專利名稱：卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
固定化細胞的方法雖然有吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法等多種方法，但工業(yè)應(yīng)用上以包埋法最為普遍。使用的包埋法固定化載體也有多種，包括海藻酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、卡拉膠、瓊脂、明膠等。固定化微生物的優(yōu)點在本技術(shù)領(lǐng)域是顯而易見的，即具有可反復(fù)使用、更加穩(wěn)定、對環(huán)境變化不太敏感等優(yōu)點，有關(guān)此方面的詳細介紹可參見文獻(Charles D.D.，Enzyme Microb.Technol.，1987，9(2)66-73)。
在上述提到的固定化載體中，海藻酸是常用的一種，也是最容易形成球形顆粒的一種載體。海藻酸是鈣敏型的，其鈉鹽溶于水中，可與生物細胞或酶形成極易流動的膠狀液體。該膠液可與鈣鹽溶液接觸后即凝固。采用滴落法可非常方便制備海藻酸膠(鈣鹽)的球形顆粒，且球形顆粒在一定范圍內(nèi)不受滴落高度、速度及接觸溶液濃度的影響。應(yīng)用海藻酸固定化細胞已有廣泛應(yīng)用，且亦有研制出大規(guī)模制備球形顆粒的器械(周華，姜岷等，工業(yè)微生物，1998，28(3)43-45)。
但是海藻酸膠有著難以逾越的缺陷，在含有檸檬酸、乳酸、磷酸根的系統(tǒng)中，因螯合作用將造成鈣離子的流失，使海藻酸膠顆粒崩解。因此它的應(yīng)用受到一定限制。
卡拉膠是近幾十年興起的一種固定化載體。由于有較好的彈性和泌水性，以及生物安全性，廣泛應(yīng)用于固定化各種細胞。它可以在檸檬酸、乳酸、磷酸根等系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，也不易被微生物所降解。有關(guān)卡拉膠的性質(zhì)及應(yīng)用參見文獻(Fred D.V.，Nidia D.L.，Helena M.P.，et al..Adv.Synth.Catal.2002，344(8)815-835)。
卡拉膠為鉀敏型凝膠，其鈉鹽膠體溶液在與微生物細胞按一定比例混合后，在45℃左右開始凝固，在45-50℃與預(yù)熱的細胞溶液快速混勻，將其冷卻到28℃以下即可形成固體。采用類似于海藻酸鈣的滴落法，雖然也可以制備球狀顆粒，但是由于膠體溶液處于凝固點附近，粘度太高，一般需要額外較大的壓力才能將膠液從噴嘴中擠出，操作極難控制。Jan.H.H等(1993)報道了使用該法設(shè)計了生產(chǎn)卡拉膠固定化細胞的成型裝置，2.13mm的噴嘴，最大生產(chǎn)的能力為27.6L/h。所用的膠濃度為2.6％(W/W)。擠出法所需的設(shè)備復(fù)雜昂貴，制造成本高，操作難掌握。
基于水和許多有機溶劑不相容，水在有機溶劑中分散成液滴的原理，有文獻(孫萬儒，微生物學(xué)通報，1986，13(1)213-35)報道使用乙酸丁酯分散卡拉膠液體，形成球形顆粒。具體方法如下加熱制備8％的卡拉膠溶液，室溫下冷卻到60℃，取20mL膠液與20mL 40％的細胞液混勻，流加到攪拌的保溫30℃的乙酸丁酯中，直到分散成小顆粒，加入10％的KCl溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘濾去溶劑，再加2％的KCl固化一小時即形成1-3mm的固定化細胞。此方法的缺點是使用的乙酸丁酯不易回收，溶劑有對人有刺激性，需要在安全性較高的環(huán)境下操作。并且不能應(yīng)用于核苷三磷酸的生產(chǎn)。
發(fā)明人對制備固定化細胞球狀顆粒的方法進行了廣泛而詳細研究工作，并且對該方法在固定化啤酒酵母細胞作為催化劑，合成核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸中的應(yīng)用也進行了深入的研究工作。
基于上述研究，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是公開卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的大規(guī)模制備固定化微生物細胞顆粒難于操作等方面的缺陷。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是公開卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法在酶法合成核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的以大豆油作為分散劑，攪拌下加入κ-卡拉膠-魔芋多糖復(fù)配膠為載體固定化啤酒酵母細胞，室溫下即形成規(guī)則的球形顆粒。。
