專利名稱：水稻葉片外卷基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域。更特別的，本發(fā)明涉及新的水稻葉片外卷基因RG及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及使水稻葉片發(fā)生外卷從而提高水稻產(chǎn)量的方法。本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法。本發(fā)明的外卷基因還可作為基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記和雜交制種過程中真雜種的指示標(biāo)記。
背景技術(shù)：
水稻是我國的主要糧食作物，全國有60％以上的人口以稻米為主食。為確保糧食安全，我國于1996年啟動(dòng)了超級(jí)稻發(fā)展計(jì)劃。要獲得高產(chǎn)，前提是增加籽粒的數(shù)量和重量。由于葉片是水稻進(jìn)行光合作用的主要器官，其形狀和角度直接影響到個(gè)體和群體的光合作用效率，對(duì)提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)有著重要的作用。
卷葉是有用的農(nóng)藝性狀，是理想株形的重要組成部分，卷葉對(duì)葉片的挺直有直接作用。直立的葉片，除正面受光外，背面還吸收散射光和其他葉片的反射光，在光強(qiáng)和葉面積相同條件下，直立葉片有利于提高光合效率；而且，通過改善群體的通風(fēng)透光性，還可減少發(fā)病機(jī)會(huì)，因此，通過選擇卷葉性狀，來增強(qiáng)葉片直立，改善群體透光性，在育種上已經(jīng)廣泛受到重視。
最新的高產(chǎn)株形研究成果關(guān)于葉片特點(diǎn)的描述提出葉片卷曲的觀點(diǎn)葉片上舉、卷曲、直立、比葉重大，葉綠素含量高。有研究表明，葉片卷曲具有使葉片挺直、葉基角較小、葉綠素含量增加、葉面積指數(shù)增大、消光系數(shù)降低等有利于充分利用光能的效應(yīng)。因此，這一性狀受到許多水稻遺傳育種工作者的關(guān)注，并廣泛地開展了工作，希望將此性狀引入水稻品種中，構(gòu)建出理想的株形，實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量新的突破。
因此，目前迫切需要開發(fā)研究一種理想的水稻卷葉植株，以改善水稻的光合效率，從而提高水稻的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻葉片外卷基因。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的RG蛋白，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有葉片外卷功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組(i)編碼所述的RG蛋白的多核苷酸；(ii)與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸還包括驅(qū)動(dòng)該基因表達(dá)的上游啟動(dòng)子區(qū)序列。
在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸選自下組(1)SEQ ID NO1中1-909位所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO1中173-520位所示的核苷酸序列；或(3)SEQ ID NO8中1-1021位所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有本發(fā)明上述的多核苷酸。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，如水稻細(xì)胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種使水稻葉片發(fā)生外卷的方法，該方法包括增加所述水稻中RG基因或其同源基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，通過插入T-DNA序列或用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)該RG基因或其同源基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種改良水稻的方法，它包括步驟(a)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明上述的RG蛋白的DNA編碼序列(包括cDNA序列或基因組序列)；(b)將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該RG蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上；(c)選擇出轉(zhuǎn)入所述RG蛋白DNA編碼序列的水稻細(xì)胞或組織；(d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織再生成水稻植株。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種DNA分子的用途，所述的DNA分子編碼序列如SEQ ID NO2所示的蛋白，所述的DNA分子用于制備促進(jìn)葉片外卷的水稻。


圖1顯示了外卷突變體(BY240)和中花11葉片照片。
圖2顯示了外卷突變體(BY240)的Southern雜交。以Ds片段為探針與HindIII酶切后的中花11、BY240葉片總DNA和pDsBar1300質(zhì)粒DNA進(jìn)行Southern雜交，BY240和pDsBar1300質(zhì)粒存在雜交條帶，中花11無雜交條帶。
圖3顯示了外卷突變體(BY240)T-DNA插入的染色體位置，其中，箭頭表示T-DNA插入位點(diǎn)。
圖4顯示了RG基因的表達(dá)。其中，泳道1ZH11成熟葉；泳道2ZH11成熟葉鞘；泳道3ZH11幼穗；泳道4ZH11成熟莖；泳道5BY240成熟葉；泳道6BY240成熟葉鞘泳道7BY240幼穗；泳道8BY240成熟莖。
圖5顯示了RG基因的相關(guān)工程質(zhì)粒pUN-RGCO。其中，LB和RB為T-DNA左邊界和右邊界，Hyg為抗潮霉素抗性基因，35S和Ubi為35S和Ubi啟動(dòng)子，RGcDNA為RG基因的cDNA，Nos polyA為Nos終止子。
