43，C76；7陰性對(duì)照(黃早四)；8，9，10株系C47，C36，C84。
圖8為固體培養(yǎng)基上測定轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)植酸利用能力；圖9為液體培養(yǎng)基上測定轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)植酸利用能力；圖10為玉米根部組織中植酸酶活性測定結(jié)果；1、陰性對(duì)照；2、事件C83W；3、事件C83Y。
圖11為植酸酶基因雙子葉植物表達(dá)載體的電泳圖；1pBINPLUSEAO經(jīng)HindIII和Eco R I酶切；2.1Kb Ladder。
圖12為Bar基因雙子葉植物表達(dá)載體的電泳圖；1pBINPLUSBar經(jīng)HindIII和Eco R I酶切；2.1Kb Ladder。
圖13為轉(zhuǎn)基因油菜T1植株的PCR擴(kuò)增植酸酶基因；M為DNA Marker，1-7為轉(zhuǎn)基因T1植株DNA擴(kuò)增片段。
圖14為轉(zhuǎn)基因油菜T2植株的Southern-blot結(jié)果；1-3為轉(zhuǎn)基因T1植株，CK+為陽性對(duì)照，CK-為陰性對(duì)照，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Phytase基因500bp片段為探針。
圖15為固體培養(yǎng)基上測定轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)植酸利用能力；圖16為液體培養(yǎng)基上測定轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)植酸利用能力；圖17為油菜根部組織中植酸酶活性測定結(jié)果；1陰性對(duì)照；2轉(zhuǎn)基因油菜株系04p1602；3轉(zhuǎn)基因油菜株系04p4906。
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
試驗(yàn)材料及來源工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶、修飾酶、pGEM5Zf質(zhì)粒和T-載體分別購自Promega公司，New England Biolabs公司和Gibco公司。
化學(xué)試劑酵母浸膏和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司，CHU(N6)大量鹽購自Gibco公司，組織培養(yǎng)用的其它試劑和激素購自Sigma公司。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
引物合成由北京奧科生物工程公司和上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)》(Sambrook等編著，科學(xué)出版社，1992年版)一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
1、構(gòu)建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的中間載體1.1合成信號(hào)肽序列上游片段5’端加XbaI位點(diǎn)，下游片段5’端加SnaBI位點(diǎn)，兩片段序列如下，酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出上游片段5’tccccgcggtctagacccgggatatcatgggaagaattgctagaggctcaaaaatgagttctctcattgtgttct3’(SEQ ID NO.2)，下游片段5’ccggaattctacgtaagctgtggtttcggaagccaaattgagtgacacaatactacaagcaaagacacaatga 3’(SEQ ID NO.3)，反應(yīng)體系上下游片段(0.5μg/μl)， 各6.0μl10X PCR buffer5.0μldNTP(1.5mM each) 2.8μlTaq Polymerase(5U/μl)0.2μlMgCl2(25mM) 5.0μlH2O 24.2μl反應(yīng)條件94℃，30Sec；30℃，1Min；72℃，20Min。
反應(yīng)結(jié)束取1μl，電泳檢測150bp大小的條帶清晰?；厥辗磻?yīng)體系中的片段連接于T-載體。用XbaI，SnaBI酶切該中間載體得到信號(hào)肽序列備用。
1.2擴(kuò)增植酸酶基因上游引物依次加HindIII，XbaI，SnaBI位點(diǎn)，(5’aagcttctagatacgtaatgctggcagtcc 3’，下劃線或斜體為酶切位點(diǎn)(SEQ ID NO.4)，下游引物加HpaI位點(diǎn)(5’gttaacctaagcaaaacactccgcccaat 3’下劃線為酶切位點(diǎn)，SEQ ID NO.5)。PCR模板為質(zhì)粒PIC9A2(B.Yao，C.Y.Z.1998，Science inChina，SeriesC，41(3)330-3360)，PCR擴(kuò)增條件94℃，4Min；52℃，1Min；72℃，1Min 30Sec；34Cycles；72℃，10Min。產(chǎn)物加尾按照常規(guī)方法進(jìn)行，加尾后的產(chǎn)物連接到T-easy載體。XbaI，SnaBI酶切該中間載體后，回收的植酸酶基因與步驟1.1中所制備的信號(hào)肽片段連接，即得。