將本法制備的固定化酵母顆粒，加入含有葡萄糖、磷酸鹽、硫酸鎂、核苷酸(或脫氧核苷酸)的反應(yīng)液中，將核苷酸(或脫氧核苷酸)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核苷三磷酸(或脫氧核苷三磷酸)。
本發(fā)明卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，所用的固定化載體為卡拉膠，在攪拌的條件下使微生物細胞和卡拉膠接觸，其特征在于，所用的分散劑選自大豆油、菜籽油、棉籽油、色拉油、苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、硅油、石蠟油中的一種，所用的分散劑與膠液的體積比為2∶1-20∶1，攪拌轉(zhuǎn)速50-200rpm。優(yōu)選地分散劑與膠液的體積比為4∶1-10∶1。
本發(fā)明卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法所用的固定化載體卡拉膠的使用濃度為1％-8％(載體重量/固定化顆粒重量)。優(yōu)選的卡拉膠所使用的濃度為1.5％-5.0％(載體重量/固定化顆粒重量)。更優(yōu)選的，膠液中加入輔助劑，如魔芋多糖，添加量為0.5％(載體重量/固定化顆粒重量)。
本發(fā)明中所使用的微生物細胞選自啤酒酵母、面包酵母、藥用酵母、白地霉或其它來源的可以用于制備核苷三磷酸的生物細胞。微生物細胞的用量為5％-60％(濕酵母重量/固定化顆粒重量)。
本發(fā)明卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法包括以下步驟(1)配制1％-8％(載體重量/固定化顆粒重量)的κ-卡拉膠溶液；(2)制備微生物細胞懸浮液；(3)將卡拉膠溶液與微生物細胞懸浮液混合，攪拌均勻；(4)將分散劑與膠液的體積比為2∶1-20∶1的分散劑攪拌，轉(zhuǎn)速50-200rpm；(5)將(3)中的混合液倒入分散劑中，攪拌0.5-2小時，靜置待顆粒沉降后抽出上層分散劑；(6)向顆粒中加入KCl溶液，繼續(xù)攪拌1h使顆粒硬化成型，所得顆粒即為卡拉膠固定化微生物細胞球形顆粒。
可用本領(lǐng)域常用的技術(shù)制備κ-卡拉膠溶液，例如在高壓滅菌鍋中121℃保溫60min溶解卡拉膠，然后冷卻至40℃即得。用本領(lǐng)域常用的方法制備微生物細胞，例如用常規(guī)方法培養(yǎng)啤酒酵母，抽濾，用兩倍體積的0.85％的NaCl溶液洗三遍，抽濾得到濕酵母泥，加入適量的生理鹽水配制成合適濃度的酵母液，。
采用本發(fā)明的方法制備的固定化微生物細胞球形顆粒，可用于制備核苷三磷酸、脫氧核苷三磷酸等。核苷三磷酸為腺苷三磷酸(ATP)，胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鳥苷三磷酸(GTP)，脫氧核苷三磷酸為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)等。
用本發(fā)明的方法制備的固定化微生物細胞球形顆粒制備核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸的步驟包括將上述制備的固定化酵母顆粒加入到含有40mmol/L核苷酸(或脫氧核苷酸或胞苷酸加磷酸膽堿)、150mmol/L的葡萄糖、10mmol/L硫酸鎂、250mmol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液，于30℃振蕩反應(yīng)1.5-10小時，即可分離得到相應(yīng)的產(chǎn)物。
所說的核苷酸為腺苷-5’-單磷酸(AMP)、胞苷-5’-單磷酸(CMP)、尿苷-5’單磷酸和鳥苷-5’-單磷酸，所說的脫氧核苷酸為脫氧腺苷-5’-單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷-5’-單磷酸，或者其鈉鹽。
所用的固定化酵母的顆粒重量為0.2-2.0倍反應(yīng)液重量。最佳重量為0.75-1.5倍反應(yīng)液重量。
使用本發(fā)明的方法制備固定化酵母顆粒具有顯著的技術(shù)進步，解決了卡拉膠大規(guī)模造粒的難點，且顆粒的大小可控制，適合于不同的需要。所形成的固定化顆粒保持了原有生物細胞的生物活性，可應(yīng)用于核苷(脫氧核苷)三磷酸的制備。
