專利名稱：抗棉花枯、黃萎病蛋白質(zhì)bs2的分離純化及其基因bs2的克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗棉花枯萎病、黃萎病的枯草芽孢桿菌B111，來源于該菌的BS2蛋白及其相關(guān)BS2基因序列。該菌及其BS2蛋白對(duì)棉花黃萎病菌和枯萎病的生長具有一定抑制作用。該BS2蛋白可用于生物農(nóng)藥或生防制劑的研究。該BS2基因可用于轉(zhuǎn)基因棉花抗病性表達(dá)研究。
背景技術(shù)：
植物病害是世界糧食減產(chǎn)主要原因之一，每年在農(nóng)作物生產(chǎn)中造成10％～15％的產(chǎn)量損失，棉花損失為12％左右(Hainr and P.H.Schireier，Journal of.Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer，(special issue)，49(67)25-120，1996)。其中植物真菌病害位于植物四大病害(真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲(鄭秀芳等，甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)，13(1)63-66，2002))之首，占植物病害總數(shù)的80％以上(羅閆良等，生物學(xué)雜志，(6)6-8，1994)。而被稱為棉花的兩大“癌癥”的枯萎病和黃萎病是棉花生產(chǎn)最重要病害之一。尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)侵染引起的棉花枯萎病是棉花的主要病害之一，對(duì)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)造成極大影響。同時(shí)由黑白輪枝菌、大麗輪枝菌浸染后引起的棉花黃萎病(Verticillium dahliaeKleb)是繼枯萎病之后人們發(fā)現(xiàn)的又一重要棉花病害，廣泛分布于世界各產(chǎn)棉國。我國棉花黃萎病自1935年由引進(jìn)美國棉花品種而傳入，近10年來，棉花黃萎病發(fā)生日趨嚴(yán)重，重病地棉花減產(chǎn)60％～70％，有的甚至絕收，已嚴(yán)重阻礙了我國棉花生產(chǎn)的發(fā)展(房衛(wèi)平等，河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，(1)7-9，1998；李培夫，新疆農(nóng)墾科技，(2)12-13，1998)。特別是近年出現(xiàn)了類似于美國T9落葉型強(qiáng)致病黃萎病菌，對(duì)我國棉花黃萎病危害更為嚴(yán)重，不僅流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，而且損失更加嚴(yán)重。棉花落葉型黃萎病成為繼蟲害之后影響我國棉花獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙和棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要問題之一。因此，必須盡快選育抗落葉型黃萎病、枯萎病棉花品種，控制蔓延、阻止延緩病菌的變異，防止枯萎病、黃萎病大規(guī)模流行，避免對(duì)我國棉花生產(chǎn)帶來災(zāi)難性的損失。
本發(fā)明從中藥白豆蔻中分離到一株細(xì)菌，命名為B111。平板拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該菌能強(qiáng)烈抑制黃萎病及枯萎病的生長。通過生理生化試驗(yàn)及16S rRNA鑒定結(jié)果確定B111屬于枯草芽孢桿菌。對(duì)該菌的胞外發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，并結(jié)合平板拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌分泌的一種蛋白(命名為BS2)對(duì)落葉型黃萎病菌V991和E.coli的生長均有抑制作用，對(duì)畢赤酵母無影響。同時(shí)對(duì)枯萎病Ag226的生長也有一定的抑制作用。利用聯(lián)機(jī)反相毛細(xì)管柱液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜CapLC-ESI-MS-MS獲得BS2蛋白的五條多肽的氨基酸序列，二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示在該蛋白與芽孢桿菌中性蛋白酶(BacillolysinEC 3.4.24.28)同源性較高，可能為一種新的芽孢桿菌中性蛋白酶。根據(jù)所測(cè)氨基酸測(cè)序結(jié)果及其同源序列設(shè)計(jì)引物，獲得了BS2蛋白1.9kb的全基因序列。
