專利名稱：制備高純度白蛋白溶液的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及純化從血清或血漿提取的人血清白蛋白(HSA)，或用編碼人血清白蛋白氨基酸序列的核苷酸序列轉化或轉染生物而生產的重組人白蛋白(rHA)，包括使用轉基因動物或植物而生產的rHA的方法。在本說明書中，術語“白蛋白”一般指HSA和/或rHA。
背景技術：
白蛋白用于處理嚴重燒傷，休克或失血的患者。它也用作培養(yǎng)高等真核細胞的培養(yǎng)基添加劑和藥理學活性化合物的賦形劑，其中許多有待穩(wěn)定。目前，通過從人血液中提取白蛋白來滿足對此產品的需要。提取和分離技術的實施例包括公開于JP 03/258728中關于陽離子交換劑的使用；EP428758中關于陰離子交換的使用；和EP 452 753中加熱，加鹽和滲濾的使用。
已經(jīng)在EP 330 451和EP 361 991中公開了微生物中rHA的生產。針對rHA的純化技術已經(jīng)公開于WO92/04367，去除介質源性染料；EP 464 590，去除酵母源性色料；EP 319 067，rHA的堿沉淀反應和隨后在親脂相的應用；和包含幾個徹底純化方法的WO 96/37515。
本發(fā)明代表對WO 96/37515和US 5 728 553(在此引入作為參考)中所述方法進一步開發(fā)的結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一方面提供純化白蛋白溶液的方法，此方法包括將pH8.0-9.5，電導率在1-75mS.cm-1范圍內的起始白蛋白溶液進行就白蛋白而論為被動方式的親和層析步驟并且層析利用含固相化二羥基硼基的親和介質，由此獲得純化的白蛋白溶液。
優(yōu)選所述起始白蛋白溶液的pH值為pH8.0-9.0，更優(yōu)選pH8.3-8.6。優(yōu)選將所述起始白蛋白用溶液上述pH范圍內的緩沖液緩沖。
優(yōu)選所述緩沖液包括濃度10-500mM的氨基酸，優(yōu)選濃度為25-200mM，更優(yōu)選50-150mM。優(yōu)選所述氨基酸是甘氨酸。
優(yōu)選所述緩沖液包括濃度為0-500mM的一價陽離子，優(yōu)選濃度為25-200mM，更優(yōu)選50-150mM。優(yōu)選所述一價陽離子是鈉，優(yōu)選為NaCl的形式。相應地，在優(yōu)選實施方案中緩沖液包括濃度為0-500mM的NaCl，優(yōu)選濃度為25-200mM，更優(yōu)選50-150mM。
優(yōu)選所述緩沖液包括濃度為5-250mM，優(yōu)選10-100mM的二價陽離子。優(yōu)選所述二價陽離子是鈣，優(yōu)選為CaCl2的形式。相應地，在優(yōu)選實施方案中緩沖液包括濃度為5-250mM，優(yōu)選10-100mM的CaCl2。
在一個具體優(yōu)選實施方案中所述起始白蛋白溶液和/或緩沖液包括約100mM甘氨酸，約100mM NaCl和約50mM CaCl2。
優(yōu)選所述起始白蛋白溶液和/或緩沖液的電導率為10-50mS.cm-1，更優(yōu)選18-22mS.cm-1。
在所述起始白蛋白溶液中白蛋白的濃度在20-120g.L-1范圍內較有利，優(yōu)選70-120g.L-1，更優(yōu)選100±10g.L-1。優(yōu)選將所述白蛋白上樣至小于0.5倍柱體積，更優(yōu)選小于0.35倍柱體積。
優(yōu)選所述介質包括硼酸(boronic acid)。術語“酸”在本文包括它們的鹽。使所述硼酸經(jīng)三嗪或取代的三嗪結合至支持物如瓊脂糖等，形成如單硼三嗪或二硼三嗪。優(yōu)選所述硼酸為氨基苯硼酸。
關于苯硼酸替代物，如脂肪酸族配基和取代型芳香族配基的文獻包括Adamek，V.等(1992)J.Chrom.625，91-99，Singhal，R.P.等(1991)J.chrom543，17-38和liu，X.等(1994)687，61-69。
在親和層析步驟后優(yōu)選對純化的白蛋白溶液進行進一步純化，優(yōu)選進一步層析純化。優(yōu)選將白蛋白進一步用陽離子交換層析和/或陰離子交換層析純化。只要仍是進行純化目的可以將陽離子和陰離子交換步驟的順序互換，從操縱的角度看，優(yōu)選先進行陽離子交換層析隨后進行陰離子交換層析。
按照本發(fā)明第一方面的方法生產的純化白蛋白溶液優(yōu)選進行下列一種或多種處理緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)(優(yōu)選pH高于pH2.0或pH4.0，且優(yōu)選pH低于pH10.0)；用還原劑處理(例如在EP 570 916中描述的)；脫色處理(例如用炭)；加熱(包括滅菌)；冷卻或調節(jié)狀態(tài)；制成人類非腸道給藥的制劑；或放于最后的容器中。
經(jīng)腸道外給藥包括靜脈給藥，皮下給藥和肌肉內給藥。所述白蛋白可以作為能經(jīng)腸道給藥的藥理活性蛋白質的賦形劑。
“最后容器”是指離開制造商并被分送到諸如醫(yī)院和藥店等用戶處的容器。
本發(fā)明的第二方面提供純化白蛋白溶液的方法，此方法包括陽離子交換層析和陰離子交換層析，其中所純化的白蛋白溶液可任選進行一種或多種以下處理緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)(優(yōu)選至pH高于pH2.0或pH4.0，且優(yōu)選至pH低于pH10.0)；加還原劑；脫色處理(例如用炭)；加熱(包括滅菌)；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)，但是在放入最后的容器之前不進行進一步純化，特別是不進行進一步層析純化。
陽離子交換層析步驟可以在陰離子交換層析步驟之后進行，或反過來。優(yōu)選陽離子交換層析步驟之后進行陰離子交換層析步驟。
優(yōu)選在陽離子和陰離子交換步驟之間，盡管可以對白蛋白進行如上所述的緩沖液交換等，但沒有進一步純化步驟。
通過調節(jié)狀態(tài)，我們的意思是指為方法中下一步驟或最后應用而改善白蛋白環(huán)境或狀態(tài)的任何非純化處理步驟。調節(jié)狀態(tài)可包括加入白蛋白穩(wěn)定劑如辛酸酯和/或其它脂肪酸，如C6或C10脂肪酸，或乙酰色氨酸鈉或扁桃酸鹽。調節(jié)狀態(tài)也可以包括添加鹽等，并且可涉及對白蛋白溶液電導率的調節(jié)。
本發(fā)明的第一和第二方面中陽離子交換步驟可以以針對白蛋白被動或主動的方式進行。在優(yōu)選實施方案中陽離子交換步驟就白蛋白而言是被動方式進行的。優(yōu)選所選條件可以使糖基化白蛋白對陽離子交換物質的結合強于非糖基化白蛋白。
本發(fā)明的第一和第二方面中陽離子交換層析步驟可以使用商業(yè)性的陽離子交換介質例如SP-SepharoseFF，SP-Spherosil，CM-SepharoseFF，CM-纖維素，SE-纖維素或S-Spheradex。優(yōu)選陽離子交換步驟利用含固相化磺基丙基取代基作為陽離子交換劑的介質。
優(yōu)選進行陽離子交換層析的白蛋白溶液pH值為4.5-6.0，更優(yōu)選pH5.0-5.6，還更優(yōu)選pH5.2-5.4。
優(yōu)選進行陽離子交換層析的白蛋白溶液所含白蛋白濃度為10-250g.L-1，優(yōu)選20-70g.L-1，還更優(yōu)選50±10g.L-1。
優(yōu)選進行陽離子交換層析的白蛋白溶液所含辛酸根濃度為2-15mM，優(yōu)選5-10mM，更優(yōu)選6-9mM。
方便地，在陽離子交換步驟前，對白蛋白溶液進行一種或多種下列處理(i)pH調節(jié)(優(yōu)選至pH高于pH2.0或pH4.0，且優(yōu)選pH低于pH10.0)；(ii)濃縮；(iii)滲濾；或(iv)通過加入穩(wěn)定劑如辛酸鹽和/或其它脂肪酸，如C6或C10脂肪酸，或乙酰色氨酸鈉或扁桃酸鹽來調節(jié)狀態(tài)。或者，額外對白蛋白溶液進行一種或多種以下處理緩沖液交換；稀釋；透析；滲濾；用還原劑處理；脫色處理(例如用炭)；加熱；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)。
總體上，任何修改均涉及添加，而非去除。優(yōu)選通過加入乙酸調節(jié)白蛋白溶液的pH值，優(yōu)選通過超濾法將白蛋白溶液濃縮。
本發(fā)明第一和第二方面的陰離子交換層析步驟可以利用商業(yè)性的陰離子交換介質例如QSepharose-FF，QMA-Spherosil，DEAE-Spherodex，Q-HyperD，DEAE-纖維素，QAE-纖維素，或TMAE，DMAE，或DEAE Fractogel。優(yōu)選陰離子交換步驟利用含固相化二烷基氨基烷基(例如二乙基氨基乙基)取代基作為陰離子交換劑的介質。
在一個優(yōu)選實施方案中本發(fā)明第一和第二方面的陰離子交換層析步驟就白蛋白而論以被動方式進行。
優(yōu)選進行被動方式陰離子層析的白蛋白溶液pH值為4.0-5.2，更優(yōu)選pH4.2-4.9，還更優(yōu)選pH4.5-4.7。
優(yōu)選進行陰離子交換層析的白蛋白溶液的電導率低于4.0mS.cm-1，還更優(yōu)選電導率1.0±0.5mS.cm-1，還更優(yōu)選1.05±0.1mS.cm-1。
方便地，在陰離子層析步驟前，對白蛋白溶液進行pH調節(jié)和/或用水稀釋。優(yōu)選用乙酸調節(jié)白蛋白溶液的pH值。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的第一和第二方面的陰離子層析步驟就白蛋白而論以主動方式進行。
優(yōu)選進行主動方式陰離子交換層析的白蛋白溶液pH值為6.0-8.0，優(yōu)選pH6.5-7.5，還更優(yōu)選pH6.8-7.2。優(yōu)選用正磷酸鹽離子進行白蛋白溶液的pH值調節(jié)。
在一個優(yōu)選實施方案中白蛋白濃度為10-100g.L-1，更優(yōu)選25-80g.L-1，且最優(yōu)選30±60g.L-1。優(yōu)選白蛋白溶液的電導率為1.0-2.0mS.cm-1，優(yōu)選1.2-1.6mS.cm-1。
將白蛋白從陰離子交換劑上洗脫時最好用包含20-90mM磷酸鹽，例如磷酸鈉的緩沖液，優(yōu)選30-70mM還更優(yōu)選35-65mM。優(yōu)選用pH6.0-8.0(更優(yōu)選pH6.5-7.5)的緩沖液將白蛋白從陰離子交換劑上洗脫。
尤其優(yōu)選在本發(fā)明的第一和第二方面步驟之前進行一種或多種下列步驟發(fā)酵；初級分離；集中調節(jié)狀態(tài)；陽離子交換層析，優(yōu)選使用磺基丙基取代基作為陽離子交換劑；陰離子交換層析，優(yōu)選使用二乙基氨基烷基取代基作為陰離子交換劑；或親和層析，優(yōu)選使用含固相化白蛋白特異性染料的親和介質，優(yōu)選Cibacron藍型染料。
