專利名稱：海洋碳樣小單孢菌產(chǎn)生的異黃酮類化合物—染料木素和大豆黃素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于異黃酮類化合物的制備。

背景技術(shù)：
小單孢菌Micromonospora sp.FIM 02-635分離自福建福鼎海灘土壤。顯微形態(tài)觀察基內(nèi)菌絲細(xì)長(zhǎng)有分隔、菌絲多分支，直徑φ0.3μm。單個(gè)孢子著生于孢子梗上。孢子圓形到卵圓形，φ0.6～0.7×0.6～0.9μm，孢子外壁瘤狀突起(

圖1)。該菌株無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲的顏色在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基上為粉白—鹿皮褐(IIa45’)，無(wú)可溶性色素。在有機(jī)培養(yǎng)基上為鹿皮褐(II a45’)—落葉棕(II c67’)，孢子堆顏色灰黑—黑，可溶性色素為黃棕—山雞褐(I d67’)。能利用核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、蜜二糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、鼠李糖、海藻糖、綿子糖、松三糖、淀粉、山梨醇和水楊苷等，不利用阿拉伯糖、山梨糖、赤蘚醇、肌醇、菊糖和衛(wèi)茅醇。液化明膠、凝固胨化牛奶、還原硝酸鹽，在ISP 6培養(yǎng)基上不產(chǎn)生硫化氫，在ISP 7培養(yǎng)基上不產(chǎn)生黑色素。
細(xì)胞壁化學(xué)成分II型，含meso-DAP和甘氨酸，糖類型D型，含木糖、阿拉伯糖。甲基萘醌主要是MK10(H2)，還有少量MK9(H4)和MK9(H6)，DNA G+Cmol％值為69.4％，說(shuō)明該菌株屬于小單孢菌。菌株FIM 02-635的16S rDNA序列(序列號(hào)為GenBankAY697299)與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院全國(guó)生物技術(shù)研究中心(NCBI)的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中相關(guān)菌株的同源性比較結(jié)果表明，它與已知種碳樣小單孢菌(Micromonospora carbonacea)的16S rDNA序列同源性高達(dá)98.6％。根據(jù)上述結(jié)果菌株FIM 02-635定名為碳樣小單孢菌Micromonosporacarbonacea sp.FIM 02-635。


發(fā)明內(nèi)容
1.Micromonospora sp.FIM 02-635的培養(yǎng)發(fā)酵 一鉑環(huán)的Micromonospora sp.FIM02-635高氏天冬素斜面培養(yǎng)物接入液體種子培養(yǎng)基(可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，(NH4)2SO4 0.05％，K2HPO4.3H2O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4.7H2O 0.05％，CaCO30.1％，自來(lái)水配制，pH 7.5)，32℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，以10％接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基(可溶性淀粉4％，葡萄糖0.5％，黃豆餅粉2.5％，酵母粉0.5％，MgSO4.7H2O0.05％，K2HPO4.3H2O 0.05％，CaCO3 0.1％，自來(lái)水配制，pH 7.5)，32℃，240rpm振蕩培養(yǎng)96～120小時(shí)生物活性達(dá)高峰放瓶，收獲菌絲體。
2.Micromonospora sp.FIM 02-635代謝產(chǎn)物的分離純化 Micromonospora sp.FIM 02-635菌株發(fā)酵液離心獲得菌絲體，菌絲體用二倍體積乙醇浸泡兩次，乙醇浸泡液減壓濃縮。乙醇濃縮液用乙酸乙酯提取兩次，減壓濃縮至漿狀物。漿狀物用硅膠柱分離，石油醚丙酮梯度洗脫，HPLC檢測(cè)(Shimadzu LC-10AT vp高效液相儀。SPD-10AVvp檢測(cè)器ODS C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)。流動(dòng)相40％甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，柱溫50℃，流速1.0ml/min)，合并有效組分減壓濃縮得FW635粗品。FW635粗品經(jīng)高速逆流萃取(HSCCC，TBE-300高速逆流色譜儀(深圳同田生化技術(shù)有限公司)。分離體系為氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2)，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相洗脫流速2ml/min，螺旋柱轉(zhuǎn)速800rpm)，HPLC檢測(cè)得高壓液相純度99％的樣品FW635I1和FW635I2。
3.FW635I1和FW635I2的結(jié)構(gòu)解析 FW635I1質(zhì)譜(EI-MS)中分子離子峰為255，碎片峰有243和153，理化性質(zhì)見(jiàn)表1，其紅外光譜在1631，1596，1517，1461cm-1處的吸收表明有芳環(huán)結(jié)構(gòu)，3234cm-1處的存在表示有羥基，1384，1307，1272，1240，1194則是酚的吸收。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。13C DEPT(無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增益法)圖譜顯示有5個(gè)碳與一個(gè)氫原子相聯(lián)，化學(xué)位移值(ppm)分別為103.6(C8)，116.4(C6)，116.7(C3’，5’)，128.8(C5)，131.6(C2’，6’)和153.0(C2)，進(jìn)一步證明FW635I1中各碳原子的歸屬。紫外、紅外光譜、質(zhì)譜及核磁共振1H-NMR譜和13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致，確定FW635I1與大豆黃素(daidzein，4′，7-二羥基異黃酮)同質(zhì)。