2、構(gòu)建玉米轉(zhuǎn)化用植物重組表達(dá)載體2.1用于玉米轉(zhuǎn)化的植酸酶基因表達(dá)載體用HindIII和HpaI分別酶切消化上述步驟1中所構(gòu)建的中間載體及表達(dá)載體pGA1161(構(gòu)建過程見Kim S-R，Lee S，Kang H-G，Jeon J-S，Kim K-M，An G，2003.J Plant Biol 46211-214.)，連接后，使其受載體pGA1161上Ubi啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)控制，得到單子葉植物表達(dá)載體pGA1161EAO，該表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定(見圖1)，結(jié)果表明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列已成功的插入到表達(dá)載體pGA1161中。
2.2用于玉米轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因表達(dá)載體Bar基因從載體pAHC25(Christensen AH and Quail HP(1996)TransgenicRes 5213-218.)上用酶切得到，pGEM5Zf經(jīng)PstI酶切后，脫磷酸化，與Bar基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定測序后得到pGEM5ZfBar；BamHI和EcoRV酶切pGEM5ZfBar，BamHI和SmaI酶切PHP17042(構(gòu)建示意圖見附圖2，分別含有H2B(Histone B)啟動(dòng)子，來自于玉米Ubi基因的5端非翻譯區(qū)和內(nèi)含子，PIN II(Proteinase Inhibitor II)終止子)，按常規(guī)方法分別回收目的片段，將兩片斷按照常規(guī)方法連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后得到選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar(酶切鑒定結(jié)果見圖3)。
3、轉(zhuǎn)化玉米授粉9-12天的玉米幼穗，剝離幼胚，置于N6培養(yǎng)基上，28℃，黑暗培養(yǎng)三天后用于基因槍轉(zhuǎn)化。
愈傷系授粉9-12天的玉米幼胚，置于N6培養(yǎng)基上經(jīng)過6-8周繼代培養(yǎng)后得到胚性愈傷系，培養(yǎng)條件同上。
上述玉米幼胚和胚性愈傷均可作為轉(zhuǎn)化起始材料，培養(yǎng)基的配制參照《植物細(xì)胞，組織和器官培養(yǎng)基本方法》(Plant Cell，Tissue and Organ Culturefundamental methods/O.L.Gamborg，G.C.Phillips eds.，Springer)一書中第16章中的方法進(jìn)行。
玉米基因槍轉(zhuǎn)化方法參照上述書中的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化前將玉米幼胚或胚性愈傷置于含120g蔗糖的高滲培養(yǎng)基上4-6小時(shí)后，用于微彈轟擊。使用Bio-Rad公司的PSD/1000 Hellium基因槍，氦氣壓力為1000Psi，真空度為28inch Hg。轟擊結(jié)束后，被轉(zhuǎn)化的材料在高滲培養(yǎng)基上保持1-4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到保持愈傷的培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)3-4天。
選擇培養(yǎng)保持愈傷的培養(yǎng)基中加入3mg/L的BASTA作為選擇壓力，對(duì)被轉(zhuǎn)化的材料進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每兩周繼代一次。
再生經(jīng)過兩個(gè)月的選擇培養(yǎng)后，抗性愈傷在選擇性培養(yǎng)基上生長迅速，顏色新鮮。將抗性愈傷轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基上，兩到三周后，即可得到成熟的胚狀體。
將胚狀體放到MS培養(yǎng)基上生根，即得到再生玉米苗。植酸酶表達(dá)盒PCR陽性的植物轉(zhuǎn)到土壤中，于溫室內(nèi)生長。
4、轉(zhuǎn)基因玉米的分子檢測4.1 PCR檢測正向引物AATTGCTAGAGGCTCAAAAATGA(SEQ ID NO.6)反向引物CTAAGCAAAACACTCCGCCCAA(SEQ ID NO.7)反應(yīng)體系(20μL)再生玉米植株DNA 1μL(20-50ng)；10×緩沖液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加無菌水至20μL。反應(yīng)條件94℃，5分鐘；94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，1分鐘；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。
圖4顯示的是轉(zhuǎn)基因玉米植株P(guān)CR檢測結(jié)果，從圖中可以看出擴(kuò)增片段大小與植酸酶全基因大小一致，約為1.3Kb。
4.2 Southern-blot檢測Southern-blot參照Sambrook J，等編著的《分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，1992年版)中的方法進(jìn)行。具體檢測方法如下1)對(duì)PCR檢測植酸酶基因的為陽性的玉米植株，選取0.5-0.8g葉片組織，液氮研磨后提取基因組DNA，提取方法同PCR檢測中所用。