圖6顯示了RG基因的轉(zhuǎn)基因植株照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首先發(fā)現(xiàn)了由T-DNA插入導(dǎo)致葉片發(fā)生向外翻卷的水稻突變植株；克隆了與葉片發(fā)生外卷相關(guān)的基因(RG)。試驗(yàn)證實(shí)，RG基因的高表達(dá)可使水稻葉片發(fā)生外卷。因而，RG基因可作為在水稻的分子育種中促進(jìn)葉片的外卷。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人通過T-DNA標(biāo)簽的方法，在T-DNA插入的轉(zhuǎn)基因后代群體中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葉片發(fā)生向外卷的突變體；通過外卷純合突變體與原品種中花11號(hào)雜交的F2群體分析，發(fā)現(xiàn)外卷突變與插入的T-DNA(含抗除草劑基因)存在著共分離；外卷突變體的Southern雜交分析證明，該突變體的T-DNA插入為單拷貝插入；利用PCR技術(shù)，獲得了T-DNA插入位點(diǎn)左右端旁鄰序列，并通過插入位點(diǎn)旁鄰序列的Blast分析，確定該T-DNA插入在水稻4號(hào)染色體上一個(gè)基因(本發(fā)明中命名為RG基因，中文全稱為水稻葉外卷基因，英文全稱為Revolute Gene)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游位置；RG基因的基因組序列全長為1021bp，其中1-147為第一外顯子，148-259為第一內(nèi)含子，260-1021為第二外顯子。
RG基因的全長cDNA為909bp(SEQ ID NO1)，其中ORF位于173-520位，編碼一個(gè)116個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人還利用RT-PCR技術(shù)，比較了RG基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變體的RG基因與中花11的RG基因相比在表達(dá)上存在極大上調(diào)的現(xiàn)象；通過構(gòu)建RG基因的相關(guān)工程質(zhì)粒和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，在中花11號(hào)的轉(zhuǎn)基因后代中，獲得了具有葉片外卷的轉(zhuǎn)基因植株；經(jīng)PCR鑒定，外卷植株都存在RG基因工程質(zhì)粒的相關(guān)片段，在種植的部分T2后代中，觀察到存在外卷葉和正常葉植株的分離。這些試驗(yàn)證明，RG基因的表達(dá)可使水稻葉片發(fā)生外卷。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的RG蛋白或多肽”是指RG蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化RG蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括RG蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然RG蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RG蛋白”指具有RG蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與RG蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括RG蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與RG蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗RG蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含RG蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了RG蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有RG蛋白序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供RG蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然RG蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“RG蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明RG蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1或SEQ IDNO8所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1或SEQID NO8所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼RG蛋白的多聚核苷酸。
應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的RG基因優(yōu)選得自水稻，但是得自其它植物的與水稻RG基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。
本發(fā)明的RG蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或RG蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的RG蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼RG蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，RG蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含RG蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得葉片形狀發(fā)生改變的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的RG蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)筊G蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組RG蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價(jià)值的能抑制或刺激RG蛋白功能的多肽分子。