經(jīng)檢索目前還沒有關(guān)于枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對(duì)真菌具有抗性的報(bào)到。但陳云等人(陳云等，功能高分子學(xué)報(bào)，12(3)293-296，1999)報(bào)道了中性蛋白酶能非特異性的水解殼聚糖并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行了研究。殼聚糖廣泛存在于真菌中，是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分。這可能就是抗菌蛋白BS2能抑制黃萎病菌生長的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種防治棉花枯萎病、黃萎病的菌株Bacillussubtilis B111(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)CGMMCC No.1497；保藏日期2005年10月18日；分類命名枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種來源于枯草芽孢桿菌B111的與棉花枯萎病、黃萎病相關(guān)的基因BS2基因。
本發(fā)明提供的BS2基因，是下列核酸列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼具有抗棉花枯萎病、黃萎病功能的蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID NO1由1908個(gè)堿基組成。該基因的讀碼框?yàn)镾EQ ID NO1自5’端第254位到第1819位堿基。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種由抗棉花枯萎病、黃萎病相關(guān)的BS2基因編碼的具有抗菌功能的蛋白質(zhì)，是序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列，或?qū)EQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列SEQ ID NO2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO2是由521個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
可以將本發(fā)明的BS2基因?qū)朊藁ǖ戎参镏校云讷@得對(duì)枯萎病、黃萎病具有抗性的轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是抗棉花枯萎病、黃萎病的植物品種，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明附圖表說明

圖1QAE sephadex A50強(qiáng)陰離子交換柱洗脫曲線。
圖2SDS-PAGE蛋白電泳圖。圖中1、2、3、4分別代表B111的蛋白粗提液、B111的發(fā)酵原液，洗脫峰1收集液、洗脫峰2(即BS2蛋白)收集液。
圖3牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)圖。(A)枯草芽孢桿菌B111對(duì)落葉型黃萎病V991的抑制作用；(B)用90％硫酸銨沉淀B111發(fā)酵液后的粗提蛋白對(duì)黃萎病V991的抑制作用；(C)洗脫峰1收集液對(duì)黃萎病V991的抑制作用；(D)洗脫峰2(即BS2)收集液對(duì)黃萎病V991的抑制作用。
圖4利用MALDI-TOF-MS測(cè)定的BS2蛋白的分子量。
圖5采用MALDI-TOF-MS測(cè)定的BS2蛋白的肽指紋圖譜(PFM)。
圖6金屬離子激活實(shí)驗(yàn)圖。(A)BS2蛋白緩沖液(20mmol/LTris-HCl，pH 7.0)中未加鋅離子的抑菌效果；(B)BS2蛋白緩沖液中添加鋅離子后(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L Zn2+，pH 7.0)的抑菌效果。
圖7根據(jù)氨基酸測(cè)序結(jié)果及其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增到了BS2蛋白對(duì)應(yīng)的729bp的核酸序列(泳道1)。
圖8根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物，獲得了BS2基因的全長DNA序列1908bp(泳道1)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1抗菌蛋白BS2的分離純化1枯草芽孢桿菌B111的培養(yǎng)及發(fā)酵液的處理將枯草芽孢桿菌B111接種到滅菌的LB培養(yǎng)基(酵母粉5g/l，酸水解酪素25g/l，NaCl10g/l，pH7.0)中，37℃，250rmp，培養(yǎng)24h后，將拮抗菌B111發(fā)酵液置于離心瓶中，4℃、12000rpm離心20分鐘，棄取沉淀，保留上清。