2)得到的DNA經(jīng)RNase和Proteinase K處理后，再用等體積的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，用紫外分光光度計(jì)測定DNA的量。
3)每個(gè)樣品取15μg DNA酶切過夜，50V，瓊脂糖凝膠電泳6小時(shí)后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
4)預(yù)雜交6小時(shí)后，以植酸酶基因的片段作模板，經(jīng)放射性同位素P32標(biāo)記探針，進(jìn)行雜交。
5)洗膜完成后，尼龍膜壓X光片，所得結(jié)果見圖5。
圖5顯示的是玉米T2代植株的雜交結(jié)果，探針為植酸酶基因的500bp片段，從圖中可以看出轉(zhuǎn)基因玉米植株基因組DNA經(jīng)BamHI單切后雜交，出現(xiàn)分子量約為6Kb和8Kb的兩條帶，經(jīng)EcoRV單切后雜交，出現(xiàn)分子量約為4Kb的一條帶。從該雜交結(jié)果和其它轉(zhuǎn)化體的雜交結(jié)果來看，植酸酶基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，植酸酶基因在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)不高，不超過兩個(gè)。
5、轉(zhuǎn)基因玉米的Western-blot檢測5.1SDS-PAGE方法1)稱取10mg轉(zhuǎn)基因玉米種子粉磨，放入有螺旋帽的離心管中；2)加入200ul抽提緩沖液(60mMTris，pH 6.8；100mM DTT，2％(w/v)SDS)，渦旋振蕩使粉末充分懸浮；3)100℃加熱4min；4)14,000rpm離心10min取上清進(jìn)行SDS-PAGE；5)電泳按照常規(guī)方法進(jìn)行，分離膠濃度為12％；6)電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)對(duì)膠進(jìn)行染色，然后再用脫色液脫色。
5.2 Western-blot方法1)量好膠的大小，按此大小裁剪濾紙和膜(硝酸纖維素膜)，膜、膠、濾紙?jiān)赥ransfer Buffer中浸泡處理30min。
2)在Bio-Rad半干態(tài)電轉(zhuǎn)儀上(蓋子為-，底為+)依次(+→-)放置四張濾紙、膜、膠、另外4張濾紙，每放一層，用玻璃棒趕走氣泡，放好蓋子。穩(wěn)壓10V-20V，電流不超過1.00，2-3小時(shí)。
3)將已轉(zhuǎn)有蛋白質(zhì)的膜標(biāo)記上下，浸泡在20ml封閉液中(以完全浸泡膜為宜)，RT，輕搖1小時(shí)或O/N。
4)回收封閉液，加入一抗，RT，輕搖2h。
5)回收一抗，洗膜4次，20-30ml/次，4min/次。
6)加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的二抗，輕搖1h。
7)回收二抗，洗膜3次，20-30ml/次，4min/次。
8)1×TBS洗膜1次，20-30ml/次，3min/次。
9)加入NBT/BCIP顯色液，適當(dāng)時(shí)取出膜，大量水洗。
圖6和圖7顯示的是轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot的結(jié)果，從圖中可以看出植酸酶基因以在轉(zhuǎn)基因玉米中得到表達(dá)。
6、轉(zhuǎn)基因玉米植株的轉(zhuǎn)基因玉米植株的植酸利用能力測定轉(zhuǎn)基因玉米和油菜的后代種子，經(jīng)表面消毒，萌發(fā)后置于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基以植酸為唯一磷源，在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后，向培養(yǎng)基中加入染色劑，根據(jù)染色劑的顏色變化即可以判斷該轉(zhuǎn)基因玉米植株的利用植酸能力的高低，凡培養(yǎng)基中植酸被分解利用后，染色劑顏色無明顯變化，反之，顏色變?yōu)闇\紅色至無色。
6.1固體培養(yǎng)基上測定轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)植酸利用能力將植物MS培養(yǎng)基中的無機(jī)磷替換為等量的植酸磷，轉(zhuǎn)基因玉米植株在該培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后，用0.03％FeCl3.6H2O和0.3％磺基水楊酸溶液處理30分鐘后，觀察顏色變化，結(jié)果見圖8。
圖8a加入到固體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色無明顯變化，說明生長于該培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因玉米利用植酸能力高；圖8b染色劑；圖8c加入到固體培養(yǎng)基中的染色劑顏色變?yōu)闇\紅色，說明生長于該培養(yǎng)基上的非轉(zhuǎn)基因玉米利用植酸能力低；6.2液體培養(yǎng)基(無瓊脂等固化物)上測定轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)植酸利用能力將植物再生培養(yǎng)基中的無機(jī)磷替換為等量的植酸磷，配制4倍的染色劑母液，即0.12％FeCl3.6H2O和1.2％磺基水楊酸，植物在35毫升液體培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間(長于3天)后，加入5毫升上述染色劑母液，并輕柔混勻，靜置后觀察顏色變化，結(jié)果見圖9。