本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中提供的純化白蛋白的方法包括下列步驟(a)對白蛋白溶液進行就白蛋白而言為主動方式的陽離子交換層析步驟；(b)收集包含白蛋白的陽離子交換洗脫物；(c)對所述陽離子交換洗脫物進行就白蛋白而言為主動方式的陰離子交換層析步驟；(d)收集包含白蛋白的陰離子交換洗脫物；(e)對所述陰離子交換洗脫物進行就白蛋白而言為主動方式的親和層析步驟；(f)收集包含白蛋白的親和層析洗脫物；(g)對所述親和層析洗脫物進行就白蛋白而言為被動方式并且就糖偶聯(lián)物(糖基化白蛋白和/或糖蛋白)而言為主動方式的親和層析步驟；(h)收集包含所述白蛋白的親和層析流出物；(i)對所述親和層析流出物進行就白蛋白而言為被動方式的陽離子交換層析步驟；(j)收集包含所述白蛋白的陽離子交換層析流出物；
(k)對所述陽離子交換流出物進行被動方式或主動方式的陰離子交換層析步驟；(l)收集被動方式陰離子交換步驟后含白蛋白的陰離子交換流出物；或主動方式陰離子交換步驟后從陰離子交換介質上洗脫出的陰離子交換洗脫物；并且上述純化步驟中任一步可任選在其之前或隨后進行一種或多種以下處理緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)(優(yōu)選至pH高于pH2.0或pH4.0，且優(yōu)選pH低于pH10.0)；用還原劑處理；脫色處理(例如用炭)；加熱(包括滅菌)；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)。
相應地，純化步驟可以用或不用下列一種或多種步驟間隔緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)；用還原劑處理；脫色處理；加熱；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)。
當任何步驟以針對白蛋白為被動的方式進行時，除流出物外也要收集洗脫物。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案提供的純化白蛋白的方法包括下列步驟(a)對白蛋白溶液進行就白蛋白而言為主動方式的陽離子交換層析步驟；(b)收集包含白蛋白的陽離子交換洗脫物；(c)對所述陽離子交換洗脫物進行就白蛋白而言為主動方式的陰離子交換層析步驟；(d)收集包含白蛋白的陰離子交換洗脫物；(e)對所述陰離子交換洗脫物進行就白蛋白而言為主動方式的親和層析步驟；(f)收集包含白蛋白的親和層析洗脫物；(g)對所述親和層析洗脫物進行就白蛋白而言為被動方式并且就糖偶聯(lián)物而言為主動方式的親和層析步驟；(h)收集包含所述白蛋白的親和層析流出物；(i)對所述親和介質流出物進行就白蛋白而言為被動或主動方式的陰離子交換層析步驟；
(j)收集被動方式陰離子交換步驟后含所述白蛋白的陰離子交換流出物；或主動方式陰離子交換步驟中從陰離子交換介質上洗脫的陰離子交換洗脫物；(k)對經(jīng)過陰離子交換層析純化的白蛋白溶液進行以白蛋白而論為被動方式的陽離子交換層析步驟；(l)收集包含所述白蛋白的陽離子交換層析流出物；并且上述純化步驟中任一步可任選在其之前或隨后進行一種或多種以下處理緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)(優(yōu)選至pH高于pH2.0或pH4.0，且優(yōu)選pH低于pH10.0)；用還原劑處理；脫色處理(例如用炭)；加熱(包括滅菌)；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)。
相應地，所述純化步驟可以用或不用下列一種或多種步驟間隔緩沖液交換；濃縮；稀釋；透析；滲濾；pH調節(jié)；用還原劑處理；脫色處理；加熱；冷卻；或調節(jié)狀態(tài)。
優(yōu)選在本發(fā)明主動方式陽離子交換步驟之前，將白蛋白溶液如上述調節(jié)狀態(tài)。優(yōu)選向其中加入辛酸鹽至終濃度大約1-10mM且調節(jié)pH值至約4.0-5.0。
有利地，將滯留在陽離子交換步驟中的白蛋白在洗脫前用高鹽溶液(例如已緩沖為pH3.5-4.5的0.5-3.0M NaCl，優(yōu)選約pH4.0，10-100mM，優(yōu)選20-40mM，例如25-30mM乙酸鈉)洗滌。
優(yōu)選將在陽離子交換步驟中的白蛋白用含特異親和白蛋白之化合物的緩沖液洗脫，所述化合物優(yōu)選酸，例如辛酸鹽或其他脂肪酸，如C6或C10。
合適地，用包含高水平(例如至少50mM，優(yōu)選50-200mM，例如80-150mM)硼酸鹽的緩沖液，例如四硼酸鈉或四硼酸鉀，將白蛋白從第一次陰離子交換步驟的陰離子交換劑上洗脫。
優(yōu)選主動方式親和層析步驟使用含固相化白蛋白特異性染料的樹脂，所述染料如Cibacron藍型染料，優(yōu)選其通過間隔臂固定于樹脂上，所述間隔臂如1，4-二氨基丁烷或另一種C1-8間隔臂，優(yōu)選C1-6，例如C1-5且最優(yōu)選C4長度，優(yōu)選具有α，ω-二氨基取代。優(yōu)選所述介質是按WO 96/37515中所述制備的“δ藍介質”(DBA)。
本發(fā)明的第三方面提供減少白蛋白溶液中鎳離子水平的方法，此方法包括將白蛋白溶液調至pH2.5-7.5，優(yōu)選2.5-6.0，并除去鎳離子。優(yōu)選將白蛋白溶液調至pH4.0-7.5，優(yōu)選4.0-6.0，更優(yōu)選pH4.0-5.5，還更優(yōu)選4.0-pH5.0，最優(yōu)選pH4.0-pH4.5。
優(yōu)選本發(fā)明第三方面的方法包括對pH2.5-6.0或具有pH在前述提到的一種pH范圍的緩沖液滲濾?；蛘?，用pH在上述列出的一種pH范圍的緩沖液通過凝膠通透層析可以完成鎳離子的去除。凝膠通透層析可以用Sephacryl S200 HR進行。優(yōu)選緩沖液包括乙酸根和/或蘋果酸根?；蛘?，白蛋白有足夠的緩沖能力可以承受pH調節(jié)并用水進行滲濾/凝膠通透層析。
或者可以從白蛋白中將鎳離子螯合并去除。此方法可以用螯合劑，如低pH條件下，優(yōu)選pH4.0-6.0，更優(yōu)選pH4.0-4.5固定于Sepharose(螯合的Sepharose，Pharmacia)或另一種聚合物(例如Chelex，Bio Rad實驗室)上的亞氨基二乙酸來完成。
優(yōu)選當將本發(fā)明的第三方面方法的產物立即進行被動方式陽離子交換層析時優(yōu)選本發(fā)明第三方面包括將白蛋白溶液調至pH5.0-5.6。相反地，當不將本發(fā)明的第三方面方法的產物立即進行被動方式陰離子交換層析時優(yōu)選本發(fā)明第三方面包括將白蛋白溶液調至pH4.3-4.9。
在本發(fā)明的第一，第二和第三方面的優(yōu)選實施方案中，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼白蛋白的核苷酸序列轉化的真菌，使該真菌表達白蛋白并將其分泌到培養(yǎng)基中，可從獲得的真菌培養(yǎng)基衍生得到起始白蛋白溶液。所述真菌可以是絲狀真菌例如曲霉屬。優(yōu)選所述真菌是酵母。更優(yōu)選真菌是糖酵母屬(例如釀酒酵母)，克魯維酵母屬(例如乳酸克魯維酵母)或畢赤酵母屬(例如巴斯德畢赤酵母)。
優(yōu)選至少某些按照本發(fā)明第一，第二或第三方面純化的白蛋白是用細胞按本發(fā)明第五方面或按照本發(fā)明第六方面的方法生產的。
本發(fā)明的第四方面提供可由本發(fā)明前述任一方面的方法獲得的白蛋白溶液。優(yōu)選白蛋白溶液包括具有下列一種或多種特性的重組白蛋白(1)與伴刀豆球蛋白A結合的少于0.5％(w/w)，優(yōu)選少于0.2％或0.15％；(2)糖基化水平小于0.6摩爾己糖/摩爾蛋白質，且優(yōu)選小于0.10，0.075或0.05摩爾基糖/摩爾蛋白質。
按照本發(fā)明的方法制備的純化的白蛋白溶液可以根據(jù)其預期用途進一步加工。例如，可以將它通過超濾膜超濾以獲得具有白蛋白濃度至少約10g/L的超濾滯留物，優(yōu)選至少40g白蛋白/L或更優(yōu)選約80g白蛋白/L，并使該超濾滯留物對至少5倍于滯留物的水滲濾。
本發(fā)明的第五方面提供包括重組白蛋白編碼序列的DNA序列，質?；蚣毎渲兄亟M白蛋白編碼序列3’端包括兩個或多個框架內翻譯終止密碼子，優(yōu)選三個框架內翻譯終止密碼子。
本發(fā)明第五方面的重組細胞可以是真核細胞或原核細胞。這些重組細胞可以是細菌(例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)，酵母(例如糖酵母屬的酵母(例如釀酒酵母)，克魯維酵母屬的酵母(例如乳酸克魯維酵母)或畢赤酵母屬的酵母(例如巴斯德畢赤酵母))，絲狀真菌(例如曲霉屬)，植物或植物細胞，動物或動物細胞(它可以是轉基因的)或昆蟲細胞。
本發(fā)明的第六方面提供生產重組白蛋白的方法，此方法包括培養(yǎng)表達重組白蛋白編碼序列的真菌細胞并獲得所述白蛋白，其中所述細胞具有基因修飾，其至少使所述細胞對重組白蛋白的甘露糖基化能力降低并且其中培養(yǎng)基至少1,000L且pH值為6.0-6.8。
在本發(fā)明的含義中，基因修飾優(yōu)選意味著真菌細胞DNA序列的一個或多個堿基或片段的任何抑制，取代，缺失或添加。這種基因修飾可以在體外(直接在分離的DNA上)或在原位完成，例如通過基因工程技術或通過將真菌細胞暴露于誘變劑。誘變劑包括例如物理因素諸如能量射線(X射線，γ射線，紫外線等等)或能與DNA不同功能基團反應的化學試劑，例如烷化劑(EMS，NQO等等)雙烷化劑，嵌加劑，等等?；蛐揎椧部梢酝ㄟ^基因的破壞獲得，例如按照Rothstein等公開的方法[酶學方法194(1991)，281-301]。按照此方法，將基因的部分或全部用體外改良型同源重組而置換?；蛐揎椧部梢酝ㄟ^在DNA序列上任何突變性的插入而獲得，例如轉座子，噬菌體等等。
已知某種修飾例如點突變可以通過細胞機制回復或變弱。這樣的修飾不能提供本發(fā)明真菌細胞修飾的最有用形式因為它們的表型特征可能很不穩(wěn)定。相應地，優(yōu)選基因修飾是穩(wěn)定遺傳的和/或非回復的和/或非滲漏的。這樣的修飾一般通過缺失或基因破壞而獲得。
“滲漏突變”和其符合語法規(guī)則的其它表述方式，指包括野生型功能部分失活而非全部失活的突變體。
通過本發(fā)明真菌細胞完成的基因修飾可以定位于該細胞DNA序列的編碼區(qū)和/或影響基因表達的區(qū)域。更具體而言，該修飾一般會影響編碼區(qū)或者負責或參與一個或多個基因表達的區(qū)，這些基因的表達產物是參與甘露糖基化的酶。
本發(fā)明真菌細胞使蛋白甘露糖基化的能力降低可能因為無活性酶的產生，這源于結構和/或構象變化，產生改變了生物特性的酶產物，所述酶產物生產的缺乏，或所述酶產物的低水平產生。