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用RG蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)RG蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及一種使水稻葉片發(fā)生外卷的方法，該方法包括增加所述植物中RG基因或其同源基因的表達(dá)。增加RG基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如?？赏ㄟ^插入T-DNA序列或用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)該RG基因或其同源基因的表達(dá)。或者通過增強(qiáng)子(如水稻waxy基因第一內(nèi)含子、Actin基因第一內(nèi)含子等)來增強(qiáng)該RG基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明方法的強(qiáng)啟動(dòng)子包括35s啟動(dòng)子、水稻、玉米的Ubi啟動(dòng)子等。
本發(fā)明還涉及一種改良水稻的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有RG蛋白DNA編碼序列；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該RG蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入所述RG蛋白DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織；和(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織再生成植株。
其中，可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施此方法。
本發(fā)明測(cè)量葉片外卷性狀可用到以下指標(biāo)“卷曲度LRI”、“挺直度LEI”和“披垂度DAL”，它們分別按下式計(jì)算在開花期，葉片自然卷曲(指外卷)后，測(cè)定最寬處葉緣間距離(Ln)，然后把葉片展開測(cè)量其寬度(Lw)；在開花20天后，葉片發(fā)生自然彎曲，測(cè)定葉枕到葉尖的直線距離(LNL)及葉片挺直時(shí)的長度(LEL)，同時(shí)測(cè)定葉片自然彎曲后的葉片與莖的夾角(BAL)，葉枕到葉尖的連線與莖的夾角(AL)。
葉片卷曲度(Leaf rolling index，LRI)(％)＝(Lw-Ln)/Lw×100葉片挺直度(erecting index，LEI)＝LNL/LEL×100葉披垂度(drooping angle of leaf，DAL)＝AL-BAL此外，本發(fā)明還涉及利用葉片外卷性狀作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記。此外，還可利用該基因的葉片外卷特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標(biāo)記。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1)首次分離得到一種新的水稻葉片外卷基因，該基因的高表達(dá)使得水稻葉片外卷，從而增加葉片的挺直度從而增加葉片受光面積、使中下層葉片能受到較多的光照。并且，在密植狀態(tài)下通過使葉片外卷也可改善群體的通風(fēng)透光性，減少發(fā)病機(jī)會(huì)。
(2)可利用葉片外卷性狀作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記。
(3)可利用本發(fā)明的基因?qū)е碌娜~片外卷特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標(biāo)記。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1995)或植物分子生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
I.通用的材料與方法本發(fā)明具體實(shí)施方式
中使用到以下的材料和方法。
一.材料本發(fā)明使用的是常見的粳稻“中花11”(Oryza sativa L.subsp.Japonica CVZhonghua No.11)進(jìn)行研究。但應(yīng)理解，也可使用其它種類進(jìn)行研究。
二.水稻葉片總DNA簡易抽提法1.取2cm長的水稻幼嫩葉片，于1.5ml管中，加入200μl TPS抽提液，1ml tip將葉片搗碎。
2.搗碎的葉片放入75℃水浴中溫浴20min。
3.12000g×5min離心。
4.取120μl上清于0.5ml tube中加入120μl異丙醇室溫5min，12000g×10min離心。
5.去上清，加入120μl-300μ1 70％乙醇洗滌，12000g×5min離心。
6.去上清，干燥沉淀，加入30μl水(TE)溶解，PCR時(shí)取0.8-1.0μl(10μl PCR體系)做模板。
試劑TPS100mM Tris-Cl(pH＝8.0)10mM EDTA(pH＝8.0)1M KCl三.TAIL-PCRTAIL-PCR依照Liu等敘述的方法(見Plant Molecμlar Biology Reporter 16175-181，1998)。T-DNA左端嵌套引物序列是T-DNA-1CAAAATCCAGTACTAAAATCCAGA；(SEQ ID NO5)T-DNA-3ATTCGGCGTTAATTCAGTACA；(SEQ ID NO6)和T-DNA-5GTGTTATTAAGTTGTCTAAGC(SEQ ID NO7)。
這三個(gè)引物分別與5個(gè)隨機(jī)的簡并引物ADl-AD5當(dāng)中的一個(gè)配對(duì)組合進(jìn)行PCR，擴(kuò)增T-DNA左端的旁臨序列。TAIL-PCR產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行分析。TAIL-PCR的產(chǎn)物直接送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