圖9a-b加入到液體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色無明顯變化，說明生長于該培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因玉米利用植酸能力高；圖9c染色劑；圖9d未加入染色劑的含植酸磷液體培養(yǎng)基；圖9e-f加入到液體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色變?yōu)闇\紅色，說明生長于該培養(yǎng)基上的非轉(zhuǎn)基因玉米利用植酸能力低。
通過分子檢測和植酸利用能力檢測，獲得根部表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因玉米15個(gè)株系。
7、轉(zhuǎn)基因玉米根部組織中酶活性的測定(選部分轉(zhuǎn)基因玉米株系進(jìn)行測定)7.1植酸酶活性定義一個(gè)單位(U)的植酸酶為在pH5.5，37℃的條件下，每分鐘從底物植酸鉀、鎂(肌醇六磷酸鉀、鎂)釋放出1μmol無機(jī)磷酸所需要的酶量。
7.2試劑提取緩沖液(Extraction buffer)0.4M pH5.5的NaAc緩沖液；50mM植酸鈉；15％TCA。
顯色液(O.6M H2SO4-2％Vc-0.5％鉬酸銨)。
7.3測定方法參考Wyss M.et.al.(1999)，將酶液與50mM的植酸二鉀混合于37℃孵育60分鐘，其中植酸二鉀溶于0.2M pH5.5的NaAc緩沖液中。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配制9mM KH2PO4貯液，用不同稀釋度的KH2PO4溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.4將轉(zhuǎn)基因玉米的種子用Spex 2000 Geno/Grinder粉碎成超細(xì)微粒，100mg粉末中加入1ml提取緩沖液，室溫振蕩1小時(shí)后離心，取上清為酶液。
種子中酶活性檢測以內(nèi)源植酸酶活性較高的小麥作為陽性對(duì)照，野生型玉米作為陰性對(duì)照進(jìn)行酶活測定，檢測結(jié)果見表1。
表1 轉(zhuǎn)基因玉米種子酶活性檢測結(jié)果

注C36、C43、C47、C83、C84、C76、為本發(fā)明轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的6個(gè)株系。
表1顯示的是6個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系的種子植酸酶活性，最高的株系C47可以達(dá)到5732.5U/Kg種子，最低的株系為539.1U/Kg種子。
7.5根據(jù)種子酶活性檢測的結(jié)果，選擇酶活性高的C47和C83兩個(gè)株系，用Hoagland’水培體系液體培養(yǎng)玉米，水培兩周后，將單株植株移入盛有300ml蒸餾水的培養(yǎng)瓶中收集根分泌物48小時(shí)，將收集的玉米根系分泌物使用Satoris公司的vivaspin超濾離心管濃縮40倍后，取20μl收集物濃縮液進(jìn)行植酸酶活性測定。
根分泌物的測定結(jié)果進(jìn)行水培并測定根分泌物的酶活性，結(jié)果見圖10，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米根部酶活性大約是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?4-44倍。
1、構(gòu)建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的中間載體(同實(shí)施例1)。
2、構(gòu)建油菜轉(zhuǎn)化用植物重組表達(dá)載體2.1植酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建用HindIII和EcoR I酶切pBI525’(pBI525載體構(gòu)建過程見Pang，S.-Z.，Nagpala，P.，Wang，M.，Slightom，J.L.& Gonsalves，D.(1992)Phytopathology，82，1223-1229.，本發(fā)明用NcoI酶切質(zhì)粒pBI525后，用Mungbean修飾酶處理削去位點(diǎn)后自連接，酶切連接等方法按常規(guī)方法進(jìn)行，自連后的質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)NcoI位點(diǎn)已破壞，命名為pBI525’)和pBINPLUS(FredA.Van Engelenet al.，Transgenic Research 4，288-290)，將含表達(dá)盒元件雙35S啟動(dòng)子、Ω增強(qiáng)子和NOS終止子的約900bp的片段連入pBINPLUS，將所得到的載體先用BamHI酶切后補(bǔ)平，再用XbaI酶切該載體。用XbaI，MluI酶切實(shí)施例1中所制備的連有融合信號(hào)肽和植酸酶基因的中間載體，將得到的片段與上述酶切后的載體連接即得到由CaMV35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)控制的植酸酶基因雙子葉植物表達(dá)載體pBINPLUSEAO，該表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果見圖11。