真菌細胞甘露糖基化途徑涉及第一個甘露糖殘基對蛋白質或肽的絲氨酸和/或蘇氨酸羥基的連接，然后通過隨后添加甘露糖殘基而延長至O-連接的雙-和寡糖。第一個甘露糖殘基從多萜醇一磷酸甘露糖(Dol-P-Man)轉移到內質網(wǎng)中蛋白質上，其它甘露糖殘基從高爾基體中的GPD-Man轉移。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，修飾的真菌細胞具有至少一個基因中的基因修飾，此基因的表達產物參與甘露糖殘基對絲氨酸或蘇氨酸羥基的結合。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，修飾的真菌細胞具有至少一個基因中的基因修飾，此基因的表達產物參與甘露糖殘基從Dol-P-Man前體向絲氨酸或蘇氨酸羥基的轉移。而還更優(yōu)選這些基因之一是PMT基因(例如PMT1，PMT2，PMT3，PMT4，PMT5，PMT6或PMT7)。優(yōu)選PMT基因是PMT1，PMT5或PMT7。
WO 94/04687，在此引入以作參考，描述了O-甘露糖基化活性缺陷型釀酒酵母的制備。通過基因破壞，URA3基因插入PMT1開放讀碼框架的HindIII限制性酶切位點可制備O-甘露糖基化活性缺陷型釀酒酵母。將所得突變體在YEPD(約pH6.95)上培養(yǎng)或在基本培養(yǎng)基+Ade，+Leu(約pH4.75，隨酵母生長而下降)。意外地，我們發(fā)現(xiàn)在WO 94/04687使用的生長培養(yǎng)基的pH值對于大規(guī)模培養(yǎng)PMT突變體以產生分泌型白蛋白不是最佳的。就大規(guī)模發(fā)酵期間宿主細胞完整性而言，我們發(fā)現(xiàn)pH6.0-6.8的生長培養(yǎng)基是較好的。
除了在參與甘露糖殘基對絲氨酸或蘇氨酸羥基之連接的基因中的修飾外，本發(fā)明的真菌細胞也可以在以下基因中帶有修飾，即參與隨后添加甘露糖殘基形成二-或寡糖的基因或參與甘露糖殘基供體(Dol-P-Man)合成的基因。
優(yōu)選所述真菌細胞在PMT基因內或影響PMT基因表達或產物的基因內具有修飾。影響PMT基因表達的基因可以，例如，影響mRNA轉錄水平或PMT產物水平。
本發(fā)明第六方面的真菌細胞可以從絲狀真菌和酵母中選擇，例如糖酵母屬(例如釀酒酵母)，克魯維酵母屬(例如乳酸克魯維酵母)或畢赤酵母屬(例如巴斯德畢赤酵母)。
優(yōu)選將表達重組白蛋白編碼序列的真菌細胞在至少5,000L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，更優(yōu)選至少7,500L。
優(yōu)選將表達重組白蛋白編碼序列的真菌細胞在維持于pH6.2-6.7范圍內的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，更優(yōu)選pH6.3-6.5。優(yōu)選將培養(yǎng)基的pH范圍用設置為pH6.3-pH6.5之間的pH控制儀保持，優(yōu)選設置為pH6.35-pH6.45之間，更優(yōu)選約pH6.4。優(yōu)選將pH控制劑控制在上述任一pH范圍中任何pH值的0.20或0.10pH單位或pH6.4的0.20或0.10pH單位內變動。
在另一實施方案中，將真菌細胞在保持pH5.30-pH5.90范圍的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選pH5.50-pH5.90，pH5.40-pH5.90或pH5.40-pH5.60。優(yōu)選低控制設置點在pH5.40-pH5.60之間，優(yōu)選在pH5.45-pH5.55之間，更優(yōu)選低控制設置點是約pH5.50。
本發(fā)明提供制備高純度白蛋白的方法。此白蛋白的特征是色料水平非常低。用在此處的術語“色料”意思指使白蛋白著色的任何化合物。例如，色素是由生物如用于制備重組白蛋白的酵母所產生的色料，而染料是由純化白蛋白的層析步驟產生的色料。
此白蛋白的特征也在于非常低水平的，或基本上不含，鋁，乳酸鹽，檸檬酸鹽，金屬，非白蛋白的人類蛋白質，例如免疫球蛋白，前-激肽釋放酶激活劑，轉鐵蛋白，α1-酸糖蛋白，血紅蛋白和凝血因子，原核蛋白，白蛋白片段，白蛋白凝聚物或聚合體，或內毒素，膽紅素，血紅素，酵母蛋白，動物蛋白和病毒?；旧喜缓侵傅陀诳蓹z測到的水平。
本發(fā)明的白蛋白可以至少99.5％是單體和二聚體，優(yōu)選基本上100％為單體和二聚體。最多0.5％，優(yōu)選0.2％的三聚體是容許的但是白蛋白的更大分子形式一般是沒有的。它還有下列一個或多個特征其鎳離子水平低于100ng/克白蛋白；用Amadori產物測定法檢測的糖基化水平低于0.6，優(yōu)選低于0.10，0.075或0.05摩爾己糖/摩爾蛋白質；完整的即均質的C-末端；conA結合的白蛋白低于0.5％(w/w)，優(yōu)選低于0.2％或0.15％；游離硫醇含量低于0.85摩爾SH/摩爾蛋白質；基本上無C18或C20脂肪酸。用本發(fā)明方法純化的白蛋白制劑中蛋白質總重量的至少99％，優(yōu)選至少99.9％是白蛋白。如此高純度的白蛋白是極不可能引起副作用的。
由于在起始原料中不存在血清，所以一般本發(fā)明的純化rHA完全無源自血清的污染。
按照本發(fā)明，可從不純的白蛋白溶液獲得高純度的白蛋白。此方法包括一個或多個下列步驟在發(fā)酵培養(yǎng)中培養(yǎng)用編碼人白蛋白氨基酸序列的核苷酸序列轉化的微生物；優(yōu)選將所述微生物與發(fā)酵培養(yǎng)基分離；必要時調節(jié)培養(yǎng)基狀態(tài)以便進一步純化；將調節(jié)過的培養(yǎng)基通過三個連續(xù)的層析步驟；將產物超濾/滲濾；將超濾產物進行進一步層析步驟；在通過另兩步層析步驟純化前再次超濾/滲濾；最后超濾/滲濾。
或者，不用所述發(fā)酵培養(yǎng)基，可以用近50年來發(fā)展的任何提取和純化技術從血清中獲得不純的白蛋白溶液，例如Stoltz等(1991)Pharmaceut.Tech.Int.1991年6月，60-65和More & Harvey(1991)在“血液分離和血漿分級分離”Harris編，Wiley-Liss，261-306中所述。
或者可以從轉基因動物，例如山羊，綿羊或牛獲得白蛋白，例如從，所述動物的牛奶或血液或，如果是轉基因雞，從蛋清獲得。
又或者可以從轉基因植物，例如煙草，馬鈴薯或谷類(玉米)獲得白蛋白。
當白蛋白從非血漿來源純化時，現(xiàn)有技術中的純化方法導致相當高水平的鎳離子。已知白蛋白在其分子N-末端具有對銅，鎳和鋅離子高親和力的結合位點。結果，白蛋白分子從用于培養(yǎng)和/或純化的培養(yǎng)基中強力聚集鎳離子。按照本發(fā)明純化的白蛋白具有相當?shù)退降逆囯x子。
在本發(fā)明的任意步驟之前或隨后可以對白蛋白溶液進行緩沖液交換，濃縮，稀釋，加熱(包括滅菌)，冷卻或者可以向白蛋白溶液中加鹽等，這可以，例如，改善或調節(jié)該溶液的pH值?？梢匀芜x將白蛋白用還原劑處理或可進行脫色步驟。
可以將最終產物配制成具有添加穩(wěn)定性并可根據(jù)其預期用途配制，例如可以將其制成制劑用于胃腸外給藥，優(yōu)選對人的非腸道給藥。合適地，將白蛋白進行滅菌。
優(yōu)選本發(fā)明的高純度白蛋白產物包含至少100g，更優(yōu)選1kg或10kg白蛋白，它們可以被分成許多瓶。
除了在燒傷，休克或失血時用于治療外，本發(fā)明的白蛋白可以有許多作用。如可將它作為終產物賦形劑(例如在液體制劑，凍干制劑或吸入制劑中)，用于純化過程中使其他蛋白質穩(wěn)定，用于細胞培養(yǎng)，病毒的生產，基因治療，體外培養(yǎng)基滅菌，和用于醫(yī)療設備如插管，導管和血管假體的涂層。
應理解可將本發(fā)明的每一方面與本發(fā)明的一個或多個其他方面組合。


在附圖中進一步說明本發(fā)明，其中圖1至7分別表示質粒pAYE309，pAYE440，pAYE438，pDB2241，pDB2242，pDB2243和pDB2244的構建；和圖8表示按照本發(fā)明制備的rHA中conA結合型rHA級分的電噴射質譜圖。
圖9表示pH值和時間對用ChelexTM從rHA中去除鎳的影響。
圖10和11代表與釀酒酵母PMT1蛋白編碼區(qū)具有同源性的兩種DNA序列。
圖12至15代表與釀酒酵母PMT7蛋白編碼區(qū)具有同源性的四種DNA序列。
圖16和17代表與釀酒酵母PMT5蛋白編碼區(qū)具有同源性的兩種DNA序列。
具體實施例方式
本發(fā)明的方法可用于從多種來源的不純的白蛋白溶液如血清獲得高純度白蛋白，尤其適用于純化重組人白蛋白(rHA)。按照本發(fā)明生產的白蛋白可以是任何哺乳動物的白蛋白，例如大鼠，牛或羊的白蛋白，但是優(yōu)選是人白蛋白。
可以將編碼白蛋白的DNA在合適的宿主內表達以生產白蛋白。因此，可以按照已知技術使用DNA，根據(jù)本文所含指教作適當?shù)男薷?，以構建表達載體，然后將其用于轉化合適的宿主細胞從而表達和生產白蛋白。
為導入合適的宿主內可以將編碼白蛋白的DNA連接到很多種其它DNA序列中。所述伙伴DNA將取決于宿主的性質，DNA導入宿主的方式，以及希望以附加體形式保持還是整合。
一般地，為了表達將DNA以正向和正確的讀碼框形式插入表達載體，例如質粒。如果需要，可以將DNA連接到所選宿主能識別的相應轉錄和翻譯調控核苷酸序列上，但這類調控序列在所述表達載體上通常已存在。為了盡量減少翻譯的通讀并因此避免延長的，非自然融合蛋白的產生，最好引入一種以上編碼翻譯終止密碼子的DNA序列，例如UAA，UAG或UGA。編碼翻譯終止密碼子的DNA序列優(yōu)選UAA。然后用標準技術將載體導入宿主，隨后篩選已轉化的宿主細胞。然后將如此轉化的宿主細胞培養(yǎng)足夠的時間并且在本領域技術人員熟知的適合條件下培養(yǎng)，并根據(jù)本文已公開的指教，使之表達白蛋白并隨后回收。
已知有許多表達系統(tǒng)，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，酵母(例如釀酒酵母，巴斯德畢赤酵母和乳酸克魯維酵母)，絲狀真菌(例如曲霉屬)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。優(yōu)選微生物是酵母中的釀酒酵母，乳酸克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母。尤其有利的是使用在一種或多種參與蛋白質O-糖基化的甘露糖基轉移酶中有缺陷的酵母，例如通過基因編碼序列的破壞造成的缺陷。
白蛋白的蛋白質序列不包含任何N-連接糖基化位點并且尚無在天然狀態(tài)下被O-連接的糖基化的報道。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多酵母種屬生產的rHA可以經(jīng)通常有甘露糖參與的O-連接的糖基化來修飾。甘露糖基化的白蛋白能結合伴刀豆球蛋白A。由酵母生產的甘露糖基化白蛋白的量可以通過使用缺陷一種或多種PMT基因的酵母株(WO94/04687)而降低。