所得顆粒具有酶活性高，機械強度好，外形為規(guī)則球狀，形狀大小適宜，細胞不易泄露，適于在反應(yīng)器中長期存在等優(yōu)點，并且操作簡單，放大方便，特別適合于大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。
所得固定化微生物細胞球形顆?？梢愿咝Х€(wěn)定地將核苷酸(或脫氧核苷酸)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核苷三磷酸(或脫氧核苷三磷酸)，且可反復(fù)使用達十次以上，未見明顯的細胞泄漏。
本發(fā)明中核苷酸的轉(zhuǎn)化率采用HPLC法測定。方法如下島津液相色譜儀，柱YWG-C18(250mm×4.6mm)；流動相5％乙腈+50mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液；流速1.0ml/min；波長254nm。


圖1為應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成ATP圖2應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成CTP
圖3應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成UTP圖4應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成GTP圖5應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成dATP圖6應(yīng)用固定化酵母球形顆粒重復(fù)反應(yīng)合成dGTP以下結(jié)合具體實施方式
詳細說明本發(fā)明，但必須理解所有的這些實施方式都僅僅是說明性，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求的法律結(jié)構(gòu)確定。
具體實施例方式實施例1稱取200g κ-卡拉膠鈉鹽，100g精制魔芋粉，溶于5L去離子水中，通蒸汽加熱至121℃，保溫60min。然后倒入20L帶攪拌的反應(yīng)釜中，自然冷即到40℃，膠液保溫備用。
另稱取洗滌好的啤酒酵母濕菌體4Kg并加入1kg生理鹽水，攪拌均勻，35℃保溫備用。
將保溫好的酵母懸液傾入到膠液中，于40℃攪拌半小時使混合均勻備用。
在100L帶攪拌的反應(yīng)釜中加入60L大豆油，預(yù)熱至40℃，控制不同攪拌速度(結(jié)果見表1)，將酵母與膠液的混合物倒入大豆油中，攪拌半小時待顆粒成形，過濾，豆油回收后靜置，棄去下層水份后可重復(fù)使用。顆粒用3％的氯化鉀溶液浸泡一小時，過濾，再用1％的戊二醛浸泡一小時，瀝盡顆粒表面的水份，裝袋置冰箱冷藏備用。
表1 攪拌轉(zhuǎn)速與球形顆粒直徑

*要求的直徑顆粒重量比上總顆粒重量不小于90％實施例2按實施例1中D項制備好的固定化酵母顆粒1Kg加入下述1L的反應(yīng)液中(pH＝7.0)(表2)表2

上述反應(yīng)液及固定化酵母顆粒置于2L的圓底燒瓶中，于30℃攪拌反應(yīng)2.5h，濾出反應(yīng)液，顆粒用少量的去離子水洗滌后，再加入1L反應(yīng)液，按上述條件重復(fù)反應(yīng)。結(jié)果見圖1?？梢娊?jīng)過10次反應(yīng)，ATP轉(zhuǎn)化率無明顯下降，表明本發(fā)明的固定顆粒具有較好的穩(wěn)定性。
實施例3將腺苷酸換為胞苷酸，其他操作同實施例2。結(jié)果見圖2。表明本發(fā)明的固定化顆粒CTP轉(zhuǎn)化活性具有較好的穩(wěn)定性。
實施例4其他操作同實施例2，除將腺苷換為尿苷酸二鈉，結(jié)果見圖3。表明本發(fā)明的固定化顆粒UTP轉(zhuǎn)化活性具有較好的穩(wěn)定性。
實施例5同實施例2，但是將腺苷換為鳥苷酸二鈉，結(jié)果見圖4。表明本發(fā)明的固定化顆粒具有較好的穩(wěn)定性。
實施例6同實施例2，但是將腺苷換為脫氧腺苷酸，結(jié)果見圖5?？梢姳景l(fā)明的固定化顆粒具有較好的穩(wěn)定性。