2.2油菜用選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體構(gòu)建XbaI和EcoR V酶切pGEM5ZfBar，BamHI酶切pBI525’(同前)后補(bǔ)平，再用XbaI酶切，分別回收目的片段，連接，再用HindIII，EcoR I酶切該中間載體得到帶有標(biāo)記基因的表達(dá)盒，用HindIII，EcoR I酶切雙元載體pBINPLUS，將表達(dá)盒插入pBINPLUS上CaMV35S啟動(dòng)子后即得到pBINPLUSBar，該選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果見圖12。
3、轉(zhuǎn)化油菜選擇飽滿完好的油菜種子，用75％的酒精浸泡3-5分鐘，然后用1％的DICA消毒8-15min，再用無菌水沖洗3遍，均勻植入固體1/2MS培養(yǎng)基，25℃，光照16小時(shí)/天，培養(yǎng)3-5天。
切下具柄子葉(莖節(jié)上約1mm)，作為外植體用于被農(nóng)桿菌侵染。
侵染所用農(nóng)桿菌的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化前2-3天劃平板(YEB培養(yǎng)基)活化農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化當(dāng)天用1/2MS液體培養(yǎng)基從平板上洗下菌體并使菌體重懸，轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌濃度OD為0.08左右。
外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)5-10min，取出外植體用無菌吸水紙吸干，均勻植入預(yù)培養(yǎng)基(MS+BA0.2mg/L+2，4-D1mg/L)上暗培養(yǎng)。
2-3天后將外植體轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基MS+BA4.5mg/L+Ag5mg/L+Cb500mg/L+PPT5-7mg/L，25℃，光照16h/d，培養(yǎng)。
3周后將外植體轉(zhuǎn)入選擇壓增大的選擇培養(yǎng)基MS+BA4.5mg/L+Ag5mg/L+Cb500mg/L+PPT7-10mg/L，25℃，光照16h/d，培養(yǎng)。
從分化的外植體上切下芽植入芽增生培養(yǎng)基，MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+Ag5mg/L+Cb250mg/L+PPT5-10mg/L，25℃，光照16h/d，培養(yǎng)。
切下有生長點(diǎn)的芽植入生根培養(yǎng)基，MS+NAA0.2mg/L+Cb250mg/L+PPT5-10mg/L25℃，光照16h/d，培養(yǎng)。
植酸酶表達(dá)盒PCR陽性的油菜植物轉(zhuǎn)到土壤中，于溫室內(nèi)生長。
4、轉(zhuǎn)基因油菜的分子檢測4.1 PCR檢測PCR檢測方法同玉米檢測，圖13顯示的是轉(zhuǎn)基因油菜T1代植株P(guān)CR檢測的結(jié)果。
4.2 Southern-blot檢測雜交方法同實(shí)施例1。圖14顯示的是油菜T2代植株Southern-blot檢測的結(jié)果，油菜基因組DNA經(jīng)BamHI酶切后，探針為植酸酶基因的500bp片段，轉(zhuǎn)基因油菜雜交后在9Kb處有條帶顯示。陰性對(duì)照無雜交信號(hào)。雜交結(jié)果說明植酸酶基因已整合到油菜植株中。
5、轉(zhuǎn)基因油菜植株的植酸利用能力測定方法同實(shí)施例1，結(jié)果見圖15和圖16。圖15a加入到固體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色無明顯變化，說明生長于該培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因油菜利用植酸能力高；圖15b加入到固體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色變?yōu)闇\紅色，說明生長于該培養(yǎng)基上的非轉(zhuǎn)基因油菜利用植酸能力低；圖16a-b加入到液體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色無明顯變化，說明生長于該培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因油菜利用植酸能力高；。圖15c加入到液體培養(yǎng)基中的染色劑的顏色變?yōu)闇\紅色，說明生長于該培養(yǎng)基上的非轉(zhuǎn)基因油菜利用植酸能力低。
通過分子檢測和植酸利用能力檢測，獲得表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因油菜25個(gè)株系。
6、轉(zhuǎn)基因油菜的植酸酶活性的測定6.1油菜種子的植酸酶活性的測定轉(zhuǎn)基因油菜種子粉末100mg經(jīng)500μl乙醚和石油醚(1∶1)去脂后，測定方法同實(shí)施例1，測定結(jié)果見表2表2 轉(zhuǎn)基因油菜種子酶活性檢測結(jié)果

注04p1602、04p5506、04p1606、04p4906本發(fā)明轉(zhuǎn)植酸酶基因油菜種子。
6.2根部組織植酸酶活性的測定測定方法及試劑同實(shí)施例1，選擇種子酶活性較低的株系04p1602和最高的株系04p4906。測定結(jié)果見圖17，從圖17可見，轉(zhuǎn)基因油菜根部的植酸酶活性大約是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?2-45倍。
