專利名稱：rep基因表達(dá)質(zhì)粒，RBE順式元件定點(diǎn)整合體系及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種rep基因表達(dá)質(zhì)粒，RBE順式元件定點(diǎn)整合體系及其制備方法和在基因治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療對(duì)于遺傳性疾病的治療具有其他方法所不能替代的優(yōu)勢(shì)，但是基因治療需要對(duì)患者基因組進(jìn)行修飾，這使人們對(duì)其安全性表現(xiàn)出憂慮。
目前有數(shù)種基因操作的轉(zhuǎn)移途徑，病毒載體基因轉(zhuǎn)移效率高，但在安全性方面存在許多不足如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及慢病毒載體，可以隨機(jī)整合到宿主基因組中導(dǎo)致插入突變。非病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率低，外源基因表達(dá)短暫，也有隨機(jī)整合的安全性問題。
關(guān)于外源基因隨機(jī)插入基因組的危險(xiǎn)曾經(jīng)引起過軒然大波。2000年，ALAINFISHER等成功治愈三名患有致命的重度復(fù)合免疫缺陷癥SCID-XI的病人，成為基因治療史上最成功的范例，然而，2002年，其中兩名接受過基因治療的SCID-XI患者被檢查出患了白血病，且癌變是由于治療時(shí)使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入在靠近LM02原癌基因的位置或該原癌基因內(nèi)，激活了LM02表達(dá)引起的。這一事件引發(fā)了對(duì)基因治療可行性更多的爭(zhēng)議，也對(duì)基因治療的安全性提出了更為嚴(yán)格的要求(THOMASCE，EHRHARDTA，KAYMA.PROGRESS AND PROBLEMS WITH THE USE OF VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY.NATREVGENET.2003；4346-358)。
同樣是2002年，據(jù)MILLER等報(bào)道，去除了rep基因的重組腺相關(guān)病毒載體由于失去了定點(diǎn)整合的能力，使其隨機(jī)整合具有多變性、非精確性，并且造成染色體缺失、重排、功能基因被打斷等后果(MILLERDG，RUTLEDGEEA，RUSSELLDW..CHROMOSOMAL EFFECTS OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR INTEGRATION.NATGENET.2002；30147-148)，使人們對(duì)腺相關(guān)病毒作為基因治療載體的安全性也產(chǎn)生懷疑。
由于腺相關(guān)病毒是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一可以定點(diǎn)整合的人類原病毒，且腺相關(guān)病毒的整合機(jī)制可以用于指導(dǎo)外源基因定點(diǎn)整合至人類基因組，腺相關(guān)病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)EP在此過程中起著關(guān)鍵的作用，近年來引起了人們相當(dāng)?shù)难芯颗d趣。
過去的研究都認(rèn)為除Rep蛋白外，AAV ITR也是外源DNA整合所必需的成分。然而，以ITR作為順式元件構(gòu)建的重組AAV載體與Rep蛋白協(xié)同作用，即使可以定點(diǎn)整合至宿主體內(nèi)，當(dāng)宿主被輔毒再次感染后體內(nèi)將產(chǎn)生具有復(fù)制能力的攜帶外源基因的病毒，構(gòu)成潛在危險(xiǎn)(Linden，R.M.，E.Winocour，and K.I.Berns.1996.The recombination signals foradeno-associated virus site-specific integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937966-7972)。2002年P(guān)hilpott等研究發(fā)現(xiàn)如果存在138bp的P5啟動(dòng)子序列(稱為P5整合效率元件P5IEE)作為順式元件，則只需有Rep78/68蛋白，不需要ITR也可以發(fā)生針對(duì)AAVS1的定點(diǎn)整合。P5IEE作為一多功能元件既是Rep78/68蛋白的調(diào)控啟動(dòng)子，又是介導(dǎo)靶向整合的主要成分發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種安全、方便的外源基因定點(diǎn)整合體系及其制備方法和在基因治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的定點(diǎn)整合體系，包括由攜帶有RBE順式元件及EGFP報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒(為商業(yè)化質(zhì)粒)，與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成的外源基因的定點(diǎn)整合系統(tǒng)，以及由攜帶有RBE順式元件及人凝血因子IX的表達(dá)質(zhì)粒，與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成的外源基因的定點(diǎn)整合系統(tǒng)；其中，編碼RBE的DNA序列為SEQ.NO1。
本發(fā)明提供的定點(diǎn)整合體系，也可以是由攜帶有RBE順式元件(包括含RBE順式元件在內(nèi)的其它序列)，與待整合基因的表達(dá)質(zhì)粒與REP基因表達(dá)質(zhì)粒共同構(gòu)成。
本發(fā)明使用RBE與rep整合系統(tǒng)可以避開病毒包裝容量的限制，病毒制備繁瑣及病毒感染潛在的不安全隱患，通過裸質(zhì)粒導(dǎo)入，簡(jiǎn)潔方便；可以克服隨機(jī)插入所導(dǎo)致的功能基因斷裂、原癌基因激活、染色體缺失、重排等潛在危險(xiǎn)，達(dá)到使外源治療基因定點(diǎn)整合，長(zhǎng)期表達(dá)的目的，改善過去裸質(zhì)粒導(dǎo)入治療基因表達(dá)時(shí)間短，治療效果不持久的缺陷。
本發(fā)明提出的上述rep基因表達(dá)質(zhì)粒和RBE順式元件定點(diǎn)整合體系的制備方法，具體步驟如下1、RBE順式元件的設(shè)計(jì)在RBE序列的正鏈的5’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)，在負(fù)鏈的3’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)。所設(shè)計(jì)的編碼RBE的DNA序列見SEQ.NO1.