達到此目的最方便的方式是創(chuàng)建具有基因組缺陷的酵母因此產生降低了水平的其中一種Pmt蛋白質。例如，可以在其編碼序列或調節(jié)區(qū)(或調節(jié)PMT基因之一表達的另一個基因中)缺失，插入或轉座因而產生少量或不產生Pmt蛋白質?；蛘?，可以將酵母轉化以產生抗-Pmt因子，例如抗-Pmt抗體。
為了修飾其中一種PMT基因以致生產降低了水平的Pmt蛋白質，可以使用定點誘變或其他已知技術以創(chuàng)建單或多突變，例如置換，插入，缺失，和轉座，如在Botstein和Shortle，“體外誘變的戰(zhàn)略和應用”，科學，229193-210(1985)中描述的，在此將其引入以作參考。合適的突變包括鏈終止突變(明顯地導入到近3’端的終止密碼子可能對有益的基因產物已影響不足，本領域的技術人員將容易地在該編碼序列5’側四分之三區(qū)域中制造突變)，改變讀碼框架的點突變，編碼序列的小到大的缺失，影響基因表達的啟動子或終止子內的突變和使mRNA失去穩(wěn)定性的突變。通過稱為基因置換(Winston，F(xiàn).等(1993)酶學方法101，211-228)的基因破壞技術之延伸技術可以介導特殊的突變。
一般地，使用選擇標記破壞基因序列，但是這不是必須情況，尤其如果可以在表型水平上檢測破壞事件時。在許多實例中間插序列的插入指終止密碼子與Pmt序列共存于個讀碼框架中且插入的編碼序列不被翻譯?；蛘?，插入的序列可以在與Pmt不同的讀碼框架中。
基因可以具有一個或多個切除或轉化的部分(可任選包括調節(jié)區(qū)，甚至整個基因)，或者它可以具有插入部分，從而使其中一個PMT位點的蛋白質生產水平降低和/或使其中一個PMT位點產生活性水平降低了的蛋白質。
釀酒酵母的PMT基因編碼O-甘露糖基轉移酶家族的七個(PMT1-PMT7)特異性各不相同的蛋白質。這些蛋白質也稱作多萜醇磷酸-D-甘露糖蛋白質轉移酶，多萜醇-磷酸-D-甘露糖蛋白質，O-D-甘露糖基轉移酶或磷酸甘露糖轉移酶(Gentzsch和Tanner，歐洲分子生物學組織雜志15，5752-5757，1996，和它包括的參考文獻)。這種膜整合型酶家族催化甘露糖以多萜醇磷酸甘露糖形式轉移到多肽鏈內絲氨酸或蘇氨酸的羥基上，可用下列反應描述Mg2+Dol-P-Man+蛋白質(Ser/Thr)→蛋白質(Ser/Thr)-Man+Dol-P現(xiàn)有證據(jù)表明多萜醇磷酸甘露糖的合成和隨后甘露糖向蛋白質的轉移發(fā)生在內質網(wǎng)內。
很明顯這個家族的酶具有不同的底物(蛋白質)特異性(Gentzsch和Tanner(1997)糖生物學(Glycobiology)7，481-486)。參與試驗的七種蛋白質有五種是Pmt1p和Pmt2p(分別是PMT1和PMT2基因的產物)的底物，如它們在pmt1或pmt2突變的釀酒酵母株中糖基化不足所顯示。另外兩種蛋白質明顯不受PMT1或PMT2突變的影響，但是在pmt4突變株中糖基化不足。
已經(jīng)將92kD的Pmt1p蛋白質O-甘露糖基轉移酶從溶解的釀酒酵母膜中純化成同質型(Strahl-Bolsinger和Tanner(1991)歐洲生物化學雜志196，185-190)。編碼Pmt1p的基因(PMT1)已克隆并測序。此基因定位在IV號染色體上并且編碼具有817個氨基酸的一級序列的單一多肽(Strahl-Bolsinger等(1993)P.N.A.S.USA90，8164-8168)。PMT1(和其他PMT基因)的序列信息可用于在釀酒酵母中相關甘露糖基轉移酶編碼基因的鑒定。
圖10和11顯示的序列與釀酒酵母PMT1的蛋白編碼區(qū)同源，圖12至15顯示的序列與釀酒酵母PMT7的蛋白編碼區(qū)同源，圖16至17顯示的序列與釀酒酵母PMT5的蛋白編碼區(qū)同源。本領域的技術人員將會理解這些序列的任何一個可以用于鑒定(或破壞)釀酒酵母甘露糖基轉移酶基因?？梢岳斫鈭D10至17代表的序列片段可如許多同源于圖10至17所示序列及其片段的序列一樣作相似使用。產生同源序列的技術是本領域熟知的。
應當理解同源序列在這里指與圖10至17中任何一個所示序列，或與圖10至17中任何一個所示序列的片段具有至少70％，80％，90％，95％，或98％同源性的序列。
判定同源性百分比可以通過，例如，用Devereux等描述的(核酸研究12387，1984)GAP計算機程序，6.0版本對比序列信息，此程序可以從維斯康新大學遺傳計算機組(UWGCG)獲得。GAP程序利用經(jīng)Smith和Waterman修改(Adv.Appl.Math 2.482.1981)的Neddleman和Wunsch的比對方法(分子生物學雜志48443，1970)。優(yōu)選GAP程序的默認參數(shù)包括(1)核苷酸一元對比矩陣(其中同一性分值為1，非同一性分值為0)，及Bribskov和Burgess，核酸研究146745，1986的加權對比矩陣，見Schwarts和Dayhoff編，蛋白質序列及結構圖譜，國家生物醫(yī)學研究基金，353-358，1979；(2)每個空位罰分3.0，每個空位中的一個符號額外罰分0.10；和(3)末端空位不罰分。
如果使用除釀酒酵母以外的酵母，如巴斯德畢赤酵母或乳酸克魯維酵母，則破壞一種或多種等價于釀酒酵母PMT基因的基因也有利。從釀酒酵母分離的PMT1(或任何其它PMT基因)的序列可用于鑒定或破壞其它真菌種屬中編碼相似酶活性的基因。乳酸克魯維酵母的PMT1同系物的克隆在WO94/04687中有描述。
如果使用除釀酒酵母以外的酵母，圖10至17代表的序列也可以被用來鑒定(或破壞)等價于釀酒酵母PMT基因的基因。本領域技術人員會理解，圖10至17所示序列的片段可如同源于圖10-17所示序列及其片段的眾多序列一樣作類似應用。
實施基因破壞的方法在文獻中有描述，如Boehm等(Boehm，T.，Pirie-Shepherd，S.，Trinh，L.，Shiloach，J.和Folkman，J.(1999)酵母15563-572)，其描述釀酒酵母SUC2基因作為標記的應用，該基因側翼為靶基因特異性的巴斯德畢赤酵母DNA。在巴斯德畢赤酵母破壞的實例中，可以將SUC2DNA序列插入圖10至17所示任一種DNA序列內。
如分別在WO95/33833和WO95/23857指出的具有HSP150和/或YAP3基因缺失的酵母會較有利。
在優(yōu)選實施方案中將酵母用基于釀酒酵母2μm質粒的表達質粒轉化。轉化酵母時，質粒包含細菌復制和選擇序列，它們在轉化后，按照EP 286 424的方法通過內部重組事件切除。該質粒也包含一個表達盒，其包括如EP431 880所示的酵母啟動子(例如釀酒酵母PRB1啟動子)；編碼分泌前導序列的序列，例如，所述前導序列包括天然HSA分泌前導序列的大部分，加上如WO 90/01063所示的釀酒酵母α-交配因子分泌前導序列的一小部分；HSA編碼序列，其可用分離相應人基因cDNA的已知方法獲得，并且也公開于，例如，EP 73 646和EP 286 424；和轉錄終止子，優(yōu)選EP 60 057所示糖酵母ADH1的終止子。優(yōu)選該載體結合至少兩個翻譯終止密碼子。
盡管上述質粒各種因素的選擇可能有助于改善產物的產量，但是認為與所得白蛋白產物的純度無直接相關。發(fā)酵和純化方法的優(yōu)選實施方案在實施例1構建白蛋白生產型微生物的克隆策略如EP 431 880所示，不同的是白蛋白編碼序列的3’末端及其與ADH1轉錄終止序列的連接被改變，從而消除了ADH編碼序列并導致出現(xiàn)兩個連續(xù)的讀碼框內翻譯終止密碼子，下游還跟有一個第三終止密碼子，如下所示.....LGL 終止密碼 終止密碼 A 終止密碼....TTA GGC TTA TAA TAA GCTTAA......
這可用兩條單鏈寡核苷酸JMADH1和JMADH2，對質粒pAYE309的ADH1終止子(見EP 431 880)進行PCR誘變來實現(xiàn)，所述引物序列為
JMADH1HindIII5’-GCATAAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAG-3’JMADH2NotIBamHI3’-TGGACAACATTAGCAAGAAGGTGTGCCTAGCGCCGGCGCCTAGGTACG-5’PCR反應條件為94℃60秒，37℃120秒，72℃180秒的25個循環(huán)。0.48kb的PCR產物由HindIII和BamHI消化，并連接進入質粒pBST+(見WO97/24445，用HindIII和BamHI作類似消化)，產生質粒pAYE440(圖2)。通過兩條單鏈寡核苷酸AT19R和通用的-40引物進行PCR誘變進一步修飾ADH1終止子，所述引物序列如下AT19RHindIII5’-AGTCCAAGCTTAATTCTTATGATTTATGAT-3’-403’-CAGCACTGACCCTTTTG-5’PCR條件為94℃30秒，50℃40秒，72℃50秒的25個循環(huán)，然后一個72℃10分鐘循環(huán)，采用pAYE440中的ADH1終止子為模板(圖2)。使用的儀器為Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600。獲得正確大小的產物，約為0.33kb，并用HindIII和BamHI消化。質粒pAYE309(EP 431880)用NotI和HindIII消化，0.84kb DNA片段包含PRBI啟動子片段和用于引導成熟HSA分泌的HSA/MFα-1前導序列(WO 90/01063)之一部分，將此DNA片段連接至NotI和HindIII消化的pBST+(WO97/24445)，產生質粒pAYE438(圖3)。受體質粒pAYE438由HindIII和BamHI消化，經(jīng)過修飾的ADH1終止子被成功克隆進此載體，產生質粒pDB2241(圖4)。此質粒包含pBST+(WO97/24445)骨架，PRB1啟動子和修飾過的ADH1終止子。
為便于在HSA編碼區(qū)域末端引入兩個翻譯終止密碼子，以及產生所需HindIII位點，改變了HSA編碼區(qū)域的3’末端。
雙鏈寡核苷酸接頭AT21/AT22被連接至AflII/HindIII酶切的pDB2241，在其5’末端包含一個AflII位點，一個填充片段區(qū)域，隨后是編碼HSA的DNA的Bsu36I至HindIII序列，但是多加入一個TAA翻譯終止密碼子。插入了接頭的克隆子經(jīng)DNA測序確認，正確的質粒指定為pDB2242(圖5)。
接頭AT21/22AT21AflIIBsu36IHindIIITTA AGA GTC CAA GCC TTA GGC TTA TAA TACT CAG GTT CGG AAT CCG AAT ATT ATTCGAA L G L 終止密碼 終止密碼為產生最終的rHA表達盒，將pAYE309(圖1)的AflII/Bsu36I片段連接至AflII/Bsu36I消化的pDB2242，得到質粒pDB2243(圖6)。最終，通過將pDB2243的NotI表達盒連接進入NotI酶切的pSAC35(Sleep等，1991，生物/技術9，183-187和EP 431 880)可產生質粒pDB2244(圖7)，其中rHA的轉錄方向與LEU2基因的相同，這樣就得到了rHA表達解離(disintegration)載體。