序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所<120>一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法<130>008<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1452<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>1atgggaagaa ttgctagagg ctcaaaaatg agttctctca ttgtgtcttt gcttgtagta60ttggtgtcac tcaatttggc ttccgaaacc acagcttacg taatgctggc agtccccgcc 120tcgagaaatc agtccacttg cgatacggtc gatcaggggt atcaatgctt ctcggagact 180tcgcatcttt ggggccaata cgcgccgttc ttttctctgg caaacaaatc ggccatctcc 240cctgatgttc ccgccggatg ccaagtcact ttcgctcagg ttctctcccg ccatggagcg 300cggtatccga ccgactccaa gggcaagaaa tactccgctc tcatcgagga gatccagcag 360aacgcgacta ccttcaagga gaaatatgcc ttcctgaaga catacaacta cagcctgggc 420gcggatgacc tgactccctt tggagagcag gagctggtca actccggcgt caagttctac 480cagcgatacg agtcgctcac aagaaacatt gtcccgttca tccgatcctc aggctccagc 540cgcgtgattg cctctggcaa taaattcatc gagggctacc agagcactaa gctgaaggat 600cctcgtgctc agcccggcca atcgtcgccc aagatcgacg tggtcatttc agaggccagc 660acatccaaca acactctcga tccgggcacc tgcaccgttt tcgaagatag cgaattggcc 720gatgacatcg aagccaattt caccgccacg ttcgtccctt ccattcgtca acgtctggag 780aacgacttgt ctggcgtgac tctcacggac acagaagtga cctacctcat ggacatgtgc 840tccttcgaca ccatctccac cagcaccgtc gacaccaagc tgtccccctt ctgtgacctg 900ttcacccatg aagaatggat caactacgac tacctccagt ccctgaacaa atactacggc 960catggcgcag gtaacccgct cggcccgacc cagggcgtcg gctacgctaa cgagctcatc 1020gcccgtctca cccactcgcc tgtccacgat gacaccagct ccaaccacac attggactcc 1080aacccggcta ctttcccgct caactccact ctctatgcgg acttttcgca tgataacggc 1140atcatctcta tcctctttgc tttgggtctg tacaacggca ccaagccgct gtcctccacg 1200accgcggaga atatcaccca gaccgatggg ttctcatctg cctggacggt tcctttcgcg 1260tcgcgcatgt acgtcgagat gatgcaatgc cagtctgagc aggagccttt ggtccgtgtc 1320ttggttaatg atcgcgttgt tccgctgcat ggctgtccgg ttgatgcttt ggggagatgt 1380acgcgggata gcttcgtgaa gggtttgagc tttgccagat ctggcggtga ttgggcggag 1440tgttttgctt ag 1452<210>2<211>75<212>DNA
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<400>2tccccgcggt ctagacccgg gatatcatgg gaagaattgc tagaggctca aaaatgagtt60ctctcattgt gttct 75<210>3<211>73<212>DNA<213>Artificial<220>
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<400>6aattgctaga ggctcaaaaa tga23<210>7<211>22<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>7ctaagcaaaa cactccgccc aa 2權(quán)利要求
1.一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤植酸磷利用能力的方法，包括以下步驟將SEQID NO.1所示的融合有植酸酶基因和信號(hào)肽基因的核苷酸序列可操作的連接到啟動(dòng)子之后，構(gòu)建單子葉或雙子葉植物重組表達(dá)載體；將該植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物即可。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征是所述的啟動(dòng)子為Ubi啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征是所述的植物重組表達(dá)載體是單子葉植物表達(dá)載體pGA1161EAO或雙子葉植物表達(dá)載體pBINPLUSEAO。