2、RBE順式元件的克隆和測(cè)序以及pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建合成的攜帶AseI粘性末端的RBE正負(fù)鏈對(duì)應(yīng)片段退火復(fù)性，成為雙鏈DNA片段，通過DNA重組技術(shù)插入經(jīng)AseI酶切的pEGFPN2載體，再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a宿主菌，最后涂布在卡納霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，篩選可能是重組克隆的菌落，得到pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序分析，確定插入了RBE順式元件的陽性克隆。
3、pRBE-CMV-FIX重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI限制性內(nèi)切酶從經(jīng)DNA測(cè)序鑒定的pBS/FIX質(zhì)粒中酶切出FIX基因片段，然后用T4DNA連接酶將它重組插入pRBE-CMV-EGFP(去除EGFP基因)載體。再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a宿主菌，若干抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，確定其為所要的插入人凝血因子IX基因的重組載體。編碼FIX的DNA序列為SEQ.NO2。
結(jié)果表明，本發(fā)明已經(jīng)成功地得到了pRBE-CMV-EGFP和pRBE-CMV-FIX重組表達(dá)質(zhì)粒，用pRBE-CMV-EGFP重組表達(dá)質(zhì)粒與pRep基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化胚胎胃細(xì)胞293細(xì)胞，可以長(zhǎng)期表達(dá)EGFP和Neo基因，經(jīng)G418篩選可以高效率地產(chǎn)生Neo抗性細(xì)胞克??；抽提這些細(xì)胞克隆的基因組，通過southern blot鑒定，確定37％的細(xì)胞克隆發(fā)生了外源基因的定點(diǎn)整合，整合位點(diǎn)是人19號(hào)染色體AAVS1位點(diǎn)(圖1，2)。用pRBE-CMV-FIX重組表達(dá)質(zhì)粒與pRep質(zhì)粒通過尾靜脈液壓法共注射攜帶AAVS1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠，從小鼠血漿中檢測(cè)到人凝血因子IX基因產(chǎn)物長(zhǎng)期存在，注射后100天仍然維持在100ng/ml濃度以上。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的PRBE-CMV-EGFP和PRBE-CMV-FIX重組表達(dá)質(zhì)粒已分別與PREP質(zhì)粒構(gòu)成定點(diǎn)整合系統(tǒng)。該定點(diǎn)整合系統(tǒng)可用于在人類細(xì)胞株和攜帶AAVS1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠中定點(diǎn)導(dǎo)入外源基因，制備程序簡(jiǎn)單。RBE順式元件與其他報(bào)告基因聯(lián)合運(yùn)用可以達(dá)到使外源基因定點(diǎn)整合，長(zhǎng)期表達(dá)的目的，便于得到穩(wěn)定整合的攜帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株。與其他治療基因聯(lián)合運(yùn)用可以適用于多種疾病基因治療，改善過去裸質(zhì)粒導(dǎo)入治療基因表達(dá)時(shí)間短，治療效果不持久的缺陷，對(duì)于發(fā)展基因治療載體有重要意義。


圖1pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒和pRep整合系統(tǒng)的示意圖。其中，A為pRep質(zhì)粒，B為pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒。
圖2pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒和pRep整合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)G418篩選14天后得到的穩(wěn)定細(xì)胞克??；其中，A為不含任何元件的EGFP對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞篩選14天后在熒光顯微鏡下看到的克隆形成情況；B為pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒和pRep整合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后的克隆形成情況；C為不含任何元件的EGFP對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞篩選14天后美藍(lán)染色觀察到的細(xì)胞克隆；D為pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒和pRep整合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞篩選14天后美藍(lán)染色觀察到的克隆形成情況。
圖3pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒和pRep整合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞得到的穩(wěn)定細(xì)胞克隆抽提基因組southern blot檢測(cè)整合位點(diǎn)。其中，A為AAVS1探針雜交，B為Neo探針雜交。
具體實(shí)施例方式
材料和方法1.限制性內(nèi)切酶AseI、BamHI、T4DNA連接酶，klenow DNA聚合酶為英國(guó)Biolabs產(chǎn)品。
2.克隆和測(cè)序載體pEGFPN2是Clontech公司產(chǎn)品。
3.Promega質(zhì)粒抽提試劑盒為promega公司產(chǎn)品。博大泰克膠回收試劑盒為博大泰克公司產(chǎn)品。