因此質粒pDB2244可由解離載體pSAC3(Chinery和Hinchliffe(1989)當代遺傳學16，21-25)得到，其包括整個所述2μm質粒，用于補充宿主leu2突變的LEU2基因，表達盒和細菌質粒pUC9，所述表達盒中PRB1啟動子驅動HSA序列的表達。所述細菌質粒由釀酒酵母2μm FLP重組酶系統(tǒng)從pDB2244中切除，使生產rHA的生物(Chinery和Hinchliffe，op cit.)中不含細菌DNA。
所述表達載體利用釀酒酵母PRB1啟動子和ADH1轉錄終止子來控制表達，利用HSA/MFα-1前導序列(WO 90/01063)來引導成熟HSA的分泌。
采用Hinnen等人，(1978)P.N.A.S.75，1929，所述方法將質粒pDB2244引入釀酒酵母菌株leu2，yap3，hsp150，pmt1[cir]。pmt1突變體可由WO94/04687的方法得到。在缺乏亮氨酸的已緩沖基本培養(yǎng)基(0.15％(w/v)無氨基酸和硫酸銨(Difco)的酵母氮源，0.5％(w/v)硫酸銨，0.1M檸檬酸/Na2HPO4.12H2OpH6.5，2％(w/v)蔗糖))中篩選轉化體。轉化體于50ml燒瓶中30℃，200rpm生長72小時，所述燒瓶中含10ml復合液(YEP，1％(w/v)酵母浸膏，2％(w/v)細菌用蛋白胨和2％(w/v)蔗糖)或已緩沖的基本培養(yǎng)液，后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和/或火箭凝膠免疫電泳可以在不含細胞的培養(yǎng)上清中檢測到rHA。
用緩沖的基本培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物母種制備加工酵母的工作種(工作細胞庫)，所述酵母適于制備搖瓶培養(yǎng)物，其方式是在有20％(w/v)海藻糖的情況下將所述培養(yǎng)物冷凍分裝。
發(fā)酵方法在本質上與WO 96/37515和US 5 728 553(均引入本文為參考)中描述的相同，以下是不同之處種子發(fā)酵在把用于rHA生產的培養(yǎng)基加入到種子發(fā)酵容器中后，設定操作溫度為30℃，同時還設定達到均勻所需的最低攪拌速度，通過如此攪拌可無需諸如氧或碳等營養(yǎng)成分。起始pH用設定為6.40的pH控制計以氨水(比重0.901)調節(jié)，控制在6.40±0.10的范圍。
可選地，pH可保持在5.50到5.90，設定的較低控制點為5.50。初始pH可用氨(例如氨水，比重0.880)調節(jié)。此較低發(fā)酵pH可使rHA的質譜特性增強。
因為在線儀器可觀察到的生長的最初信號就是pH的降低，所以為方便觀察早期代謝，優(yōu)選初始pH在前述范圍的高端附近。
尤其對于一個或多個PMT基因缺陷株，發(fā)酵在比通常所需更高的pH下進行是有利的。因此與控制pH在5.5附近相比，設定在pH6.20到pH6.70之間較為有利，優(yōu)選在pH6.3到6.5。在這類較高pH下，由于細胞分裂的減少，離心液(centrate)的質量得到顯著改善。對發(fā)酵液的離心只足以從上清中除去所有完整細胞，但細胞分裂產生的細胞碎片將留在懸浮液中。這一點在表1中證實，表中可見酵母在pH6.3到6.5培養(yǎng)比在pH5.5培養(yǎng)，其上清液濕重顯著降低。

表1種子發(fā)酵容器中發(fā)酵pH和離心液的關系。括號內的值是標準差和樣本數(shù)。
2M H2SO4也用作pH矯正試劑。容器中加入蔗糖20g.L-1，MW10分批維生素，Breox FMT30消泡劑0.04g.L-1。
經(jīng)過過濾除菌的空氣以0.5v/v/m(即0.5升未壓縮的空氣每升培養(yǎng)基每分鐘)引入容器中，從無污染搖瓶培養(yǎng)液中?。?0mg細胞干重.L-1接種培養(yǎng)基，啟動計算機監(jiān)控系統(tǒng)。接種濃度為12mg.L-1的批次培養(yǎng)期預計為62±10h。在每批培養(yǎng)期結束前加入MW10(體積等于批體積)。
發(fā)酵控制算法的特點包括由溶解氧張力(DOT)在30分鐘內升高＞15％可指示培養(yǎng)期的結束；流加初始速度為每升分批培養(yǎng)液0.05ml；底物流加速度由如下公式確定，SF＝SF0eμk，其中SF是底物流加速度(mL.min-1)；SF0是初始流加速度(mL.min-1)，μ是比生長速率(h-1)(例如0.06h-1)，k是計算變量，以0開始，如果所有的條件都滿足的話，每一分鐘增長0.0167；DOT＜15％和/或呼吸商(RQ)≥1.2可使底物流加速度(通過k調控)減小。
如果pH＜6.20或如果溫度＜29.0℃或＞31.0℃時停止流加。這也可通過所述控制算法自動完成。如果平均RQ＞1.13的時間超過2h，或如果證據(jù)顯示有乙醇或乙酸積累，SF減小提高攪拌速度以保持DOT＞20％空氣飽和度。一旦流加開始，BreoxFMT30的濃度就提高到0.3g.L-1(以終體積計算)。培養(yǎng)期取決于容器的傳遞性能限制，預計為期65±17h。
發(fā)酵進程中增加通氣量以保持氧攝入速率(OUR)和二氧化碳釋放速率(CER)，使它們足以提供準確的氣體分析。一般發(fā)酵通氣量為1v/v/m。每天進行檢查確定培養(yǎng)的純度和CDW。保留適當?shù)臉悠?。流加的末期，將培養(yǎng)液轉移到生產容器中。
生產發(fā)酵在生產性發(fā)酵容器中接種0.25-1.00g.cdw.L-1。初始pH用氨水調節(jié)(SG0.901)，所用pH控制儀設定在pH6.40；控制范圍6.40±0.10。
可選地，pH可保持在5.50到5.90，設定的較低控制點為5.50。初始pH可用氨(例如氨水，比重0.880)調節(jié)。此較低的發(fā)酵pH會產生一個增強的rHA質譜圖。
因為在線儀器可觀察到的生長的最初信號就是pH的降低，所以為方便觀察早期代謝，優(yōu)先選擇初始pH在前述范圍的高端附近。
尤其對于一個或多個PMT基因缺陷株，發(fā)酵在比通常所需更高的pH進行是有利的。因此與控制pH在5.5附近相比，設定在pH6.20到pH6.70之間較為有利，優(yōu)選在pH6.3到6.5。在這類較高pH下，由于細胞分裂減少，離心液的質量得到顯著改善。對發(fā)酵液的離心只足以從上清中除去所有完整細胞，但細胞分裂產生的細胞碎片將留在懸浮液中。這一點在表2中證實，該表中酵母在pH6.5培養(yǎng)比在pH5.5培養(yǎng)，其上清液濕重顯著降低。

表2生產容器中發(fā)酵pH和離心液的關系。
2M H2SO4也用作pH矯正試劑。容器中加入蔗糖20g.L-1，MW10分批維生素，Breox FMT30消泡劑0.04g.L-1。
初始底物流加速度由如下公式確定

其中SF0是初始底物流加速度，μ是比生長速率(例如0.06h-1)，V批是批體積(L)，Yx/s是細胞產量(g.L-1)，[蔗糖]是蔗糖濃度(g.L-1)，[CDW]是細胞干重濃度(g.L-1)。底物流加速度按照如下公式確定，SF＝SF0eμk，其中SF是底物流加速度(mL.min-1)；SF0是初始底物流加速度(mL.min-1)，μ是比生長速率(h-1)(例如0.06h-1)，k是計算變量，以0開始，如果所有的條件都滿足的話，每一分鐘增長0.0167。幾個條件在發(fā)酵進程中不斷進行評估，并用于通過k的操作調整SF；DOT＜15％和/或呼吸商(RQ)≥1.2可使SF減小。pH＜6.2或溫度＜29.0℃或＞31.0℃時停止流加。這也可通過控制算法自動完成。如果平均RQ＞1.13持續(xù)2h，或如果證據(jù)顯示有乙醇或乙酸積累，SF減小。
提高攪拌速度以保持DOT＞20％空氣飽和度，達到最大值后保持以利于混合。一旦流加開始，培養(yǎng)液處于碳的限制下，Breox FMT30的濃度提高到0.2-0.32g.L-1(以終體積計算)。培養(yǎng)期取決于容器傳遞性能的限制，8,000升規(guī)模通常為90-120h。
發(fā)酵進程中通氣量漸增以保持氧攝入速率(OUR)和二氧化碳釋放速率(CER)在足以提供準確氣體分析的水平。容器增壓以加強OTR。一般發(fā)酵的通氣量為1v/v/m。每天進行檢查確定培養(yǎng)物的純度和CDW。保留適當?shù)臉悠贰?br> 流加末期保存培養(yǎng)液供下游處理。
生產培養(yǎng)液的維持生產培養(yǎng)液在適當條件下維持以便能對其分批處理。保存時間應最短，但可延長至48小時且必要時可超出(如達5天)。應理解在分批處理的情況下，在此表示的保存時間的限制適用于培養(yǎng)液待處理的最后部分。
制備或調節(jié)發(fā)酵物離心液或其它任何來源的不純的白蛋白溶液(如血漿)以便在陽離子交換介質上進行層析，并同時保護rHA免于聚合和被蛋白酶裂解。優(yōu)選加入辛酸鈉(層析液14(CS14)-表3)至終濃度1-10mM，例如5mM左右。pH用乙酸調整到pH4.3-4.8，優(yōu)選4.50±0.1(最優(yōu)選±0.05)，導電率經(jīng)檢測為＜5.5mScm-1。
層析所有操作可以在室溫(20±5℃)下進行。由SDS-PAGE(在第一步)或GP-HPLC(對于所有其他的柱子)測定上樣于層析柱的白蛋白滴度(g/L)。每一步驟由UV吸收值在線監(jiān)測，例如在254或280nm處監(jiān)測。
在本發(fā)明特別優(yōu)選例子中，純化過程包括以下步驟陽離子交換層析(SP-FF)；陰離子交換層析(DE-FF)；親和層析(DBA)；超濾和滲濾；第二次親和層析(PBA)；超濾和滲濾；第二次陽離子交換層析(SP-FF2)；第二次陰離子交換層析(DE-FF2)。優(yōu)選這些純化步驟后均進行最終的超濾/滲濾，接著是一個配制步驟，和/或將溶液倒入最終的容器。
在此描述的層析步驟的次序在幾個方面是新穎的和創(chuàng)造性的。如本文所述氨基苯硼酸鹽(boronate)(PBA)介質及改進型緩沖液的使用，和小體積上樣已顯示增強了酵母抗原的清除，如ELISA所測(約4-20倍)。氨基苯硼酸鹽(PBA)介質使用的緩沖液被意外地發(fā)現(xiàn)是特別有益的，它代表了具有廣泛組成和性質的多種緩沖液的深入實驗結果。與WO96/37515的PBA層析步驟使用的緩沖液相比，該緩沖液極大地增強了對酵母抗原的去除。
將高度濃縮的白蛋白溶液如100±10g.L-1上樣到氨基苯硼酸鹽介質上，意味著rHA和酵母抗原分辨率可因小體積上樣而獲得改善。
WO 96/37515在第一次親和層析后包括一個S200凝膠通透步驟。凝膠過濾步驟使該白蛋白在酵母抗原，色素和白蛋白二聚體方面得到純化。由于我們對氨基苯硼酸鹽親和層析步驟的改進和另引入了陽離子和陰離子交換步驟，我們發(fā)現(xiàn)此步驟不再是必需的。
氨基苯硼酸鹽親和層析后，優(yōu)選將白蛋白濃縮和滲濾以便進行被動方式的陽離子交換。我們發(fā)現(xiàn)此滲濾步驟和陽離子交換步驟的組合顯著降低鎳離子的相對濃度。特別地，置rHA于低pH能有效地降低鎳離子水平。結果是，依照本發(fā)明純化的白蛋白有著令人驚異地低鎳離子含量(低于100ng/g白蛋白)。