體I2抗菌蛋白BS2的分離、純化采用分子截流量為20KD的超濾器對(duì)枯草芽孢桿菌B111發(fā)酵液上清進(jìn)行濃縮。根據(jù)濃縮后發(fā)酵液的體積稱取一定量的硫酸銨(鹽終濃度達(dá)到90％)，在加入前須將硫酸銨用研缽研成粉狀，在4℃下緩慢加入到離心后的濃縮發(fā)酵液中，邊加邊攪拌，緩慢進(jìn)行，避免局部濃度過高，造成蛋白質(zhì)沉淀不均勻。攪拌2小時(shí)后，將其置于4℃冰箱中沉淀過夜。次日將粗提液于4℃、15000rpm離心40分鐘，保留沉淀，棄取上清。然后用少量緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)溶解沉淀，再置于透析帶(10mm，MWCO 1000Da)中24h，進(jìn)行脫鹽處理(先用純水透析2小時(shí)，再換用同樣緩沖液透析)。透析完畢后，取20ul進(jìn)行電泳驗(yàn)證提取效果，并取適量進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。采用強(qiáng)陰離子交換柱(填料QAEsephadexA50；柱型0.9×30cm；洗脫液溶液A20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，溶液B1mol/LNaCl，pH7.0)對(duì)蛋白粗提液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫(pH不變，增加洗脫液離子強(qiáng)度)，洗脫流速為1ml/min，檢測(cè)波長為280nm。分別收集每個(gè)洗脫峰的洗脫液，注意收集過程在4℃條件下進(jìn)行。經(jīng)梯度洗脫共獲得兩個(gè)洗脫峰(圖1)，將每個(gè)洗脫峰的洗脫液分別置于透析帶(10mm，MWCO 1000Da)中24h，進(jìn)行脫鹽處理(先用純水透析2小時(shí)，再換用同樣緩沖液即溶液A中透析)。最后采用PEG20000對(duì)每個(gè)透析帶(10mm，MWCO 1000Da)中的液體進(jìn)行濃縮。采用分離膠為15％的SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度(圖2)。
實(shí)施例2抑菌活性鑒定1落葉型棉花黃萎病菌V991的培養(yǎng)取適量斜面上的V991置于200ul的無菌水中，制成孢子懸液均勻涂在Czapek’s平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)5天。再將10ml無菌水加到平板上，混勻后將該高濃度孢子懸液加到100ml無菌水中，制成OD595＝0.795的孢子懸液，按每管1ml分裝后存于4℃?zhèn)溆谩?br> 2抑菌活性的檢測(cè)取200μl配好的V991孢子懸液均勻涂抹在Czapek’s(KNO31.36g/L，NaCl 1.38g/L，KH2PO4lg/L，F(xiàn)eSO40.02g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉15g/L)平板培養(yǎng)皿(直徑90cm)中，并在平板中等距離放置牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入100μl蛋白樣品，對(duì)照組則加入100μl緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)。置于28℃培養(yǎng)，第二天樣品吸收后取出牛津杯，繼續(xù)在28℃培養(yǎng)4天觀察加有蛋白質(zhì)樣品和對(duì)照的棉花黃萎病菌的生長情況(圖3)。抑菌試驗(yàn)證明洗脫峰2的收集液能抑制落葉型黃萎病V991的生長，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示洗脫峰2為單一蛋白，分子量約為36kD。因此初步認(rèn)為該蛋白即為抑菌蛋白，命名為BS2。
實(shí)施例3抗菌蛋白BS2的鑒定利用MALDI-TOF-MS測(cè)定了BS2蛋白的分子量及其肽指紋圖譜(PFM)(圖4、5)。測(cè)定的BS2分子量為32048.979Da。同時(shí)采用聯(lián)機(jī)反相毛細(xì)管柱液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜CapLC-ESI-MS-MS獲得BS2蛋白的五條多肽的氨基酸序列(表1)，利用Mascot在二級(jí)質(zhì)譜庫中獲得有意義的搜索，結(jié)果顯示該蛋白與兩個(gè)蛋白質(zhì)(水解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶前體HYBSN gi|67706和芽孢桿菌B16中性蛋白酶前體bael6 AAV30844 gi|54126578)具有同源這兩個(gè)同源性蛋白都屬于芽孢桿菌中性蛋白酶，且這兩個(gè)同源性蛋白之間同源性高達(dá)89％。同時(shí)所測(cè)得的5條多肽的氨基酸序列都位于同源蛋白的成熟蛋白區(qū)域。此外，BS2蛋白分子量也與該類芽孢桿菌中性蛋白酶的成熟蛋白分子量基本相符，都約為32-33kD。因此推斷BS2可能是一種新的芽孢桿菌中性蛋白酶。
表1BS2測(cè)序結(jié)果與同源序列的比較

實(shí)施例4抗菌蛋白BS2抑菌活性的激活對(duì)芽孢桿菌中性蛋白酶的性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)(Bacillolysin EC 3.4.24.28)，該類酶為金屬蛋白酶，它有兩種金屬離子結(jié)合位點(diǎn)即三個(gè)鋅離子和一個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，其反應(yīng)特性類似于嗜熱菌蛋白酶。而鋅離子與嗜熱菌蛋白酶的酶活性有關(guān)，鈣離子與酶的穩(wěn)定性有關(guān)。因此可能由于純化過程中丟失了必需的金屬離子導(dǎo)致酶活性較蛋白粗提物有所降低。因而分別在蛋白緩沖液中添加了鋅離子和鈣離子，使金屬離子終濃度達(dá)到2mmol/L，再進(jìn)行抑菌試驗(yàn)測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果顯示鈣離子對(duì)BS2蛋白抑菌活性沒有明顯激活作用，而鋅離子對(duì)該蛋白的抑菌活性有一定激活作用(圖6)。
