專利名稱：一種云芝菌種以及采用該菌種生產云芝胞內糖肽的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥用微生物發(fā)酵領域，具體涉及云芝胞內糖肽生產菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法。
背景技術：
云芝胞內糖肽系自藥用真菌云芝(Coriolus Versicolor)液體培養(yǎng)菌絲體或從云芝子實體中提取得到的結合蛋白多糖，云芝胞內糖肽具有廣泛的藥理作用，特別對機體的免疫功能具有調節(jié)和增強作用，是一種有效的免疫增強藥，已成為治療免疫功能低下者的藥物。云芝胞內糖肽可預防和治療慢性乙型肝炎、肝硬化等類肝病，可預防和治療多種腫瘤疾病如肝癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、頭頸部癌、婦癌等類惡性腫瘤手術，可降低放、化療毒副反應，可作為治療癌癥的輔助藥品。此外云芝糖肽還具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血糖、抗乙肝病毒、以及提高抗氧化能力，清除脂質過氧化物作用。云芝胞內糖肽已于1998年被國家衛(wèi)生部批準為國家II類新藥。
云芝胞內糖肽是將天然云芝菌子實體或通過深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得云芝菌絲體，通過粉碎、水煮，過濾去除固體殘渣，濾液濃縮至一定體積后，利用多糖溶于水而不溶于醇的特點，將糖肽沉淀醇沉出來。
有關云芝液體發(fā)酵有一些文獻報道，但由于云芝糖肽是一個多組分復雜體系，糖肽的理化性質、生理活性與分子量有很大關系，如何篩選得到一個優(yōu)良菌株，如何通過液體發(fā)酵，特別是補料發(fā)酵及控制pH，以獲得大量云芝菌絲體，提取得到較高有效成分含量產品，特別是符合國家藥品標準WS-XG-021-2002要求的產品，目前無相關專利報道。
目前云芝菌絲體培養(yǎng)一般采用間歇分批發(fā)酵工藝，如中國專利(申請?zhí)?9105471.5)一種云芝糖肽(PSP)的生產方法中，采用分批發(fā)酵的方法，分批發(fā)酵其菌體量相對較低，因而云芝胞內糖肽的得率也不高，一般來說其得率不超過1.2克/升發(fā)酵液。
中國專利申請?zhí)?9105471.5中，云芝胞內糖肽的提取，采用發(fā)酵醪壓濾后得到濕菌絲體，用100C熱水浸提3小時；中國專利(申請?zhí)?0102310.8)“一種云芝多糖提取新工藝”中描述了云芝子實體加水煮沸，在浸出液中加入氫氧化鈣，使云芝多糖形成絡合物而沉淀析出，再加酸溶解云芝多糖鈣絡合物沉淀，溶解液中加入乙醇使云芝多糖沉淀；由于菌體破碎不完全，造成云芝胞內糖肽收率不高。
因此，本領域迫切需要改進云芝培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)物中云芝胞內糖肽的提取方法，提高產量及收率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種高產云芝胞內糖肽的云芝菌種，彌補現有技術的不足；本發(fā)明的另一目的是提供一種通過補料和控制發(fā)酵液pH，以提高云芝菌絲體量，進而提高了云芝胞內糖肽產率的發(fā)酵方法，解決現有技術菌絲體產量不高、胞內糖肽得率低的問題；本發(fā)明的再一目的是提供一種新的云芝胞內糖肽提取方法，以克服現有技術操作時間長，云芝胞內糖肽得率低，以及有效成分含量低的問題。
本發(fā)明的第一方面，公開了一種云芝菌株，該云芝菌株是從東北野生云芝子室體中分離得到，已于2004年11月5日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M204081。
所述菌種采集于南京江浦老山樹林間，生于櫟樹的腐木上。
子實體形態(tài)特征菌蓋扇形至貝殼形，無柄，復瓦狀疊生于枯木樹干上。體積為1-6×1-10厘米，厚1-3(-4.5)毫米。菌蓋革質、薄，表面生有細長絨毛或絨毛，顏色呈灰褐色、灰黃色、灰黑色、灰白色等多種，并排列成2-3鐘顏色相間的同心環(huán)帶，故云芝稱雜色云芝，彩絨革蓋菌。菌蓋邊緣薄，完整或波浪狀，呈白色或淺色，其下側無子實層。菌肉白色，半纖維質至木栓質，厚0.5-1(-1.5)毫米，菌蓋內部構造由三種形態(tài)不同的菌絲組成，即生殖菌絲、骨架菌絲、聯(lián)絡菌絲。菌管面在幼時為白色，漸變成淺黃色或灰色，管口圓形至多角形，每毫米間有3-5個，菌管長0.5-2毫米，管壁薄，全緣。擔孢形圓筒形，稍彎曲，光滑無色，5-8×1.5-2.5微米。
菌絲體特征在培養(yǎng)基質上，菌落白色，菌絲絨毛狀，質地緊密，緊貼基質上，分泌黃色或淺褐色色繁，菌絲有爬壁現象，培養(yǎng)基表面常出現黃斑，反面淺黃色。顯微鏡下檢驗菌絲無色，細長，有分隔，分枝繁茂，菌絲直徑3.5微米，菌絲細胞壁上有鎖狀聯(lián)合，生長的前、中期鎖狀聯(lián)合較多，后期減少。
該菌種在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，可見有白色菌絲長出，培養(yǎng)4-5天，白色菌絲擴展、稠密；該菌種通過《中國的真菌》(鄧叔群科學出版社)文獻公開的方法進行鑒定，屬于云芝菌種(Coriolus Versicolor)，但是，與常規(guī)的云芝菌種有明顯的區(qū)別，其最主要的區(qū)別在于從該菌絲體提取得到云芝胞內糖肽的HPLC圖譜與云芝胞內糖肽標準品(中國藥品生物制品檢定所購得)一致，且有效成分相對含量高。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種流加式培養(yǎng)云芝培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟在發(fā)酵罐中接入發(fā)酵培養(yǎng)基和種子液，種子液和培養(yǎng)基的體積比百分比為5-20％，種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐總體積的40-80％；種子液培養(yǎng)時間為20-50h，發(fā)酵液培養(yǎng)時間為72-144h。