在此描述的被動方式陽離子交換步驟，用于除去伴刀豆球蛋白A結合物質(cbm)，其為少量被認為是糖基化修飾了的rHA。已發(fā)現(xiàn)被動方式陽離子交換步驟使由重組pmt1-突變型釀酒酵母產生的cbm成分減少了大約1.3倍。用非-pmt1突變體得到的rHA產生了更大效應(2-3倍清除)。
與其他市售的酵母相比，釀酒酵母產生相對低水平的修飾的rHA。相應地，如果rHA由除釀酒酵母以外的重組宿主產生，被動方式陽離子交換步驟和具有一種或多種PMT基因缺陷的細胞的使用可能更為重要。
白蛋白純化中使用的層析液詳述在表3中。由于對白蛋白極大規(guī)模生產，以及產物的相對較低消耗，這些緩沖鹽最適于本方法，因為它們可由工業(yè)規(guī)模生產得到高純品，而且相較于其它常用緩沖液，如tris，HEPES或MOPS，它們的消耗較低。除了表3所列，也可使用其它緩沖液，如具有相似pKa的緩沖液(如用蘋果酸代乙酸)，但在大多數(shù)事例中，大規(guī)模生產的成本和易得性限制了它們的使用。其它鹽形式只要是可溶的，能以工業(yè)規(guī)模提供且成本低則也可以使用。
緩沖液可按照下面描述的濃度配制，或者可在線配制高濃度儲備液并在使用時再混合或稀釋。
表3白蛋白純化所用層析液



具體到本實施例，所有重量均為±2％。
陽離子交換層析濃縮白蛋白，并通過陽離子交換層析使其在至少酵母蛋白(如果該白蛋白為酵母發(fā)酵產生的rHA)和其它抗原、低分子量雜質及色素化合物方面得到純化。該方法使用市售陽離子交換介質，如SP-Sepharose FF，SP-Spherosil，CM-Sepharose FF，CM-Cellulose，SE-Cellulose或S-Spherodex。優(yōu)選介質是SP-Sepharose FF(Pharmacia)，如果所用為軸流向柱，柱床高5-25cm，優(yōu)選10-15cm，如12.5cm。如果所用為徑流向柱，合適的柱床流道長度是11.0±1.0cm。柱上樣量為10到50g白蛋白/L，優(yōu)選40+10g白蛋白/L介質較合適。用緩沖液平衡介質以除去堿性貯存液；優(yōu)選該緩沖液應足夠強，可將pH降低到pH6.0。使用緩沖液，如CS01以除去柱中的貯存液CS07；然而可以使用任何pH＜6.0的緩沖液。當柱中流出物接近pH6.0時，可判斷平衡已完全。
制備或調節(jié)好發(fā)酵離心液以便在保護rHA免于聚合和被蛋白酶裂解的情況下進行陽離子交換層析。但是，如果該酵母菌株并非在純化rHA所需pH下能夠降解rHA的蛋白酶的缺陷型，應對培養(yǎng)上清進行加熱處理，例如50-70℃熱處理30分鐘到5小時，如WO 94/03636描述的。通常1-10mM辛酸鈉足以保護rHA免于熱變性，60-80℃下30秒到10分鐘足夠使蛋白酶在分批次或流通處理中失活。如果使用HSA也需要加熱處理。
然后將調節(jié)好的離心液以例如0.07-0.75柱床體積/min，優(yōu)選0.3-0.6柱床體積/min，在本例中0.5柱床體積/min的流速上樣，接著用一種或多種溶液淋洗，以除去殘留的雜質。柱首先可以8倍體積的10-100mM，優(yōu)選30-70mM，例如50mM乙酸，pH3.9-4.1，0.6-0.8mS.cm-1(CS02)淋洗。接著用4倍體積的高鹽緩沖液如含1-3M NaCl，優(yōu)選2M NaCl的乙酸鈉緩沖液(例如10-50mM乙酸鈉，優(yōu)選約27mM，pH3.5-4.5，優(yōu)選pH4.0)(CS03)洗柱，接著用10倍體積的CS01洗柱。用乙酸鹽/辛酸鹽緩沖液(例如40-120，優(yōu)選60-100，如85mM乙酸鹽和2-50mM，優(yōu)選2-20mM，如5mM辛酸鹽，如在CS04中)洗脫和收集白蛋白。白蛋白的收集始于UV信號超過0.6A254/cm，止于UV信號低于0.36A254/cm。接著柱子用0.25-3.0M NaCl和0.05-2％去污劑(CS05)清洗，然后用0.1-1.0M NaOH(CS06)清洗，保存于稀釋的(10-50mM)NaOH(CS07)中。本例中，平衡，上樣和淋洗步驟的流速是每分鐘0.5柱床體積。洗脫白蛋白時流速0.04-0.6柱床體積/min，優(yōu)選0.15-0.35，本例中采用0.25柱床體積/min。
陰離子交換層析陽離子交換劑的洗脫液稀釋到10mS.cm-1以下，優(yōu)選5mS.cml-1以下，特別是2.5mS.cm-1以下，接著上樣到陰離子交換樹脂，如QMA-Spherosil，DEAE-Spherodex，Q-Hyper D，DEAE-cellulose，QAE-cellulose，或TMAE，DMAE，或DEAE Fractogel上。優(yōu)選介質是市售的陰離子交換介質DEAESepharose-FF(Pharmacia)，柱床流道長度11.0±1.0cm，用陽離子洗脫緩沖液(CS04)預平衡，再用3倍柱體積的CS01平衡。白蛋白以每升介質30±10g單體白蛋白上樣在介質上，接著介質用稀釋的四硼酸鹽緩沖液淋洗，如15-25mM四硼酸鉀或四硼酸鈉(CS08)，它能影響pH上升到9.2左右，然后白蛋白用更高濃度的四硼酸鹽緩沖液(例如80-150mM四硼酸鉀，優(yōu)選110mM四硼酸鉀(CS09))洗脫。介質在稀釋的NaOH(CS07)中保存前，先用鹽/去污劑(CS05)再用NaOH(CS06)清洗。然后，該陰離子交換介質的洗脫液上樣到親和介質上。
親和層析此步驟在45kDa N-末端白蛋白片段，酵母抗原和色素方面進一步純化rHA。親和介質可以包括結合白蛋白的任何Cibacron藍型染料，例如ReactiveBlue 2，Procion Blue HB，Blue Sepharose，Blue Trisacryl和其他蒽醌型化合物。優(yōu)選介質是“Delta Blue”Matrix(DBA)，如WO 96/37515所述制備。
該方法采用柱床流道長度為11.0±1.0cm的DBA。DBA在乙酸銨緩沖液(100-300mM，優(yōu)選200-275mM，例如CS10中250mM)中平衡。白蛋白用量7.0-14.0g/L，優(yōu)選8.0-12.0g/L，本例中10.0±1.0g/L。平衡、上樣和淋洗步驟以流速0.05-0.30柱床體積/min，優(yōu)選0.15-0.27，本例中0.25柱床體積/min進行。所有其他步驟以流速0.20柱床體積/min進行。上樣完成后，用1-5倍體積乙酸銨緩沖液10-30mScm-1(優(yōu)選15-25mScm-1)進行淋洗以除去雜質，如CS10優(yōu)選5倍柱床體積。白蛋白采用強鹽和磷酸鹽溶液(1.0-3.0MNaCl，例如1.5-2.5M NaCl或2.0M NaCl，和5-100mM，如50mM磷酸鹽，如CS11中一樣)洗脫。接著用CS06清洗柱，并保存在CS07中。
接著使DBA柱的洗脫液濃縮并滲濾，準備采用苯硼酸鹽瓊脂糖(PBA)層析進行純化。DBA超濾用超濾膜進行，這些超濾膜適用于蛋白質濃縮，截留分子量為30,000或更小，優(yōu)選標定截留分子量10,000的聚醚砜膜(如Filtron Omega系列)。將DBA濃縮至≈100g rHA.L-1，接著對至少5倍體積的水滲濾，然后對5倍體積的CS20滲濾。滲濾結束時可根據(jù)要求進一步濃縮滯留液，并用CS20清洗該設備以增加該步驟的回收率。滯留液的最終濃度范圍應為20-120g rHA.L-1，優(yōu)選70-120g.L-1，或如在本例中的100±10grHA.L-1。使用后，膜用水沖洗出殘余蛋白質，用CS06洗凈，并保存在CS07中。
PBA是除去糖共軛物如糖蛋白，糖脂和多-，寡-和單糖的親和步驟，其利用固相化氨基苯硼酸作為配基。氨基苯硼酸通過一個間隔臂共價偶合到不溶性介質，比如聚丙烯酰胺，瓊脂糖，纖維素聚合物或有機聚合物上。美國專利4 562 251(在此引入作為參考)描述了制備二硼酸三嗪(diborotriazine)或單硼酸三嗪(monoborotriazine)瓊脂糖的合適方法(1)三嗪先O-連到瓊脂糖上，接著在第二個反應中與3-氨基苯硼酸(APBA)連接。(2)三嗪先與APBA反應以產生單或二硼酸三嗪。這些再通過三嗪上的自由氯O-連到-ONa活化的瓊脂糖上，可產生單或二取代的瓊脂糖。
較早的美國專利4269605涉及多種的活化方法，包括瓊脂糖的表氯代醇活化，為本文優(yōu)選。市售的介質包括Amicon的PBA30和Sigma的丙烯酸珠狀氨基苯硼酸鹽。
已發(fā)現(xiàn)使用含甘氨酸(10-500mM，如25-200mM，優(yōu)選50-150mM，本例中100mM)，NaCl(0-500mM，例如25-200mM，優(yōu)選50-150mM，本例中100mM)和CaCl2(5-25mM，優(yōu)選10-100mM，本例中50mM)，pH8.0-9.5優(yōu)選pH8.0-9.0，本例中pH8.5(CS20)的緩沖液特別有利。
PBA柱采用流道長度11.0±1.0cm，且由如上所述用緩沖液，如CS20預平衡。柱上樣量小于1倍柱體積，優(yōu)選小于0.5倍柱體積，本例中≤0.35倍柱體積。PBA以被動方式進行，因此在流通液和淋洗液中收集白蛋白。所有的層析步驟都可在流速0.005-0.3柱床體積/min下進行。優(yōu)選柱的平衡和清洗在比白蛋白溶液的上樣和收集流速(優(yōu)選0.01-0.05，更優(yōu)選在0.025柱床體積/min)更高的流速(如0.19柱床體積/min)下進行。接著此柱用鹽(CS03)，硼酸鹽緩沖液(CS09)，NaOH(CS06)清洗，然后保存在稀釋的NaOH(CS07)中。
PBA層析后，濃縮并滲濾白蛋白溶液以備被動方式陽離子交換。此超濾步驟和被動方式陽離子交換層析的結合可極大地減小鎳離子相對濃度。
PBA超濾用適于蛋白質濃縮的任何超濾膜進行，這些超濾膜的截留分子量為30,000或更小，優(yōu)選標定截留分子量10,000的聚醚砜膜(如FiltronOmega系列)。收集的PBA流通液用CS21調到pH5.3±0.5，濃縮至≈100grHA.L-1然后對至少7倍體積的CS19滲濾。滲濾結束后用CS19清洗該設備，再按要求加入CS19使滯留液濃度為50±10g rHA.L-1。最終，加入辛酸鈉使?jié)舛葹?-15左右，優(yōu)選5-10，更優(yōu)選6-9，本例中6mM，如加入CS14至3mL.L-1。使用后，膜用水沖洗出殘存蛋白，用CS06洗凈，用CS07保存。
然后用，例如SP-FF Sepharose(Pharmacia)以被動方式進行第二次陽離子交換層析白蛋白液，即白蛋白通過介質，而不是被截。所用條件使甘露糖基化的白蛋白結合到介質上。緩沖液優(yōu)選是乙酸鈉緩沖液(5-110mM乙酸鹽，優(yōu)選10-50mM，本例中30mM)，pH5.2-5.4，CS19)?？梢允褂闷渌茉诤线m范圍內起緩沖作用的緩沖液，比如檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液。合適緩沖液的導電率為約2mS.cm-1。柱流道長度11.0±1.0cm，白蛋白上樣量為10-250g.L-1，優(yōu)選20-70g.L-1，本例中50±15g或50±10g.L-1介質。由于這是被動步驟，在流通液和淋洗液中收集白蛋白。