四.凍融法將質(zhì)粒(例如，pUN-RGCO質(zhì)粒)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌1.根癌農(nóng)桿菌YEB(成分見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)(無抗生素)固體平板挑單菌落。5ml YEB液體培養(yǎng)基28℃ 200rpm培養(yǎng)過夜。按1％接種量轉(zhuǎn)入50mlYEB(500μl菌液加入)，28℃ 200rpm培養(yǎng)3-4小時(shí)至細(xì)菌對(duì)數(shù)期。
2.4℃ 5000g離心10min，沉淀用5ml預(yù)冷的TE(Ph7.5)洗滌一次，加入5mlYEB液體(含10～15％甘油)重新懸浮。分裝成200μl一管，液氮速凍后，于-70度保存。
3.取200μl菌液+0.5-1.0ug質(zhì)粒(＜10μl)混勻，依次在冰上、液氮、37℃水浴各放置5min，用YEB稀釋至1ml后，于28℃振搖培養(yǎng)2-4hr。
4.取200μl菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基平板上，28℃2-3天。
5.挑單菌落，重新在相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基平板上劃單菌落兩次。
五.水稻材料的培養(yǎng)A.愈傷組織的誘導(dǎo)取授粉后12-15天的水稻未成熟種子經(jīng)70％乙醇浸泡1分鐘后，于2％的NaClO溶液中(加2-3滴吐溫20)消毒60分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和攝子挑出幼胚并接種于N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。
B.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和懸浮從YEB平板上挑取單菌落農(nóng)桿菌接種到3ml含50mg/L卡那霉素(Km)的YEB液體培養(yǎng)基中于28℃振搖培養(yǎng)過夜，第2天按1％接種量轉(zhuǎn)接入50ml含Km50mg/L的AB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD600為0.8左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于6000g 4℃離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養(yǎng)基中，此時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。
C.感染和共培養(yǎng)于6cm培養(yǎng)皿中將各種水稻受體材料浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時(shí)搖動(dòng)，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C培養(yǎng)基上，于26℃共培養(yǎng)3天。在轉(zhuǎn)化材料轉(zhuǎn)入前，事先在N6D2C培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙，并用少量新鮮AAM液體培養(yǎng)基濕潤。共培養(yǎng)3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出轉(zhuǎn)化材料，用無菌濾紙吸干菌液和水分，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。
D.愈傷組織的篩選、分化與移栽預(yù)培養(yǎng)4天的幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，切去胚芽并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基N6D2S1進(jìn)行選擇培養(yǎng)，2周后從幼胚盾片處長出的愈傷組織分成小塊轉(zhuǎn)到N6D2S2選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選2代(2周/代)，6周后生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基MSRCH上分化(12小時(shí)光照/天)；再生的小苗在1/2MSENH上生根壯苗，隨后移入網(wǎng)室或人工氣候室盆土栽培。
試劑各基礎(chǔ)培養(yǎng)基大量鹽份(20x)g/L

*獨(dú)立溶解后加入。
各基礎(chǔ)培養(yǎng)基微量鹽份(100x)mg/L

1.N6D2培養(yǎng)基1)1X大量鹽份；2)1X微量鹽份3)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
4)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L5)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L植物凝膠(phytagel，Sigma公司)，pH5.8。
2.AB液體培養(yǎng)基K2HPO43g/L；Na2H2PO41g/L；NH4Cl 1g/L；MgSO4·7H2O 300mg/L；KCl150mg/L；CaCl210mg/L；FeSO4·7H2O 2.5mg/L；葡萄糖5g/L，pH7.0。
3.AAM液體培養(yǎng)基1)1 X AA大量鹽分；1 X AA微量鹽分；2)氨基酸L-Gln 880mg/L；L-Asp 270mg/L；L-Arg 230mg/L；L-Gly 80mg/L3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，PH5.24.N6D2CN6D2，葡萄糖10g/L，乙酰丁香酮20mg/L(56℃加入)。
5.N6D2S1N6D2，25mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L頭孢霉素。
6.N6D2S2N6D2，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L頭孢霉素。
7.MSRCH1)1 X MS大量鹽分，1 X MS微量鹽分，2)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L； Na2-EDTA 37.3mg/L；