在攪拌轉速120-300rpm、通風0.4-1.0v/v/m、溫度25-30C條件下發(fā)酵培養(yǎng)；按照本發(fā)明優(yōu)選的技術/方案，在起始培養(yǎng)后20-50小時之間，補加pH調節(jié)劑和營養(yǎng)物質；pH調節(jié)劑為濃度為0.05～0.2N的氫氧化鈉，補料后培養(yǎng)基的pH控制在4.5-6.0；營養(yǎng)物質選自重量濃度為1-4％的葡萄糖、重量濃度為0.5-2％玉米漿、重量濃度為0.1-0.6％蛋白胨中的一種或其混合物，營養(yǎng)物質的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積的0.5～6％；繼續(xù)培養(yǎng)，在起始培養(yǎng)后4-5天，獲得含菌絲體的發(fā)酵液，即培養(yǎng)物。
其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和含量為(g/l)葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麩皮5-30，蛋白胨1-20，豆餅粉10-40，磷酸氫二鉀1-10，硫酸鎂0.2-；其中，種子液為菌種CCTCC M204081的斜面培養(yǎng)物經兩級液體發(fā)酵培養(yǎng)制備斜面菌種培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基(g/l)為土豆180～220，葡萄糖5～15，蔗糖5～15，酵母粉0.5～2，瓊脂1～3；接種后，26-28℃培養(yǎng)5-6天；一級、二級種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/l)為葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麩皮5-30，蛋白胨1-20，豆餅粉10-20，磷酸氫二鉀1-10，硫酸鎂0.2-1；接種后培養(yǎng)40-70小時，溫度25-30℃，轉速150-200rpm。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種從云芝培養(yǎng)菌絲體中提取云芝胞內糖肽的方法，包括如下步驟(1)板框過濾含菌絲體的發(fā)酵液通過板框過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；(2)菌絲體破碎板框過濾后得到的菌絲體，加入菌絲體重量3～8倍的水，經高壓均質機在400～600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；(3)抽提經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮沸0.5～2小時，板框過濾，濾餅用95～100℃的沸水洗滌，板框過濾；(4)超濾濃縮濾過液采用截留分子量為0.5～2萬，優(yōu)選1萬的超濾膜超濾，體積的濃縮倍數為3-10倍，得到云芝胞內糖肽濃縮液；(5)酒精沉淀加入超濾濃縮液體積的2～5倍的、體積濃度為75～95％的乙醇醇沉，靜置6-8小時，收集云芝胞內糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞內糖肽產品。
通過高效液相色譜(HPLC)示差折光檢測器檢測，所制備的云芝糖肽產品與云芝糖肽標準品出峰時間一致，其總糖、單糖、肽含量等指標，均符合國家藥品標準WS-XG-021-2002的要求。
本發(fā)明的補料培養(yǎng)云芝菌絲體的方法，通過補料調節(jié)發(fā)酵液pH值，有利于菌絲體生長和胞內糖肽合成；同時，通過補料補充了菌絲體生長所需的碳源、氮源等營養(yǎng)物質。與分批培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的補料培養(yǎng)方法有利于提高菌絲體產量，提高胞內糖肽及胞外糖肽的產率。
本發(fā)明的提取云芝糖肽的方法，采用高壓均質方法破碎細胞，使胞內糖肽最大程度的釋放，減少熱水抽提時間，節(jié)約能耗，同時可保留有效成分的活性，提高胞內糖肽得率。
本發(fā)明的提取云芝糖肽的方法，超濾步驟去除大部分小分子物質，提高了終產品中大分子量多糖等有效成分比例，獲得的云芝胞內糖肽產品，其總糖≥35％，還原糖≤10％，肽≥20％，顯著提高了產品質量。


圖1實施例2的云芝胞內糖肽HPLC圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人從全國各地采集了8株云芝菌種，經篩選獲得可產生符合國家藥品要求的云芝胞內糖肽優(yōu)良菌株CV-LS。該云芝菌株CV-LS是從老山野生云芝子室體中分離得到，已于2004年11月5日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M204081。
本發(fā)明所說的云芝糖肽的國家藥品標準WS-XG-021-2002參見“中國藥典2000年版”，用于云芝糖肽鑒定的對照品/標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。
本發(fā)明中采用的30升全自動不銹鋼發(fā)酵罐購于無錫三海生化工程有限公司；高壓均質機為APV Gaulin Inc.公司的15MR-8TBA型號的產品，也可以采用上海張堰輕工機械廠生產的高壓均質機，型號為JHG-Q54-P60。