FW635I2質(zhì)譜(EI-MS)中分子離子峰為271，典型碎片峰為243和153，其紅外光譜在1623，1578，1517和1464cm-1處的吸收表明有芳環(huán)結(jié)構(gòu)，而1656cm-1處的吸收則暗示有與苯環(huán)共軛的羰基存在。3200cm-1處的存在表示有羥基，1375，1330，1286，12521194，1178是酚的吸收。FW635I2理化性質(zhì)見(jiàn)表1，1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。13C DEPT圖譜顯示有5個(gè)碳與一個(gè)氫原子相聯(lián)，化學(xué)位移值(ppm)分別為95.1(C8)，100.6(C6)，116.8(C3’，5’)，131.6(C2’，6’)和153.9(C2)，進(jìn)一步證明FW635I2中各碳原子的歸屬。其13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道(8)的染料木素(genistein 4′，5，7-三羥基異黃酮)的基本一致，結(jié)合紫外、紅外及質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以斷定FW635I2與染料木素同質(zhì)。兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)式1。
表1.FW635I1和FW635I2的理化性質(zhì) 表2.FW635I1和FW635I2的1H和13C-NMR的化學(xué)位移δ(ppm)
式1.FW635I1和FW635I2的化學(xué)結(jié)構(gòu) 4.異黃酮類化合物FW635I1和FW635I2的體外生物學(xué)活性 5.1 FW635I1和FW635I2對(duì)刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用 采用MTT比色分析法測(cè)定，0.1μM的FW635I1和FW635I2即對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有明顯的抑制作用，IC50均約為1μM。
5.2 FW635I1和FW635I2對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2產(chǎn)生的抑制作用 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法(進(jìn)口分裝試劑盒)測(cè)定FW635I1和FW635I2對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2產(chǎn)生作用，結(jié)果顯示0.2-50μMFW635I1和FW635I2均有抑制作用，IC50均約為3μM。
5.3 FW635-I1和FW635-I2對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 FW635I1和FW635I2對(duì)K562腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，IC50分別為110、140μM。
5.4 FW635I2對(duì)K562腫瘤細(xì)胞周期的影響 K562腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液加入FW635I2至終濃度25，50，100μM，培養(yǎng)兩天，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。藥物處理組未見(jiàn)明顯的凋亡峰，但是細(xì)胞阻滯在G2/M期，S期細(xì)胞比率下降(表4)。G2/M期的阻滯將使細(xì)胞進(jìn)入M期減少，從而抑制細(xì)胞的增殖。
5.5 FW635-I1和FW635-I2的抗菌活性 含6μg/ml FW635-I1或FW635-I2的紙片均不抗細(xì)菌和真菌。
表4.FW635 I2對(duì)K562腫瘤細(xì)胞周期的影響 大豆異黃酮原發(fā)現(xiàn)在大豆和其他植物中，有抗腫瘤活性、抗氧化作用和類雌激素作用等，在治療某些疾病和保健方面有很好的作用。它們?cè)谥参镏写蠖嘁驭?葡萄糖苷形式存在，其中有生物活性的苷元形式的異黃酮染料木素和大豆黃素含量低(9)。染料木素和大豆黃素具有廣泛的生理功能如抗炎作用和抗腫瘤作用等(10，11)。近年相繼報(bào)道若干微生物如鏈霉菌、嗜鹽小單孢菌、假單孢桿菌和霉菌(18)等也能產(chǎn)生染料木素和大豆黃素。我們從海洋小單孢菌Micromonosporacarbonacea sp.FIM 02-635中獲得這類次級(jí)代謝產(chǎn)物尚屬首次報(bào)道。已報(bào)道染料木素確實(shí)具有免疫抑制活性，其能否作為免疫抑制劑得到應(yīng)用有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)蚯蚓蚓激酶或其衍生物的方法。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說(shuō)的植物至少有一部分是可以食用的。
3.一種引起人或哺乳動(dòng)物心腦和四肢血管血栓形成受到抑制或血栓溶解的方法，該方法包括使用有效和確定劑量的、來(lái)源于能產(chǎn)生該蚓激酶重組蛋白或其衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的植物材料或其加工提取物對(duì)人或哺乳動(dòng)物進(jìn)行口服或腸道給藥。
4.如權(quán)利要求3中的方法，其中所說(shuō)的植物至少有一部分是可以食用的。
