專利名稱：犬類精液超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬類精液超低溫冷凍保存方法，用于犬精子超低溫冷凍保存以及利用凍精進行人工授精繁殖育種，屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從Polge等(1949)用甘油作為防凍劑冷凍保存精子成功以來，精子低溫冷凍保存研究在家畜、一些野生動物和人類中都取得了很大的發(fā)展，并逐漸成為生物多樣性、遺傳資源遷地保護的一個重要手段。對優(yōu)良家畜如豬、馬、牛、羊和犬的育種繁殖，挽救瀕危動物都有著極其重要的實踐意義。犬作為最早馴養(yǎng)的家畜動物，在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮著特有的作用，優(yōu)良種犬的社會需求更是與日俱增。在世界寵物犬市場中可以發(fā)現(xiàn)，名貴犬種正以其獨特的身價、良好的開發(fā)前景逐漸被人們所接受，優(yōu)質(zhì)寵物犬將以它高品質(zhì)受到更多人的青睞。隨著人類飼養(yǎng)技術(shù)、繁殖水平的提高，寵物飼養(yǎng)種類越來越多。
我國犬的品種不僅以特有的使用和觀賞價值著稱于世界，而且對世界著名品種的形成產(chǎn)生過重要的影響，如西藏的馬士迪夫(獒)、西施犬、北京犬、西藏拉薩犬(埃普索犬)等，作為珍貴犬的品種資源，已經(jīng)成為世界人民的共同財富。我國城鄉(xiāng)居民隨著經(jīng)濟條件的改善，飼養(yǎng)寵物的人越來越多，人們已經(jīng)意識到飼養(yǎng)寵物犬所帶來的巨大經(jīng)濟效益，已把人工飼養(yǎng)寵物犬作為一種新興飼養(yǎng)業(yè)來發(fā)展，寵物犬除了進入人類的物質(zhì)生活外，逐漸進入人類的精神生活。目前國內(nèi)各地區(qū)已經(jīng)廣泛開展了犬的人工養(yǎng)殖，現(xiàn)有寵物犬上億只。同我國飼養(yǎng)的犬相比，國外犬品種繁多、質(zhì)量較高，尤其是新型品種價格昂貴。其主要原因是人工繁殖技術(shù)的應(yīng)用，通過人工授精技術(shù)雜交改良原有犬品種，既能克服不同品種間自然交配難題，又能通過雜交優(yōu)勢培育出新型品系，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益。然而我國犬的繁殖育種仍然采用傳統(tǒng)的自然繁殖方法，這不僅影響繁殖率及育種進程，而且在自然交配繁育過程中產(chǎn)生大量的近交系，導(dǎo)致犬品種質(zhì)量退化，嚴(yán)重制約著我國寵物業(yè)的發(fā)展，進行寵物犬品系改良、種質(zhì)更新等繁育研究成為當(dāng)務(wù)之急。如何進一步保存、利用、開發(fā)我國的犬種資源，是一項非常重要的研究課題。深入開展此寵物犬精液冷凍保存技術(shù)研究，建立優(yōu)質(zhì)寵物犬冷凍精子庫，并利用犬冷凍精液進行人工授精繁殖，能夠大大加快犬的繁殖育種進程，提高其品系質(zhì)量，必將對我國的社會、經(jīng)濟、生活產(chǎn)生難以估量的積極作用。同時對于促進我國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，提高我國寵物犬品種在國際市場的競爭力起到巨大推動作用。
人工授精繁殖技術(shù)包括利用稀釋后的鮮精液和解凍后的凍精輸精兩種方式，冷凍精液及其人工輸精，將會大大提高良種公犬的利用率和利用價值，其中涉及到的關(guān)鍵性技術(shù)就是稀釋液、防凍液的研制及其應(yīng)用技術(shù)。研究表明，凍融精子的質(zhì)量如何，例如活力、質(zhì)膜完整率及頂體完整率的高低直接影響人工輸精的受孕率。犬精子與其它犬科動物的精子類似，其在凍融過程中對低溫?fù)p傷的抗性較弱，冷凍復(fù)蘇后精子活力下降，質(zhì)膜完整率及頂體完整率亦明顯降低，人工授精的受孕率及胎仔數(shù)均低于自然繁殖(Farstad，等，1996，AnimalReproduction Science.42251～260.)。因此，如何長期低溫保存優(yōu)質(zhì)犬精液并充分利用優(yōu)良種源是目前本領(lǐng)域亟待解決的問題。
目前，犬的人工授精尤其是精液的超低溫冷凍保存及利用凍精繁殖很受人們的關(guān)注，但遠(yuǎn)未達到牛、羊等家畜動物水平，有關(guān)基礎(chǔ)理論與技術(shù)環(huán)節(jié)尚需進一步研究探討，其中防凍液的配制及其相關(guān)冷凍、解凍程序是亟待解決的技術(shù)難題。