實施例7同實施例2，但是將腺苷換為脫氧鳥苷酸二鈉，結(jié)果見圖6。可見本發(fā)明的固定化顆粒具有較好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，固定化載體為卡拉膠，在攪拌的條件下使微生物細胞和卡拉膠接觸，其特征在于，所用的分散劑選自大豆油、菜籽油、棉籽油、色拉油、苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、硅油、石蠟油中的一種，所用的分散劑與膠液的體積比為2∶1-20∶1；攪拌轉(zhuǎn)速50-200rpm；所使用的微生物細胞選自啤酒酵母、面包酵母、藥用酵母、白地霉或其它來源的可以用于制備核苷三磷酸的生物細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，分散劑與膠液的體積比為4∶1-10∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，固定化載體卡拉膠的使用濃度為1％-8％(載體重量/固定化顆粒重量)；微生物細胞的用量為5％-60％(濕酵母重量/固定化顆粒重量)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，固定化載體卡拉膠的使用濃度為1.5％-5％(載體重量/固定化顆粒重量)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，添加0.5％(載體重量/固定化顆粒重量)的魔芋多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)配制1％-8％(載體重量/固定化顆粒重量)的κ-卡拉膠溶液；(2)制備微生物細胞懸浮液；(3)將卡拉膠溶液與微生物細胞懸浮液混合，攪拌均勻；(4)將分散劑與膠液的體積比為2∶1-20∶1的分散劑攪拌，轉(zhuǎn)速50-200rpm；(5)將(3)中的混合液倒入分散劑中，攪拌0.5-2小時，靜置待顆粒沉降后抽出上層分散劑；(6)向顆粒中加入KCl溶液，繼續(xù)攪拌1h使顆粒硬化成型，所得顆粒即為卡拉膠固定化微生物細胞球形顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，其特征在于，還包括在KCl固化后用戊二醛處理的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法在制備核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于，核苷三磷酸選自腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、尿苷三磷酸、鳥苷三磷酸或它們的鹽；脫氧核苷三磷酸選白脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸或其鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于，所使用的微生物細胞選自啤酒酵母、面包酵母、藥用酵母、白地霉或其它來源的可以用于制備核苷三磷酸的生物細胞；固定化顆粒加入到含有40mmol/L核苷酸(或脫氧核苷酸或胞苷酸加磷酸膽堿)、150mmol/L的葡萄糖、10mmol/L硫酸鎂、250mmol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液，于20-40℃振蕩反應(yīng)1.5-10小時，回收核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于，所用的固定化顆粒重量為0.2-2.0倍反應(yīng)液重量。
全文摘要
本發(fā)明卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法及其應(yīng)用屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明卡拉膠固定化微生物細胞球狀顆粒的制備方法，通過在攪拌的條件下使微生物細胞和卡拉膠接觸，用大豆油、菜籽油、棉籽油、色拉油、苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、硅油或石蠟油作分散劑，所用的分散劑與膠液的體積比為2∶1－20∶1；攪拌轉(zhuǎn)速50－200rpm；用KCl固化活的球形顆粒。本發(fā)明的方法具有操作簡單，所形成的球狀顆粒不易破碎，顆粒直徑可以控制、分布均勻，應(yīng)用本法包埋的微生物具有反應(yīng)活性高，核苷三磷酸的轉(zhuǎn)化率80％以上。固定化顆粒反復(fù)使用10次以上，未見明顯活力下降及崩解，可以很好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N11/04GK1800381SQ20051011176
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者丁慶豹, 邱蔚然, 歐伶, 由洋, 閆蓬勃 申請人:上海秋之友生物科技有限公司