5.一種食物至少是由轉(zhuǎn)基因植物的某一部分所組成，它被食用是因?yàn)樗哂幸欢ǖ臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中所說(shuō)的植物是一種能夠表達(dá)蚓激酶或其衍生物的植物，該蛋白在天然狀態(tài)下具有溶解纖維蛋白或纖溶酶原激活劑的作用。
6.如權(quán)利要求5中的任何食物，其中所說(shuō)的植物食用部分包括果實(shí)、葉子、莖、根或所說(shuō)的植物種子。
7.一個(gè)用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體包括
一段編碼蚯蚓蚓激酶或其衍生物的DNA序列(包括基因密碼子被優(yōu)化或與其它基因的融合等)，該序列編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有溶解纖維蛋白或纖溶酶原激活劑的作用。
一個(gè)與所說(shuō)的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說(shuō)的基因在所說(shuō)的植物中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7中的質(zhì)粒載體，它含有一個(gè)選擇性或標(biāo)記基因，而其中所說(shuō)的植物至少有一部分是可食用性的。
9.一段用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物的DNA序列包括
一段編碼蚯蚓蚓激酶或其衍生物的DNA序列(包括基因密碼子被優(yōu)化或與其它基因的融合等)，該序列編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有溶解纖維蛋白或纖溶酶原激活劑的作用。
一個(gè)與所說(shuō)的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說(shuō)的基因在所說(shuō)的植物中表達(dá)。
10.如權(quán)利要求9中的DNA序列，它含有一個(gè)選擇性或標(biāo)記基因，而其中所說(shuō)的植物至少有一部分是可食性的。
11.一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法包括
構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有一段編碼蚯蚓蚓激酶或其衍生物的基因(包括基因密碼子被優(yōu)化或與其它基因的融合等)，該基因編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有溶解纖維蛋白或纖溶酶原激活劑的作用。
一個(gè)與所說(shuō)的DNA序列連接的植物啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操縱所說(shuō)的基因在所說(shuō)的植物中表達(dá)。
用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11中的方法，它包括從所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
13.生產(chǎn)一種膠囊、沖劑或其它制劑的方法包括
構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有一段編碼蚯蚓蚓激酶或其衍生物的基因(包括基因密碼子被優(yōu)化或與其它基因的融合等)和可操縱該基因在所說(shuō)的植物中表達(dá)的植物啟動(dòng)子，該基因編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有溶解纖維蛋白或纖溶酶原激活劑的作用。
用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)基因植物食用部分冷凍、干燥和磨碎后制作成膠囊、沖劑或其它制劑。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中還包括在利用轉(zhuǎn)基因植物作為食物以及加工成膠囊、沖劑或其它制劑之前，應(yīng)從所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
15.如權(quán)利要求13中的方法，其中還包括從所說(shuō)的植物細(xì)胞中部分純化或完全純化出所說(shuō)的蚯蚓蚓激酶重組蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的活性組成部分。
16.如權(quán)利要求13中的方法，其中所說(shuō)的植物細(xì)胞是通過(guò)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的。
17.如權(quán)利要求13中的方法，其中所說(shuō)的植物是番茄、馬鈴薯、丹參、苜蓿、萵苣、胡蘿卜、黃瓜、小麥和水稻或其它可食用的雙子葉或者單子葉植物。
18.如權(quán)利要求13中的方法，其中所說(shuō)的植物細(xì)胞是通過(guò)除農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以外的其它轉(zhuǎn)化方法如基因槍法、微管注射法、PEG吸收法以及電融合法等方法轉(zhuǎn)化的。
全文摘要
海洋碳樣小單孢菌產(chǎn)生的異黃酮類化合物—染料木素和大豆黃素屬于異黃酮類化合物的制備。該化合物經(jīng)由Micromonospora sp.FIM 02－635的培養(yǎng)發(fā)酵以及Micromonospora sp.FIM 02－635代謝產(chǎn)物的分離純化步驟制備。從海洋小單孢菌Micromonospora carbonacea sp.FIM 02－635中獲得這類次級(jí)代謝產(chǎn)物尚屬首次報(bào)道。已報(bào)道染料木素確實(shí)具有免疫抑制活性，其能否作為免疫抑制劑得到應(yīng)用有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12R1/29GK1940081SQ20051010577
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者江紅, 林如, 謝陽(yáng), 聶毅磊, 鄭衛(wèi), 程元榮 申請(qǐng)人:福建省微生物研究所