實(shí)施例5BS2基因的克隆1從測(cè)序所得氨基酸序列中選取最靠近N-端和C-端的兩段序列(TVSLNISSE和KAEQIYYR)作為特異引物，設(shè)計(jì)引物F15’-ACGG TCTCATTAAATAATTCTTCTGAA-3’，R15’-ACGATAGTAAATCTGCTCCGCTTT-3’，以B111基因組DNA為模板進(jìn)行PCR(圖7)，獲得了約700bp左右的核酸片段。從引物F1編碼的第一個(gè)氨基酸T(235位)到引物2編碼的最后一個(gè)氨基酸R(477位)之間應(yīng)包含243個(gè)氨基酸序，對(duì)應(yīng)的DNA序列應(yīng)為729bp.對(duì)PCR結(jié)果測(cè)序顯示與預(yù)計(jì)相符，該片段長度為729bp。將該序列根據(jù)細(xì)菌偏好密碼子翻譯成氨基酸序列，其氨基酸序列的理論酶切圖譜與BS2肽指紋圖譜PMF高度吻合，則認(rèn)為已經(jīng)獲得抗菌蛋白基因的部分序列。
2此后根據(jù)已知的同源序列水解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶前體HYBSN gi|67706設(shè)計(jì)同源引物，F(xiàn)25′-GATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTT---3′；R25′-CGGGAA AAGACATATATCATCATGGT-3’，獲得了編碼該蛋白的BS2基因的全長序列1908bp(圖8)。該序列的開放閱讀框自5’端第254位到第1819位堿基。共編碼521個(gè)氨基酸，其中與同源序列比較可預(yù)測(cè)1-27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，28-221位氨基酸位前體肽，222-521位氨基酸為成熟蛋白區(qū)域即芽孢桿菌中性蛋白酶。
權(quán)利要求
1.一種防治棉花枯萎病、黃萎病的菌株，其特征在于該菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B111菌株CGMMCC No.1497。
2.一種來源于枯草芽孢桿菌B111的抗枯萎病、黃萎病菌的BS2基因，是下列核酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼具有抗棉花枯萎病、黃萎病功能的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.一種來源于枯草芽孢桿菌B111的抗枯萎病、黃萎病菌的BS2蛋白，是氨基酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)與序列表中SEQ ID NO2限定的氨基酸序列具有90％以上同源性，且具有抗棉花枯萎病、黃萎病功能的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗枯萎病、黃萎病菌的BS2基因，其特征在于所述基因?yàn)樾蛄斜碇械腟EQ ID NO1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗枯萎病、黃萎病菌的BS2基因，其特征在于所述基因?yàn)榫幋a枯草芽孢桿菌B111分泌的抗枯萎病、黃萎病的BS2蛋白的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或?qū)EQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列SEQ ID NO2衍生的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第254位到第1819位堿基。
8.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
9.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1所述基因在培養(yǎng)抗病植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從枯草芽孢桿菌B111發(fā)酵液分離純化到了一種抗棉花枯萎病、黃萎病的BS2蛋白。初步功能鑒定結(jié)果表明該蛋白對(duì)棉花黃萎病，枯萎病和E.coli的生長均有一定抑制作用。經(jīng)鑒定該蛋白屬于枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，同時(shí)從枯草芽孢桿菌B111基因組中克隆到了該蛋白的BS2基因序列。該蛋白可進(jìn)一步用于棉花枯萎病、黃萎病生防制劑的研制，及該基因可用于轉(zhuǎn)基因抗枯萎病、黃萎病棉花的研究。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1888052SQ200510109118
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者郭三堆, 白瑋, 張銳 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 郭三堆