氨基-鈉-十二烷基硫酸酯Orvus ES Paste(OEP)是一種表面活性劑，其組成中含有十二烷基硫酸鈉(SDS)復(fù)合物，是豬和犬動物精液冷凍時常用的稀釋防凍成分，主要作用是防止低溫對精子的損傷，對精子膜結(jié)構(gòu)有保護、修補作用，能夠提高凍融精子活力、存活率及質(zhì)膜完整率。目前關(guān)于OEP保護作用的機理提出雙重假設(shè)一方面OEP具有乳化類脂的作用，對精子膜結(jié)構(gòu)中的類脂有穩(wěn)定作用，降低或者阻礙由冷凍保存所引起的似獲能性變化；另一方面OEP通過分散卵黃中的類脂形成聚合體，使這些類脂物更易進入精子質(zhì)膜，而不是直接作用于精子膜結(jié)構(gòu)，即OEP發(fā)揮作用的前提必須有卵黃存在。N-乙?；?D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是幾丁質(zhì)的主要成分，存在于昆蟲和甲殼動物的外骨骼中，屬于多糖同聚物，在細(xì)胞外表層、細(xì)胞間隙及結(jié)締組織形成時提供主要的結(jié)構(gòu)成分，使動植物組織有彈性和韌性。研究報道N-乙酰基-D-葡萄糖胺通過人體腹膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞能有效激活體內(nèi)葡萄胺聚糖的合成，并已成功應(yīng)用于豬精液冷凍稀釋液中(Yi等，2002，Animal Reproduction Science.74，187-194.)，但關(guān)于OEP和N-乙?；?D-葡萄糖胺同用在犬精液防凍劑方面的研究目前還沒有報道，尤其是有關(guān)N-乙?；?D-葡萄糖胺、OEP及卵黃的應(yīng)用技術(shù)亦未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種犬類精液超低溫冷凍保存方法，能有效延長犬凍融精子的存活時間，有利于維持犬精子的質(zhì)膜完整性及頂體完整性，提高犬凍精繁殖的受孕率。以便克服犬不同品種之間難于自然交配繁殖弊端，充分利用優(yōu)質(zhì)寵物犬種源，加快犬的育種繁殖進程。用于建立優(yōu)質(zhì)寵物犬的冷凍精子庫，長期保存優(yōu)質(zhì)寵物犬的種質(zhì)基因，為新品系的繁育研究提供基礎(chǔ)材料。
為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明采用一種表面活性劑氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)及細(xì)胞培養(yǎng)液成分N-乙?；?D-葡萄糖胺，同時添加果糖、檸檬酸、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、卵黃、甘油或二甲基亞砜、殺菌劑等各種成分，用蒸餾水配制成犬精子冷凍防凍液，并利用防凍液將犬類精液稀釋，降溫平衡后進行包裝冷凍，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存，以此提高對犬精子超低溫冷凍保存的效能。使用時再進行精子復(fù)蘇解凍。
本發(fā)明的犬類精液超低溫冷凍保存方法包括如下步驟1)將果糖0.45～3.10g、檸檬酸0.50～2.30g、三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90g依次溶解于50mL蒸餾水中，制得防凍液的緩沖液；2)將0.01～0.10g N-乙酰基D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸餾水中，溶解溫度為20～30℃，完全溶解后依次加入0.05～2.50mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和15.0～30.0mL卵黃，混合均勻后在20～30℃下放置24～48小時，然后以1000g～5000g的速率離心5～10分鐘，取上清液；3)將上清液加入到防凍液的緩沖液中，并加入甘油或二甲基亞砜2.0～8.0mL、殺菌劑1000UI/mL，蒸餾水定容100mL配制成防凍液；4)在18～25℃條件下，將犬類精液與防凍液按體積比1∶3混合，得到稀釋的精液，在4～8℃條件下降溫平衡1.5～3.5小時，然后進行包裝冷凍，包裝的體積為0.20mL～0.75mL，冷凍速率為25.0～40.0℃/分鐘，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存；5)使用時，精子復(fù)蘇的解凍速率為20.0～50.0℃/分鐘。
本發(fā)明所述殺菌劑為青霉素或慶大霉素。犬精液的采集、精液采集后的預(yù)處理均按本領(lǐng)域的常規(guī)方法進行。
本發(fā)明的N-乙?；?D-葡萄糖胺、氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和卵黃等成分配制時的溫度條件均能影響防凍液對犬凍融精子的保護效果，尤其是防凍液使用時的溫度條件，對提高犬凍融精子的活力、復(fù)蘇率及質(zhì)膜和頂體的完整率有顯著效果；N-乙?；?D-葡萄糖胺、氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和卵黃相互作用的時間亦影響防凍液的使用效果，在本發(fā)明中三者相互作用的時間條件下，能夠增強OEP對卵黃的乳化作用，使大量微小乳脂顆粒釋放出來，再經(jīng)過一定速率的離心后，收集含有大量微小乳脂顆粒的上清液添加到防凍液緩沖液中，同時在N-乙?；?D-葡萄糖胺的協(xié)同作用下，顯著提高對犬凍融精子的保護效果；精液包裝體積的大小、冷凍速率及精子復(fù)蘇的解凍速率大小亦是影響該防凍液應(yīng)用效果的關(guān)鍵條件。