在這一陽離子交換步驟后，對白蛋白進行被動方式陰離子交換層析。此步除去可由ELISA和Western印跡法檢測到的酵母抗原。收集第二次陽離子交換的流通液和淋洗液，用CS21調pH到4.60±0.10，用水稀釋到1.05±0.1mS.cm-1，用如下條件純化rHA。此步用陰離子交換介質例如DE-FFSepharose(Pharmacia)，流道長度11.0±1.0cm，白蛋白上樣量為50-250g.L-1，優(yōu)選150±50g.L-1介質。由于這是一個被動步驟，在流通液和淋洗液中收集白蛋白。然后流通液和淋洗液的pH用CS22調到7.0±0.1。
或者，如實施例9所述，pH的調整可以在最后的UF進液容器中進行，而不是在DEAE流通液和淋洗液中進行。
雖然實施例1是以pmt1突變體舉例說明的，應理解本發(fā)明的純化方法可同樣應用于非此位點突變或非任何其它pmt位點突變的宿主細胞。
實施例2用兩種檢驗方法檢驗離心液的質量。離心液質量越差，酵母細胞的“活性(robustness)”就越差。
兩種檢驗方法是1.測定離心液在600nm(A600)處的吸收值。
2.測定離心液中顆粒的濕重(WW)。
兩種方法中，測定值越高，離心液的質量就越差。
三種不同酵母菌株在兩種不同pH條件下補料分批發(fā)酵的離心液質量進行對比。

表4三種不同rHA生產株在兩種不同pH條件下補料分批發(fā)酵的A600和WW值。第一列標明了特異性基因缺失。括號內的值是標準差和樣本數(shù)。
從上表中可以得出結論，在pH5.5，多基因缺失株產生較差的離心液，而在pH6.4或6.5下，避免了這更多基因缺失的不利影響。
實施例3此例的實施方式與實施例1相同，但是使用的菌株不是pmt1突變體。此菌株也在兩種不同的pH控制值下培養(yǎng)，其離心液濕重的測定方法與實施例1相同。在提高的pH控制點下培養(yǎng)的優(yōu)勢也體現(xiàn)在此菌株上；如表5所示，酵母在pH6.3到6.5下比在pH5.5下所得培養(yǎng)上清的濕重顯著降低。

表5非-pmt1菌株離心液質量與發(fā)酵pH的關系。括號中的值是標準差和樣本數(shù)。
因此，將pH控制在6.20-6.70，優(yōu)選pH6.3-6.5比pH約5.5更為有利。在這種較高pH下，離心液質量因細胞分裂的減少而顯著改善。
實施例4本實施例以類似于實施例1的方式實施，有以下不同。巴斯德畢赤酵母GS115株(Invitrogen)用上述相同條件和培養(yǎng)基培養(yǎng)，但pH設定在5.90；控制范圍5.90±0.20，以葡萄糖為碳源的比生長速率為0.10h-1。分批培養(yǎng)期為28h，連續(xù)培養(yǎng)期(feed phase)為42h。一旦連續(xù)培養(yǎng)開始，就加入重組人白蛋白，使發(fā)酵末期rHA終濃度為3.8g.L-1培養(yǎng)液。用于穿刺畢赤酵母培養(yǎng)基的rHA已純化，但并非使用本發(fā)明的純化方法。
然后按實施例1所述純化方法純化畢赤酵母補料分批培養(yǎng)所得rHA。
實施例5本實施例描述了按實施例4所述從畢赤酵母培養(yǎng)液中純化的rHA的分析方法。
免疫試驗資料對以下物質進行免疫試驗(i)純化自畢赤酵母培養(yǎng)基的rHA；(ii)用于穿刺該培養(yǎng)基的rHA；(iii)釀酒酵母所產生并已依本發(fā)明方法純化的白蛋白。
Western印跡簡述抗體批號Ig9601膠類型 4-12％SDSNR NOVEX GELS奶粉類型UHT暴露時間20秒Ig9601針對非-白蛋白生產型釀酒酵母菌株，并因此可用于檢測酵母抗原。
Western印跡表明，由畢赤酵母培養(yǎng)基得到的白蛋白比用于穿刺畢赤酵母發(fā)酵液的物質，在酵母抗原圖譜中所含區(qū)帶較少，且強度較弱。由畢赤酵母得到的白蛋白其酵母抗原圖譜非常近似于由糖酵母得到的圖譜。
ELISA印跡簡述在由畢赤酵母培養(yǎng)基純化得到的白蛋白和用于畢赤酵母培養(yǎng)液穿刺的白蛋白中，酵母抗原雜質度用Ig9601通過ELISA定量。
由畢赤酵母培養(yǎng)基純化的白蛋白的酵母菌抗原含量低于此試驗的檢測水平(約0.004μg.g-1)，用于畢赤酵母培養(yǎng)液穿刺的白蛋白的相應抗原含量是0.62μg.g-1。
結合Con A的物質對純化自畢赤酵母培養(yǎng)基的白蛋白，和用于畢赤酵母培養(yǎng)液穿刺的白蛋白進行實施例9所述Con A試驗。結合Con A的物質的含量在前者中是0.22％(w/w)，在后者中是0.57％(w/w)。
在純化自畢赤酵母培養(yǎng)基的白蛋白中結合Con A的物質的水平近似于用本發(fā)明方法純化自釀酒酵母的白蛋白中的(參見表6)，而后者并非由pmt1突變體產生。
純度分析證實，本發(fā)明的方法能成功用于純化除釀酒酵母以外的酵母(如畢赤酵母)的白蛋白，還確認可以得到與純化自釀酒酵母的白蛋白有相似純度的白蛋白。
實施例6實施例1中第二次陽離子交換層析步驟(SP-FF2)之后為被動方式陰離子交換層析步驟(DE-FF2)。在另一純化方法中，所述第二次陽離子交換層析步驟之后可以進行主動方式陰離子交換層析。
來自于SP-FF2的洗脫液在pH5.3附近，需要升高到pH7。以下詳述兩種方式，pH調整和滲濾。后者似乎產物質量較高。
DE-FF2(A)用0.5M磷酸氫二鈉將SP-FF2流通液和淋洗液的pH調到pH7.0。在標準主動方式的條件下將此物質上樣于DEAE，上樣量為40g rHA.L-1介質，所上樣的樣品的pH和導電率分別是7.0和1.29mS.cm-1。
DE-FF2(B)SP-FF2流通液和淋洗液對10倍體積10mM磷酸鈉pH7.0滲濾，濃縮，用緩沖液稀釋到50g.L-1，再在標準主動方式條件下上樣于DEAE。所上樣品的pH和導電率分別是7.0和1.43mS.cm-1。
DE-FF2A/DE-FF2B的白蛋白適于用45-55mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗脫。
實施例7對經(jīng)低pH處理從rHA中去除鎳的動力學進行了研究(參見表9)。結果顯示在pH4-4.5，除鎳的速度和程度都與pH無關，但在pH5除鎳速度輕微放緩。當pH升至5-6.5之間時，除鎳的速度和程度都降低，當pH6.5以上時，很少或不能除鎳。
實施例8應用實施例1中詳述的純化程序，可以純化不耐寒(cryo-poor)血漿膏樣品(Centeon Pharma GmbH)中的人血清白蛋白。
每一層析步驟的HSA回收率明顯與同一步驟中rHA的預期回收率相當，PBA柱例外。此時，回收率比預期低很多，這可能是由于去除了糖化白蛋白。
實施例9本實施例舉例說明將高度純化的rHA濃縮，滲濾并配制成適當?shù)漠a品，本例中為20％(w/v)白蛋白。此步驟分兩步進行，即最終超濾(UF)和配制。
最終UF通過在低pH滲濾減少了鎳濃度，并用適當級別的水，使rHA處于限定的水環(huán)境中。
最終UF始于將DEAE流通液和淋洗液轉移至最終UF進液容器。如下所述，然后對白蛋白進行濃縮，滲濾并將pH調至7.0，然后再次濃縮。
如果DE-FF2以主動方式進行，除DEAE流通液和淋洗液之外，可使用DE-FF2洗脫液，或完全替代。
轉移DE-FF2流通液和淋洗液(或洗脫液，當DE-FF2以主動方式進行時)之后，含rHA的加工物質流(process stream)在配備了截留分子量10,000之纖維素膜的超濾系統(tǒng)中依次經(jīng)過初步濃縮，滲濾和再次濃縮。初始的濃縮步驟將rHA濃度提高到約100g.L-1，然后經(jīng)連續(xù)滲濾而迅速下降，這期間使rHA對至少5倍，優(yōu)選至少7倍滯留液體積的注射用水等價物滲濾，優(yōu)選用50mM鹽溶液去除氨。滲濾之后，將pH調整到7.0，再次濃縮使rHA濃度進一步提高到275-325g.L-1。UF結束后，將滯留液移至大批量產品配料容器中。
在最終UF進液容器中進行pH調整，代替對DEAE流通液和淋洗液的行PH調整，優(yōu)選在滲濾和再次濃縮之間。優(yōu)選用EX04調整滲濾滯留液到pH7±1.0。如果pH超過7.1，但保持≤8.5，可用EX05調低pH值。
配制步驟使rHA處于合適的化學環(huán)境和合適的濃度，以適于大量產品的除菌過濾和灌裝。對已轉移的最終UF滯留液進行分析以確定白蛋白，鈉和辛酸鹽的濃度。配制大批量制劑時考慮這些量，以及氯化鈉和辛酸鈉賦形劑原液的任何所需添加量，和相應級別水的添加量。最終白蛋白的濃度可以是150-250g.L-1，或235-265g.L-1，其中鈉濃度是130-160mM?？膳渲迫魏纹渌尚械陌椎鞍诐舛龋?，最小濃度至少為4％(w/v)，優(yōu)選4-25％(w/v)。在添加合適的常規(guī)可藥用賦形劑，例如，polysorbate 80或在美國藥典中規(guī)定可用于人白蛋白的那些，以及稀釋用水后可完成配制。
預計最終每克白蛋白含0.08mmoles辛酸鈉。產品是無菌的，無熱源的?？赡苡卸噙_1％的二聚體白蛋白，但是檢測不到更大的聚合物或凝集物。
實施例10本實施例中舉例說明了用于確定按本發(fā)明純化之白蛋白的純度的分析方法。除非聲明，否則所有檢測方法都是針對按照實施例1純化和按照實施例9配制的白蛋白。
rHA的糖基化對糖化蛋白的顯微分析表明按照本發(fā)明純化的rHA基本沒有被非酶的糖基化(糖化)作用修飾。顯微試驗通過用高碘酸鹽氧化AP的C-1羥基測定了糖化蛋白形成的穩(wěn)定的Amadori產物(AP)。由高碘酸鹽氧化釋放的甲醛，通過在氨中與乙酰丙酮反應轉化成載色物質，二乙?；涠谆拎?DDL)，可以加以定量。DDL然后通過比色測定。樣品檢測之前先用Pharmacia PD-10(G25 Sephadex)柱脫鹽，然后由Bradford方法重新定量樣品中的白蛋白，檢測到10mg白蛋白。采用果糖陽性對照，在Shimadzu UV 2101分光光度計上于412nm讀出吸收值。每摩爾己糖形成一摩爾Amadori產物。


樣品A-Q為美國、歐洲和日本的市售HSA產品(平均值＝0.49±0.20)。樣品R為根據(jù)本發(fā)明純化的rHA。
C-末端的分析重組蛋白質量控制的一個重要方面是預定第一次結構的構象和穩(wěn)定性。通過N-端測序和FAB質譜，對市售HSA和根據(jù)本發(fā)明純化的rHA的C-末端色氨酸肽進行分析，顯示存在一個截短的肽，其在HSA中缺少C-末端的亮氨酸。在市售HSA中檢測到Des-Leu C-末端色氨酸肽為約5-10％(未定量)，但在本發(fā)明的rHA中即使經(jīng)過30℃6個月也不能檢測到所述肽。經(jīng)過30℃12周在HSA中不能檢測到Des-Leu肽，與其他樣品相比，全長C-末端肽的峰值大大降低，表明可能有進一步C-末端降解。
這些結果指示依本發(fā)明方法純化的rHA有穩(wěn)定而全長羧基-末端，而市售HAS經(jīng)比較似乎是不均一的。