3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)6-芐基氨基嘌呤(6BA)2mg/L，荼乙酸(NAA)0.2mg/L，玉米素(Zeatin)05mg/L，激動(dòng)素(KT)0.5mg/L，5)蔗糖30g/L，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，phytagel(Sigma公司)2.5g/L，pH5.88.1/2MSENH1)1/2 X MS大量鹽分；1/2 X MS微量鹽分，2)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L； Na2-EDTA 37.3mg/L；3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)多效唑(MET)1mg/l； 荼乙酸(NAA)0.5mg/l5)30g/L蔗糖，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，2.0g/LPHYTAGEL(Sigma公司)，PH5.8六.植物組織提取RNA1.先將水稻幼苗在液氮中研磨成粉。將粉末分裝到離心管中，每管分裝100mg左右。每管加入1ml TRIZOL試劑(Invitrigen公司)，混勻，室溫放置5min。加入氯仿200μl，用力振蕩15sec，室溫孵育2～3min。
2.4℃下離心(12000×g，15min)，混合物分為紅色的酚-氯仿相(下相)、白色的中間相以及無色的上層水相。RNA在上層水相中。
3.轉(zhuǎn)移上層水相(500μl)到一個(gè)新的Eppendorf管中，加入1ml無水乙醇，以沉淀RNA。
4.室溫孵育10min以上，4℃條件下離心(12000×g，10min)，可見白色的RNA沉淀貼于管底壁。
5.吸棄上清，用70％的乙醇洗滌RNA沉淀一次，4℃條件下離心(7500×g，5min)6.吸棄上清，空氣中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存?zhèn)溆?。用紫外分光光度?jì)測(cè)定RNA濃度及存度，A260/A280＞1.8。
七.RT-PCR按照Promega廠商所建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System(Cat.#A3500)(Promega廠商)，DNase(無RNase)(Promega廠商)，DEPC(華舜生物工程有限公司)八.5′race和3′race實(shí)驗(yàn)按照Roche廠商所建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
試劑RACE Kit(Cat.#3353621)(Roche廠商)九.GUS染色試劑GUS染液0.5mg/ml X-Gluc(Duchefa公司)，50mM KHPO4(pH7)，0.5mMK3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，20％(v/v)甲醇，0.1％(v/v)Triton-X100(華舜生物工程有限公司)。
步驟1.轉(zhuǎn)入GUS染液中，500mmHg真空抽氣。
2.37℃染色過夜。
3.95％乙醇脫色后觀察。
此外，Southern雜交和植物總DNA提取方法(CTAB法)均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook等人，第二版，New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1995)中所述的方法進(jìn)行。
(II)具體實(shí)施例實(shí)施例1RG突變體植株的獲得T-DNA標(biāo)簽分離基因是植物功能基因研究的最重要手段之一。T-DNA(transfer DNA)是位于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumor inducing)質(zhì)?；虬l(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri(root inducing)質(zhì)粒上的一段DNA，它可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定的整合到植物染色體上，因此可作為一類外源基因載體，將外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并再生出能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物；也可能使插入位點(diǎn)基因的表達(dá)受到影響，從而產(chǎn)生可篩選的突變表型，由于T-DNA序列已知，一旦遺傳分析確定突變表型與插入的標(biāo)簽連鎖，即可通過IPCR或TAIL-PCR方法獲得標(biāo)簽兩端的側(cè)翼序列，然后將側(cè)翼序列與基因組序列相比較獲得突變基因的信息。由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化異源宿主單子葉植物水稻非常有效，利用T-DNA建立各類突變體庫是目前了解水稻整個(gè)功能基因組最廣泛采用的方法。在本發(fā)明人構(gòu)建的T-DNA轉(zhuǎn)化群體中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻葉片向外卷曲的突變體。
因此，利用T-DNA標(biāo)簽法，本發(fā)明人分離得到了該水稻葉片向外卷曲的基因。
實(shí)施例2RG突變體植株BY240的形態(tài)學(xué)觀察一般葉片在生長過程中都發(fā)生自然彎曲，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的一個(gè)葉片向外卷曲的突變體BY240，由于葉片外卷引起葉片挺直不披垂，使整個(gè)植株的株型直立。對(duì)照中花11和RG突變體植株的葉片具體形態(tài)見圖1，可觀察到對(duì)照中花11的葉片是平的，而RG突變體植株BY240的葉片是向外卷曲的。
另外，整個(gè)RG突變體植株的生長形態(tài)見圖6，可見在生長過程中葉片外卷，大多葉片都可保持挺直狀態(tài)，下垂少。
實(shí)施例3外卷突變體(BY240)的Southern雜交和染色體分析進(jìn)行外卷突變體(BY240)的Southern雜交。用HindIII酶切中花11、BY240葉片總DNA和pDsBar1300質(zhì)粒(pDsBar1300質(zhì)粒構(gòu)建方法見Wang J，等，ActaPhytophydiologica Sinica(in Chinese)，2000，26501)DNA，以Ds片段為探針與HindIII酶切后的中花11、BY240葉片總DNA和pDsBar1300質(zhì)粒DNA進(jìn)行Southern雜交，BY240和pDsBar1300質(zhì)粒存在雜交條帶，中花11無雜交條帶。Southern雜交結(jié)果見圖2。