本發(fā)明方法簡單，取材容易且成本價格低廉，易于推廣。實驗研究結(jié)果表明，本發(fā)明的方法，能有效延長犬凍融精子的存活時間、保護凍融精子膜結(jié)構(gòu)的完整性，表現(xiàn)出了良好的精子保護作用和防凍效果。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。以下實施例的作用應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的詮釋而非對本發(fā)明任何方式的限制。
實施例1稱量一定量1.35g果糖、1.85g檸檬酸、1.85g三羥甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸餾水中，作為犬精子超低溫冷凍保存防凍液的緩沖液；稱量0.06gN-乙?；?D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸餾水中，溶解溫度為25℃，完全溶解后依次加入0.50mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黃；三者均勻混合后25℃放置30小時，然后以2000g的速率離心8分鐘，取上清液加入到果糖等其它成分配制的防凍液的緩沖液中，然后加入3mL甘油及10萬單位青霉素或慶大霉素，蒸餾水定容100mL配制成防凍液；在22℃條件下，將犬類精液與防凍液按體積比1∶3混合，得到稀釋的精液，在5℃條件下降溫平衡2.5小時，然后進行包裝冷凍，包裝的體積為0.25mL，冷凍速率為32.0℃/分鐘，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存；使用時，精子復(fù)蘇的解凍速率為30.0℃/分鐘。
按實施例1的方法進行犬精液超低溫冷凍保存后，實驗測定冷凍精子復(fù)蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質(zhì)膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯(lián)合染色法檢測精子頂體完整率)。結(jié)果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為70小時、保存4小時后凍融精子活力為0.30、精子質(zhì)膜完整率平均為41％，頂體完整率為62％；利用該凍精(冷凍復(fù)蘇后0.5小時)人工輸精繁殖母犬受孕率為88.6％。與常規(guī)的使用技術(shù)方法相比較，本發(fā)明的超低溫冷凍保存方法能夠有效延長犬精子超低溫冷凍保存的存活時間，提高犬凍融精子的活力、質(zhì)膜完整性及頂體完整性，顯著提高了犬凍融精子的質(zhì)量，進而提高了凍精人工輸精的受孕率。
實施例2稱量2.45g果糖、1.25g檸檬酸、1.55g三羥甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸餾水中，作為犬精子超低溫冷凍保存防凍液的緩沖液；稱量0.08gN-乙?；?D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸餾水中，溶解溫度為28℃，完全溶解后依次加入0.70mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黃；三者均勻混合后20℃放置45小時，然后以2500g的速率離心6分鐘，取上清液加入到防凍液的緩沖液中，然后加入4mL甘油及10萬單位青霉素或慶大霉素，蒸餾水定容100mL配制成防凍液；在28℃條件下，將犬類精液與防凍液按體積比1∶3混合，得到稀釋的精液，在4℃條件下降溫平衡3.5小時，然后進行包裝冷凍，包裝的體積為0.50mL，冷凍速率為40.0℃/分鐘，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存；使用時，精子復(fù)蘇的解凍速率為35.0℃/分鐘。
按實施例2的方法進行犬精液超低溫冷凍保存后，實驗測定冷凍精子復(fù)蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質(zhì)膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯(lián)合染色法檢測精子頂體完整率)。結(jié)果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為68小時、凍融精子活力為0.54、精子質(zhì)膜完整率平均為61％，頂體完整率為66％。本發(fā)明方法顯著提高了犬凍融精子的質(zhì)量。