根據(jù)本發(fā)明制備的rHA的鎳離子含量測量儀器SIMAA 6000，Perkin Elmer FurnaceCTT(恒溫管)在232nm，2470℃檢測。
校驗此方法根據(jù)三點校驗(Perkin Elmer 18/30/60μg/L標準溶液)。校驗后，測定純水空白樣。測定空白樣并完成每一系列實驗后，測定對照標準樣(鎳標準樣20μg/L，Perkin Elmer指定標準)。
樣品準備每一試驗均為雙份測定的結果，對校驗和對照標準樣同樣如此。根據(jù)預計的鎳濃度，對樣品進行稀釋使鎳濃度落在校驗范圍之內。任何時候蛋白質濃度≥10％的樣品應至少按1∶5稀釋。稀釋使用純水。
樣品毛細管漂洗溶液2L純水與0.5ml Triton X100混合。每一實驗系列都有一個系統(tǒng)適用性實驗。
要求1.校驗的相關系數(shù)至少為0.99000。如果不是，需重復校驗一次。如果第二次仍不符合要求，必須進行錯誤分析。
2.用30μg/L標準樣測定的特征質量不能超過20pg/0.0044A-s理論值的20％。
特征質量m0分析物可產生1％吸收的皮克級的量。每1％吸收對應與0.0044A-s(安培秒)。

3.所測對照標準樣的濃度須落在可信區(qū)間(2s/3s標準)內。
計算測量儀按照下式計算結果A吸收度斜率標準曲線的斜率(線性回歸)V稀釋未使用修正因子。

培養(yǎng)基和長鏈脂肪酸的分析本發(fā)明白蛋白和市售HSA的脂肪酸圖譜，通過對游離脂肪酸的酸性溶劑提取和氣相色譜以C17:0的內標進行分析。本發(fā)明的白蛋白經(jīng)此方法未檢出異常脂肪酸，但rHA和HAS的脂肪酸圖譜有很大差異。正如預計的，兩者都顯示了大量的添加的穩(wěn)定劑，辛酸鹽(C8:0)。除此之外，市售HAS以顯著的C16:0，C16:1，C18:0，C18:1和C18:2為特征，而本發(fā)明的白蛋白主要包括C10:0和C12:0，偶見C14:0。進一步的實驗顯示rHA終產物中C10:0和C12:0的水平與純化方法后期所用辛酸中的這些污染物的水平相關。
優(yōu)選C18脂肪酸的整體水平?jīng)]有超過辛酸鹽水平的1.0％(摩爾/摩爾)，優(yōu)選不超過0.5％。而且，本發(fā)明的白蛋白中，C18:2，C18:3和C20脂肪酸一般是檢測不到的。在市售HSA中，每摩爾白蛋白通常有大約0.4摩爾的C18脂肪酸。在本發(fā)明的產物中，通常測不到C20脂肪酸，而且每摩爾白蛋白只有大約0.02摩爾C18脂肪酸。
SDS還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳本試驗如WO 96/37515所述進行。試驗顯示，本發(fā)明的rHA由一條多肽鏈組成，當用還原性試劑(β-巰基乙醇)處理時，它在SDS還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳上遷移為單一區(qū)帶(單體)，這表明白蛋白中單體至少占99.9％。
凝膠通透高壓液相色譜將根據(jù)本發(fā)明純化的白蛋白配制成25％w/v溶液，取25μl 10mg/ml的該溶液，注射至Shimadzu LC6A HPLC的TSK3000SWXL柱，檢測發(fā)現(xiàn)含有不到0.1％的白蛋白多聚體。此結果說明，本文所述配方對純化的白蛋白的多聚體/凝聚體含量沒有不利影響。
雙向凝膠電泳對根據(jù)本發(fā)明方法制備的白蛋白的2μg rHA采用Milllipore Investigator系統(tǒng)進行雙向電泳。第一向采用pH3-10的等電聚焦凝膠分離，接著在第二向上采用10％聚丙烯酰胺/SDS凝膠分離。用考馬斯亮藍使凝膠染色，只見到一個點，這指示只存在一種蛋白質。
甘露糖基化白蛋白/ConA檢測伴刀豆球蛋白A(Con A)與含α-D-吡喃型甘露糖基，α-D-吡喃型葡萄糖基和位阻相關殘基的分子結合。在Con A檢測中，采用重組人白蛋白(rHA)和/或人血清白蛋白(HAS)的Con A Sepharose(Pharmacia，批號17-0440-01)親和層析測定甘露糖基化白蛋白的含量。
重組人白蛋白(rHA)用145mM氯化鈉稀釋到5％(w/v)，接著與Con A稀釋液(200mM乙酸鈉，85mM氯化鈉，2mM氯化鎂，2mM氯化錳，2mM氯化鈣，pH5.5)1∶1混合。然后將100mg rHA上樣到平衡過的2ml Con ASepharose柱上，接著用Con A平衡緩沖液(100mM乙酸鈉，100mM氯化鈉，1mM氯化鎂，1mM氯化錳，1mM氯化鈣，pH5.5)淋洗(5×4ml)。柱用6ml ConA洗脫液(100mM乙酸鈉，100mM氯化鈉，0.5M甲基-α-D-甘露糖吡喃糖苷，pH5.5)洗脫。
Con A上樣物(稀釋到大約0.1mg.mL-1)和洗脫液(經(jīng)檢驗為純品)中的單體白蛋白通過GP.HALC用0-0.2mg.mL-1rHA標準曲線定量，洗脫液中回收的與Con A結合的白蛋白單體表示為上樣量的百分比。

表6通過此方法對Con A結合的rHA的去除。第1-4批來自pmt1突變體，第5批來自非突變株。(FT&W＝流通液和淋洗液)ConA結合的rHA進一步通過電噴射質譜分析(圖8)。這指示，除了conA結合rHA的數(shù)量減少了，其修飾程度也減小。
顏色分析在350nm，403nm和500nm下測量5％(w/v)終產品溶液在1cm比色皿中的吸光度，按照每克白蛋白/升每cm光路長度(即ABS.L.g-1.cm-1)計算吸光度。本發(fā)明的白蛋白有如下數(shù)據(jù)波長平均吸光度(n＝4批)(nm)(L.g-1.cm-1)350 5.75×10-3403 1.7×10-3500 0.4×10-3通常本發(fā)明的白蛋白在上述三種波長下吸光度分別不會超過8.0×10-3，3.0×10-3和0.75×10-3。
幾種市售HSA制品經(jīng)分析在這些波長下顯示更高的吸光度(見表7)。


表7現(xiàn)有技術HSA制品的吸光度(L.g-1.cm-1)內毒素藥物產品溶液于36.5-37.5℃用鱟阿米巴細胞裂解物在340nm進行動態(tài)濁度檢測，采用自動內毒素檢測系統(tǒng)(例如LAL 5000E)。用已知濃度的標準內毒素制品建立標準曲線，試驗中還包含陰性對照和插入了(spiked)已知量校準內毒素的待檢物溶液。反應混合物的濁度變化按時間檢測并進行l(wèi)og-log回歸。藥品中任何內毒素都按標準曲線定量并且證實內毒素增量(spike)的回收。未檢測到內毒素。
自由硫醇Ellman’s試劑，5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是檢測游離巰基(sulfydryl)如cys-SH(rHA中Cys-殘基34)的具體方法。該反應釋放出5-硫-2-硝基苯甲酸根TNB2-，它在412nm有最大吸收。通過測量在412nm吸收度的增長并除以TNB2-基團在412nm的摩爾消光系數(shù)，可以計算出rHA的自由巰基含量。

權利要求
1.用于降低白蛋白溶液中鎳離子水平的方法，此方法包括將白蛋白溶液置于pH2.5-7.5，優(yōu)選pH4.0-pH6.0，和除去鎳離子。
2.權利要求1的方法，其中該方法包括滲濾或凝膠通透層析。
3.權利要求1或2的方法，其中所述白蛋白是重組白蛋白。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述起始白蛋白溶液源自酵母培養(yǎng)基，所述酵母培養(yǎng)基是在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)白蛋白編碼核苷酸序列轉化的酵母而獲得的，其中所述酵母表達白蛋白并將其分泌到培養(yǎng)基中。
5.權利要求4的方法，其中所述酵母屬于糖酵母屬，優(yōu)選釀酒酵母。
6.權利要求4的方法，其中所述酵母屬于畢赤酵母屬或克魯維酵母屬。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中至少某些白蛋白是用生產重組白蛋白的方法生產的，此方法包括培養(yǎng)能表達重組白蛋白編碼序列的真菌細胞并獲得所述白蛋白，其中所述細胞帶一種基因修飾，該修飾能使該細胞對重組表達之白蛋白實施甘露糖基化的能力至少降低，其中培養(yǎng)基為至少1,000L且pH5.3-6.8。
8.權利要求7的方法，其中所述修飾包括任何抑制，取代，缺失，添加，破壞和/或突變型插入。
9.權利要求8的方法，其中所述修飾是穩(wěn)定遺傳的和/或是非回復的和/或是非滲漏的。
10.權利要求7至9中任一項的方法，其中所述修飾位于基因編碼區(qū)或與基因表達有關的區(qū)域。
11.權利要求10的方法，其中所述基因是PMT基因，優(yōu)選PMTl。
12.權利要求7至11中任一項的方法，其中所述真菌細胞在至少5,000L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選至少7,500L的培養(yǎng)基。
13.權利要求7至12中任一項的方法，其中所述真菌細胞在pH6.2-6.7培養(yǎng)，優(yōu)選pH6.3-6.5。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中將所述白蛋白產物配制成非腸道給藥至人的制劑，滅菌或放置于最后容器中。
15.包括重組白蛋白編碼序列的DNA序列，質?；蚣毎?，其中所述重組白蛋白編碼序列的3’端包括兩個或多個框架內翻譯終止密碼子，優(yōu)選三個框架內翻譯終止密碼子。
16.權利要求1至6中任一項的方法，其中至少部分白蛋白是由權利要求15的細胞生產的。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備高純度白蛋白溶液的方法，該方法包括對白蛋白(優(yōu)選由轉化的酵母表達和分泌的)進行一系列層析步驟。優(yōu)選此方法包括主動方式陽離子交換層析，主動方式陰離子交換層析，主動方式親和層析，被動方式親和層析(優(yōu)選使用固相化氨基苯硼酸)，被動方式陽離子交換層析，和被動或主動方式陰離子交換層析。本發(fā)明還公開了用于降低白蛋白溶液中鎳的水平的方法，以及一種重組白蛋白編碼序列，其含有兩個或多個位于同一讀碼框架內的翻譯終止密碼子。本發(fā)明還公開了產生重組白蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)能表達重組白蛋白編碼序列的真菌細胞，其中所述細胞使重組表達的白蛋白發(fā)生甘露糖基化的能力降低。
文檔編號C12P21/02GK1810834SQ200510108658
公開日2006年8月2日 申請日期2000年1月31日 優(yōu)先權日1999年1月30日
發(fā)明者亨德里克·范厄克, 戴維·J·米德, 菲利普·H·莫頓, 安德魯·J·卡特賴特, 賈森·卡梅倫, 戴維·J·巴蘭斯, 米歇爾·G·J·格蘭德喬治, 斯蒂芬·貝雷曾科, 約翰·R·伍德羅, 達雷爾·斯利普, 讓-盧克·B·維倫 申請人:達爾塔生物技術有限公司