通過外卷純合突變體與原品種中花11號(hào)雜交的F2群體分析，發(fā)現(xiàn)外卷突變與插入的T-DNA(含抗除草劑基因)存在著共分離；外卷突變體的Southern雜交分析證明，該突變體的T-DNA插入為單拷貝插入。
用Tail-PCR分離T-DNA插入位點(diǎn)的旁鄰序列(左端旁鄰序列SEQ IDNO3(其中第1-21位為T-DNA序列，第22-615為水稻基因組序列)和右端旁鄰序列SEQ ID NO4(其中第1-491位為水稻基因組序列，第492-729位為水稻基因組序列))表明，T-DNA插入在水稻第4染色體上，并且位于RG基因位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域，離起始密碼子ATG有1798bp。插入位置見圖3。
實(shí)施例4RG基因的克隆利用水稻抽提的總RNA，以RT-PCR分段分離出RG基因的mRNA片段并測(cè)序，獲得RG基因的編碼序列SEQ ID NO1。根據(jù)水稻通用密碼子編碼規(guī)律，及RG基因的編碼序列SEQ ID NO1推導(dǎo)出RG蛋白的序列，獲得的RG蛋白的序列為SEQ ID NO2。
將RG基因構(gòu)建入質(zhì)粒，獲得含有T-DNA和RG cDNA的可表達(dá)RG蛋白的pUN-RGCO重組表達(dá)載體(圖5)。具體方法如下在pCAMBIA1300(購自CAMBIA公司)多克隆位點(diǎn)HindIII和BamH I處插入U(xiǎn)bi啟動(dòng)子，在Sac I和EcoR I處插入Nos終止子，獲得pUN載體。
pUN-RGCO是在pUN載體多克隆位點(diǎn)BamH I和Kpn I之間插入水稻RG基因全長cDNA構(gòu)建而成。
另外，用類似方法，直接用水稻基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得SEQ ID NO8所示的基因組序列。
實(shí)施例5RG基因的序列分析利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網(wǎng)頁中“Align two sequences(b12seq)”和“Protein-protein BLAST(blastp)”分析工具對(duì)RG基因的序列進(jìn)行分析。分析結(jié)果如下RG基因組序列如SEQ ID NO2所示，啟動(dòng)子區(qū)在ATG的上游1.5K到2K左右區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)經(jīng)過確認(rèn)在ATG上游174bp的位置，第一外顯子共147bp，第一內(nèi)含子112bp，第二外顯子762bp，終止子TGA距ATG351bp。
實(shí)施例6外卷水稻植株中RG基因過量表達(dá)1.中花11(ZH11)與BY240植株的比較以中花11水稻植株作為對(duì)照，比較BY240突變植株與中花11植株的RG基因表達(dá)情況。
利用RT-PCR技術(shù)，比較了RG基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BY240突變體的RG基因與中花11的RG基因相比在表達(dá)上存在極大上調(diào)的現(xiàn)象。
以ZH11水稻植株作為對(duì)照，比較BY240突變植株與ZH11植株的各個(gè)部位中RG基因的表達(dá)情況。
結(jié)果見圖4，其中，泳道1ZH11成熟葉 泳道5BY240成熟葉泳道2ZH11成熟葉鞘 泳道6BY240成熟葉鞘泳道3ZH11幼穗 泳道7BY240幼穗泳道4ZH11成熟莖 泳道8BY240成熟莖從圖4可很明顯地觀察到，BY240成熟葉、BY240成熟葉鞘、BY240幼穗、BY240成熟莖中RG基因的表達(dá)顯著高于ZH11中各相應(yīng)的部位。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所<120>水稻葉片外卷基因及其應(yīng)用<130>058806<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>909<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<220>
<221>CDS<222>(173)..(520)<223>
<400>1atccccctat aaatacttgc catctcttct ccgtccaacc acaccaccca gcaagaagac60cccgagcaat tctacccgct cggagctcct cccctttcat cgtctccaat caccatcatc120tgcacgtctc accggcccta cgcaacagca agtgggttac ctctcgatcg gg atg agc178Met Ser1cgc agc aac aag aag agc tct agg ggc atc gac ctg aag ctg aac ctc 226Arg Ser Asn Lys Lys Ser Ser Arg Gly Ile Asp Leu Lys Leu Asn Leu5 10 15tcg ctg ccg gcg aga ggg gac tcg tcg tcc agg agg gcg atg gcc gcc 274Ser Leu Pro Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ser Arg Arg Ala Met Ala Ala20 25 30gac gag gag tcg tcg ccg agc tcg tgc ctg tcg tcg gag aac gag cac 322Asp Glu Glu Ser Ser Pro Ser Ser Cys Leu Ser Ser Glu Asn Glu His35 40 45 50ggc ctg cag tgg tcc aac agc ccg gag gcg acg tcc atg gtg ctc gcc 370Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ser Pro Glu Ala Thr Ser Met Val Leu Ala55 60 65gcc tgc cct cgc tgc ttc atc tac gtc atg ctc ccg cag gat gat ccg 418Ala Cys Pro Arg Cys Phe Ile Tyr Val Met Leu Pro Gln Asp Asp Pro70 75 80