實施例3稱量1.25g果糖、2.75g檸檬酸、3.05g三羥甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸餾水中，作為犬精子超低溫冷凍保存防凍液的緩沖液；稱量0.02gN-乙?；?D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸餾水中，溶解溫度為22℃，完全溶解后依次加入0.80mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黃；三者均勻混合后22℃放置45小時，然后以2500g的速率離心6分鐘，取上清液加入到防凍液的緩沖液中，然后加入6mL二甲基亞砜及10萬單位青霉素或慶大霉素，蒸餾水定容100mL配制成防凍液；在22℃條件下，將犬類精液與防凍液按體積比1∶3混合，得到稀釋的精液，在6℃條件下降溫平衡3.0小時，然后進行包裝冷凍，包裝的體積為0.50mL，冷凍速率為38.0℃/分鐘，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存；使用時，精子復(fù)蘇的解凍速率為36.0℃/分鐘。
按實施例3的方法進行犬精液超低溫冷凍保存后，實驗測定冷凍精子復(fù)蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質(zhì)膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯(lián)合染色法檢測精子頂體完整率)。結(jié)果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為55小時、保存4小時后凍融精子活力為0.20、精子質(zhì)膜完整率平均為32％，頂體完整率為51％；利用該凍精(冷凍復(fù)蘇后0.5小時)人工輸精繁殖母犬受孕率為83.4％。
權(quán)利要求
1.一種犬類精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于按如下步驟進行1)將果糖0.45～3.10g、檸檬酸0.50～2.30g、三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90g依次溶解于50mL蒸餾水中，制得防凍液的緩沖液；2)將0.01～0.10g N-乙?；?D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸餾水中，溶解溫度為20～30℃，完全溶解后依次加入0.05～2.50mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯和15.0～30.0mL卵黃，混合均勻后在20～30℃下放置24～48小時，然后以1000g～5000g的速率離心5～10分鐘，取上清液；3)將上清液加入到防凍液的緩沖液中，并加入甘油或二甲基亞砜2.0～8.0mL、殺菌劑1000UI/mL，蒸餾水定容100mL配制成防凍液；4)在18～25℃條件下，將犬類精液與防凍液按體積比1∶3混合，得到稀釋的精液，在4～8℃條件下降溫平衡1.5～3.5小時，然后進行包裝冷凍，包裝的體積為0.20mL～0.75mL，冷凍速率為25.0～40.0℃/分鐘，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存；5)使用時，精子復(fù)蘇的解凍速率為20.0～50.0℃/分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的犬類精液超低溫冷凍保存方法，其特征在于所述殺菌劑為青霉素或慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種犬類精液超低溫冷凍保存方法，屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。將果糖、檸檬酸、三羥甲基胺基甲烷依次溶解于蒸餾水中，制得防凍液的緩沖液；將N－乙?；璂－葡萄糖胺溶解于蒸餾水中，再加入氨基－鈉－十二烷基硫酸酯和卵黃，混合均勻后在20～30℃下放置24～48小時，然后離心取上清液，加入到緩沖液中，并加入甘油或二甲基亞砜、殺菌劑，蒸餾水定容配制成防凍液；再利用防凍液將犬類精液稀釋，降溫平衡后進行包裝冷凍，制成細(xì)管凍精放入液氮中保存。使用時再進行精子復(fù)蘇解凍。本發(fā)明能夠有效延長犬精子超低溫冷凍保存的存活時間，提高犬凍融精子的活力、質(zhì)膜完整性及頂體完整性，提高凍精人工輸精的受孕率。
文檔編號C12N5/06GK1800370SQ20051011152
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者李新紅 申請人:上海交通大學(xué)