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其特征是植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物的方法為農(nóng)桿菌侵染法或基因槍法。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其特征是所述的受體農(nóng)作物為玉米或油菜。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其特征是還包括構(gòu)建植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體，將所構(gòu)建的植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體和植物重組表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物，選育得到表達(dá)植酸酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其特征是所述的植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體為用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar或用于雙葉植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pBINPLUSBar。
8.按照權(quán)利要求6的方法，其特征是將選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar和單子葉植物表達(dá)載體pGA1161EAO用基因槍法共同轉(zhuǎn)化玉米或?qū)⑦x擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pBINPLUSBar和雙子葉植物表達(dá)載體pBINPLUSEAO用農(nóng)桿菌侵染法共同轉(zhuǎn)化油菜。
9.一種檢測權(quán)利要求1中的轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物利用植酸磷能力的方法，包括以下步驟將固體或液體MS培養(yǎng)基中的無機(jī)磷全部替換為等量的植酸磷；將轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的后代種子表面消毒、萌發(fā)后置于上述MS固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間；向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的固體或液體MS培養(yǎng)基中加入由FeCl3.6H2O和磺基水楊酸組成的染色劑；如染色劑顏色無明顯變化，表明轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物利用植酸磷能力高，如果染色劑顏色變?yōu)闇\紅色至無色，表明轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物利用植酸磷能力低。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其特征是向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的固體MS培養(yǎng)基中加入的染色劑由以下重量百分比的組分組成FeCl3.6H2O0.03％、磺基水楊酸0.3％、余者為水；向生長有轉(zhuǎn)植酸酶基因農(nóng)作物的液體MS培養(yǎng)基中加入為液體培養(yǎng)基1/7體積的染色劑，其中該染色劑由以下重量百分比的組分組成FeCl3.6H2O 0.12％、磺基水楊酸1.2％、余者為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高農(nóng)作物對(duì)土壤閉蓄態(tài)磷素尤其是植酸磷的利用能力的方法，該方法包括將SEQ ID NO.1所示的融合有植酸酶基因和信號(hào)肽基因的核苷酸序列可操作的連接到啟動(dòng)子之后，構(gòu)建植物重組表達(dá)載體；將該植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物。為了安全的需要，本發(fā)明方法還包括構(gòu)建植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體并將其與植物重組表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物，選育得到表達(dá)植酸酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將植酸酶基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，在作物根部高效表達(dá)植酸酶，在其整個(gè)生長過程中持續(xù)表達(dá)植酸酶，并向根外分泌，降解土壤中大量存在的植酸磷，將其分解為作物可以吸收利用的無機(jī)磷源，從而滿足作物對(duì)磷的需求。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1766116SQ20051010554
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者陳茹梅, 范云六, 薛光行, 方小平 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所