cgg tgc ccg cag tgc aag agc ccc gtg atc ctt gac ttc ctg cag cag 466Arg Cys Pro Gln Cys Lys Ser Pro Val Ile Leu Asp Phe Leu Gln Gln85 90 95gac aac ggc aac aac aac gcc aac agc aat agc agc agg aag acc agg 514Asp Asn Gly Asn Asn Asn Ala Asn Ser Asn Ser Ser Arg Lys Thr Arg100 105 110aga ggg tgaagttaaa caaaaggggg ggcaattctc cgtttggcag aagatcaaca 570Arg Gly115tcaatcaaga aaaagaaaag cgtctatatg aagtcctagg tccagtaatt ctcttttgtt630ttgcctattc ccccagtgta accatgatat attccttact aaaattgtga gactagcatg690aaaatccatg tgctggtggc ataattttga tacatcatgg atacactggg gactatatcc750atccccctct cctggcttcc ttctttagtg gttctaaatg aagaagtttt gcttagacat810aggaccagac ttctcatctt tgttttgttt ttgtttcctt tccgagatga aaagaaaaca870tttaccctga aaatgttgag atgattattg ttctgaatc 909<210>2<211>116<212>PRT<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>2Met Ser Arg Ser Asn Lys Lys Ser Ser Arg Gly Ile Asp Leu Lys Leu1 5 10 15Asn Leu Ser Leu Pro Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ser Arg Arg Ala Met20 25 30Ala Ala Asp Glu Glu Ser Ser Pro Ser Ser Cys Leu Ser Ser Glu Asn35 40 45Glu His Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ser Pro Glu Ala Thr Ser Met Val50 55 60Leu Ala Ala Cys Pro Arg Cys Phe Ile Tyr Val Met Leu Pro Gln Asp65 70 75 80
Asp Pro Arg Cys Pro Gln Cys Lys Ser Pro Val Ile Leu Asp Phe Leu85 90 95Gln Gln Asp Asn Gly Asn Asn Asn Ala Asn Ser Asn Ser Ser Arg Lys100 105 110Thr Arg Arg Gly115<210>3<211>615<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>3cagaaccaca atatatcctg tgctcataac tgtgccacta ggttattgct tagtacagga60tatggtatat aaatgtatct ttgcacgtat atattgccat tagtcggtgt atgggggcca120aacccatgtg ctcttcttta attccatggt ggcatctaag gagcttaatt agagattatg180agtgaaaaat aatctccact gagttttctc gcgccttctt gttgtggttg caaaggcaat240gagctccaat gcaaaatagt tggatatatt gcgatttcgc ataaggtacc aagttattgg300caaaattcac aatttaatta ctttttaaac tccagctgct gttctagtgg actctcttgt360tgcttgtctt attttgaggt atgtattgat gaatactatg atagctcttt tggaacgcat420gaattttata ggaatttcgt gggagttagt tgaattcagt gaacgtcctg aaggaggccc480tgatatttgt gctactgata taatatttgt ggtgctgatg accagatgat gcttatatgc540ccactcgctt agtgaagact tgcgaggtgt cgcgctttag atgtttggaa ttggatagag600gtggatggaa gtatg 615<210>4<211>729<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>4cgagatgctt actatcccac cttgattaat gatgatgaca tacaactcac ttaaagttgt60
tttggtttgt gtgttgcatt gggtttggtc aatgctgcta ctcatcaagg ttaagagata120gccacctgta gagaaaataa tttgcctcag ttaggactaa ttctagcatt aatgctcccg180ttttgggcaa atagaagcag taatggatgg ttttgggatc cagagccaac gctatcggcc240tcgggatcaa aggtttgagt tcagtttacc tgattttata atatttcacc accattcatc300atgattcatc gatgatgcgt ctaaaattgc aggtaaagtc tcggagttga aggcaactat360gaaggcaagg ttgacccaac taggaaccgg tatttttgtt cggtaaaatc acacatgaaa420acatatattc aaaacttaaa aacaaatata aaaaattgta aacacaagtc ttaattaaac480atagataaaa tccatataaa tctggagcac acatagttta atgtagcaca taagtgataa540gtcttgggct cttggctaac ataagaagcc atataagtct actagcacac atgacacaat600ataaagttta aaacacatat tcataatcac ttgctcacat ctggatcact tagcatgcat660aaactaatta caaccaaggc tcatctgtca acaaacataa gaccattgct catggagagg720agccactgg729<210>5<211>24<212>DNA<213>引物<400>5caaaatccag tactaaaatc caga 24<210>6<211>21<212>DNA<213>引物<400>6attcggcgtt aattcagtac a 21<210>7<211>21<212>DNA<213>引物<400>7gtgttattaa gttgtctaag c 21