4.所設(shè)計(jì)RBE順式元件的正負(fù)鏈核苷酸堿基片段由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
以上材料均有市售1.RBE順式元件的設(shè)計(jì)克隆和測(cè)序以及pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建在RBE序列的正鏈的5’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)，在負(fù)鏈的3’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)。RBE順式元件正負(fù)鏈核苷酸堿基片段由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，合成的攜帶AseI粘性末端的RBE正負(fù)鏈對(duì)應(yīng)片段退火復(fù)性，成為雙鏈DNA片段，通過T4DNA連接酶將RBE雙鏈退火產(chǎn)物接入經(jīng)AseI酶切的pEGFPN2載體，再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主菌，最后涂布在卡納霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上篩選可能是重組克隆的菌落。重組質(zhì)粒由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序分析，確定插入了RBE順式元件的陽性克隆。
2.pRBE-CMV-FIX重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI限制性內(nèi)切酶從經(jīng)DNA測(cè)序鑒定的pBS/FIX質(zhì)粒中酶切出FIX基因片段，用klenow DNA聚合酶補(bǔ)平末端，pRBE-CMV-EGFP用BamHI/Not切除EGFP基因并補(bǔ)平末端，回收載體，然后用T4DNA連接酶將FIX片段與載體片段相連，再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主菌，若干抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，確定所要的插入人凝血因子IX基因的重組載體。
3.pRBE-CMV-EGFP與pRep質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞在六孔板中接種293細(xì)胞，第二天細(xì)胞密度達(dá)到70％～80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pRBE-CMV-EGFP2μg+pRep 0.4μg/孔，使用invitrogen公司的LipofecamineTMReagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后清洗細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將細(xì)胞懸浮起來，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，轉(zhuǎn)移至5cm培養(yǎng)皿中，添加含有500μg/ml的G418的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，篩選14天后可以得到EGFP和Neo基因穩(wěn)定整合的細(xì)胞克隆。
4.檢測(cè)外源基因在細(xì)胞克隆中的整合情況將上述得到的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，約兩周之后抽提這些細(xì)胞克隆的基因組，通過southern blot鑒定，先用熒光標(biāo)記的Neo基因特異探針進(jìn)行雜交，從得到x-ray片子可以得知每個(gè)細(xì)胞克隆中Neo基因的分布，然后將膜在煮沸的0.1％SDS中清洗3遍，去除Neo探針，再用熒光標(biāo)記的Neo基因特異探針進(jìn)行雜交，可以得知每個(gè)細(xì)胞克隆中AAVS1位點(diǎn)的分布，兩次雜交的x-ray片子對(duì)比，如果Neo特異的條帶與AAVS1特異條帶位置相同就說明在這個(gè)細(xì)胞克隆中Neo基因插入了人19號(hào)染色體的AAVS1特異位點(diǎn)。在pRBE-CMV-EGFP與pRep共轉(zhuǎn)染得到的細(xì)胞克隆中有37％的細(xì)胞克隆發(fā)生了外源基因的定點(diǎn)整合(圖1，2)。
5.尾靜脈液壓法在轉(zhuǎn)基因小鼠中導(dǎo)入外源基因使用6～8周齡的攜帶AAVS1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠，pRBE-CMV-FIX 25μg+pRep 25μg溶解于2.5ml Ringer’s溶液(成分為0.9％NaCl，0.03％KCl，and 0.016％CaCl2)中，用27號(hào)針頭7秒之內(nèi)將2.5ml溶液注入小鼠尾靜脈。1天后可眼眶采集小鼠血樣(添加3.8％檸檬酸鈉抗凝劑)，用ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中人凝血因子IX濃度。經(jīng)檢測(cè)，注射后100天轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中人凝血因子IX濃度仍維持在100ng/ml濃度以上。
本發(fā)明涉及的序列SEQ.NO1RBE序列5’-ATCAGCGAGCGAGCGAGCTAAT-3’5’-ATGCTCGCTCGCTCGCTGTAAT-3’SEQ.NO2編碼FIX的DNA序列5’-ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTTTTTAAAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATGCTGTCTTCTTCGCTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACGCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCATTTTTAAAACTAAATAGATCGACAATGCTTATGATGCATTTATGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCATGATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAGAAAACATTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACATTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAAATGGGAAACAAAAGCACAAACAATGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATATGACATTTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAATGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATGTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACATAAAGAGTAGGAAGTTAGCTAATGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATGTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGGAAGCATTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCA
GGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAACCGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGGCTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGGTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAATGAAAGATGGATTTCCAAGGTTAATTCATTGGAATTGAAAATTAACAGTGCAGGTCGACTCTAGA-3’
權(quán)利要求
1.一種外源基因定點(diǎn)整合體系，其特征在于為由攜帶有RBE順式元件及EGFP報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒與基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成，或者由攜帶有RBE順式元件及人凝血因子IX基因的表達(dá)質(zhì)粒與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成；其中編碼RBE的DNA序列為SEQ.NO1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源基因整合體系，其特征在于為由攜帶有RBE順式元件及待整合基因的表達(dá)質(zhì)粒與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成。
3.一種如權(quán)利要求1所述外源基因定點(diǎn)整合系統(tǒng)，其特征在于具體步驟如下(1)RBE順式元件的設(shè)計(jì)在RBE序列的正鏈的5’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)，在負(fù)鏈的3’端增加AseI粘性酶切位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的編碼RBE的DNA序列見SEQ.NO1；(2)RBE順式元件的克隆和測(cè)序以及pRBE-CMV-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建合成的攜帶AseI粘性末端的RBE正負(fù)鏈對(duì)應(yīng)片段退火復(fù)性，成為雙鏈DNA片段，通過DNA重組技術(shù)插入經(jīng)AseI酶切的pEGFPN2載體，再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主菌，最后涂布在卡納霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，篩選可能是重組克隆的菌落；(3)pRBE-CMV-FIX重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI限制性內(nèi)切酶從經(jīng)DNA測(cè)序鑒定的pBS/FIX質(zhì)粒中酶切出FIX基因片段，然后用T4DNA連接酶將它重組插入pRBE-CMV-EGFP的BamHI位點(diǎn)；再用酶連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主菌，若干抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，確定其為所要的插入人凝血因子IX基因的重組載體，編碼FIX的DNA序列為SEQ.NO2；(4)將PRBE-CMV-EGFP和PRBE-CMV-FIX重組表達(dá)質(zhì)粒分別與rep基因表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合構(gòu)成所需的定點(diǎn)整合體系。
4.一種如權(quán)利要求1所述的外源基因定點(diǎn)整合體系在細(xì)胞株改建及基因治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種rep基因表達(dá)質(zhì)粒，RBE順式元件定點(diǎn)整合體系及其制備方法和在基因治療中的應(yīng)用。該定點(diǎn)整合體系為由攜帶有RBE順式元件及EGFP報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成，或者由攜帶有RBE順式元件及人凝血因子IX的表達(dá)質(zhì)粒與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共同作用構(gòu)成。該定點(diǎn)整合系統(tǒng)可用于在人類細(xì)胞株中導(dǎo)入外源基因，制備程序簡(jiǎn)單，與其他治療基因聯(lián)合運(yùn)用，可以適用于多種疾病的基因治療。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1807647SQ20051011228
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者馮登敏, 朱煥章, 陳金中, 賈韋國(guó), 薛京倫 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)