<210>8<211>1021<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>8atccccctat aaatacttgc catctcttct ccgtccaacc acaccaccca gcaagaagac60cccgagcaat tctacccgct cggagctcct cccctttcat cgtctccaat caccatcatc120tgcacgtctc accggcccta cgcaacagta agttccttcg ccatcgccat gtcttctcct180acctctaagc ttcatatgac agtcgtgcaa aagtttccat ttgaccaacc ggctaacgaa240cgtttttatg ggggtgtagg caagtgggtt acctctcgat cgggatgagc cgcagcaaca300agaagagctc taggggcatc gacctgaagc tgaacctctc gctgccggcg agaggggact360cgtcgtccag gagggcgatg gccgccgacg aggagtcgtc gccgagctcg tgcctgtcgt420cggagaacga gcacggcctg cagtggtcca acagcccgga ggcgacgtcc atggtgctcg480ccgcctgccc tcgctgcttc atctacgtca tgctcccgca ggatgatccg cggtgcccgc540agtgcaagag ccccgtgatc cttgacttcc tgcagcagga caacggcaac aacaacgcca600acagcaatag cagcaggaag accaggagag ggtgaagtta aacaaaaggg ggggcaattc660tccgtttggc agaagatcaa catcaatcaa gaaaaagaaa agcgtctata tgaagtccta720ggtccagtaa ttctcttttg ttttgcctat tcccccagtg taaccatgat atattcctta780ctaaaattgt gagactagca tgaaaatcca tgtgctggtg gcataatttt gatacatcat840ggatacactg gggactatat ccatccccct ctcctggctt ccttctttag tggttctaaa900tgaagaagtt ttgcttagac ataggaccag acttctcatc tttgttttgt ttttgtttcc960tttccgagat gaaaagaaaa catttaccct gaaaatgttg agatgattat tgttctgaat1020c102權(quán)利要求
1.一種分離的RG蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有葉片外卷功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(i)編碼權(quán)利要求1所述的RG蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
4.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(1)SEQ ID NO1中1-909位所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO1中173-520位所示的核苷酸序列；或(3)SEQ ID NO8中1-1021位所示的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體，或基因組中整合有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
7.一種使水稻葉片發(fā)生外卷的方法，其特征在于，該方法包括增加所述水稻中RG基因或其同源基因的表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過插入T-DNA序列或用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)該RG基因或其同源基因的表達(dá)。
9.一種改良水稻的方法，其特征在于，它包括步驟(a)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的RG蛋白的DNA編碼序列；(b)將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該RG蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上；(c)選擇出轉(zhuǎn)入所述RG蛋白DNA編碼序列的水稻細(xì)胞或組織；(d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織再生成水稻植株。
10.一種DNA分子的用途，所述的DNA分子編碼序列如SEQ ID NO2所示的蛋白，其特征在于，所述的DNA分子用于制備促進(jìn)葉片外卷的水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻葉片外卷基因RG及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及使水稻葉片發(fā)生外卷從而提高水稻產(chǎn)量的方法。本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，采用本發(fā)明方法可使得水稻葉片外卷，增加葉片的挺直度從而增加葉片受光面積、使中下層葉片能受到較多的光照。在密植狀態(tài)下通過使葉片外卷也可改善群體的通風(fēng)透光性，減少發(fā)病機(jī)會(huì)。本發(fā)明的外卷基因還可作為基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記和雜交制種過程中真雜種的指示標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1970569SQ20051011062
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者沈革志, 張景六, 黎凌, 王新其, 殷麗青 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所, 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院