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應理解，實施例只用于具體闡述本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1種子液為菌種CCTCC M204081的斜面培養(yǎng)物經兩級液體發(fā)酵培養(yǎng)制備斜面菌種培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基(g/l)為土豆200，葡萄糖10，蔗糖10，酵母粉0.1，瓊脂2；接種后，27℃培養(yǎng)5天；一級、二級種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/l)為葡萄糖30，蔗糖30，玉米粉21，麩皮17，蛋白胨10，豆餅粉15，磷酸氫二鉀6，硫酸鎂0.6；接種后培養(yǎng)50小時，溫度28℃，轉速170rpm，獲得種子液。
實施例2發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白胨，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不銹鋼發(fā)酵罐(無錫三海生化工程有限公司生產)，裝液量22L，121℃滅菌25min，冷卻至室溫后，接入實施例1的種子液，接種量為10％，攪拌轉速200rpm，通風0.8v/v/m，溫度27℃、罐壓0.5kg/cm2。
培養(yǎng)4天后結束發(fā)酵，菌絲體干重為18.50g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉干燥后，獲得1.10g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為44.57％，肽27.92％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同。其他指標均符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。云芝胞內糖肽的HPLC圖譜見圖2。
實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白胨，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不銹鋼發(fā)酵罐，裝液量20L，接種量10％、攪拌轉速150rpm、通風1v/v/m、溫度26℃、罐壓0.5kg/cm2。發(fā)酵30h后補加1L重量濃度為20％葡萄糖，同時用0.1N NaOH控制pH為5，培養(yǎng)4.5天后結束發(fā)酵，菌絲體干重為28.78g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉干燥后，獲得2.0g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為55.15％，肽34.42％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同，符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。
實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白胨，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不銹鋼發(fā)酵罐，裝液量18L，接種量10％、攪拌轉速150rpm、通風0.6v/v/m、溫度28℃、罐壓0.5kg/cm2。發(fā)酵48h后補加1.8L重量濃度為20％的葡萄糖水溶液和0.36L重量濃度為10％的蛋白胨水溶液，同時用0.1N NaOH控制pH為4.5，培養(yǎng)5天后結束發(fā)酵，菌絲體干重為29.94g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉干燥后，獲得2.20g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為47.10％，肽37.72％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同，符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。
實施例5發(fā)酵過程采用0.1N NaOH調節(jié)控制發(fā)酵液pH為5.5，與未控制pH發(fā)酵，其胞內糖肽得率比較如表1所示。
表1、發(fā)酵過程控制pH對胞內糖肽得率的影響

可見控制pH發(fā)酵，胞內糖肽提高近70％，效果顯著，控制pH有利于胞內糖肽的合成。
實施例6(1)板框過濾實施例2的含菌絲體的發(fā)酵液通過板框過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；(2)菌絲體破碎板框過濾后得到的菌絲體，加入菌絲體重量5倍的水，經高壓均質機在400Kg/cm2下均質破碎菌絲體；(3)抽提經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮2小時，板框過濾，濾餅100℃的沸水洗滌，板框過濾；(4)超濾濃縮濾過液采用截留分子量1萬的超濾膜超濾，體積濃縮倍數為5倍，得到云芝胞內糖肽濃縮液；(5)酒精沉淀加入超濾濃縮液的5倍體積的、體積濃度為95％的乙醇醇沉，靜置7小時，收集云芝胞內糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞內糖肽產品。其得率見表2。
實施例7～8同實施例6，其中，板框過濾后得到的菌絲體，加入菌絲體重量4倍的水，經高壓均質機分別在500和600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；其得率如表2所示。
對比實施例1采用實施例6相同的工藝條件，其中，采用常規(guī)的機械方法破壁，其得率如表2所示。
表2、高壓均質與機械破壁效果比較

由表2可見，高壓破壁能使菌絲體破壁完全，明顯提高胞內多糖得率，而且熱水抽提時間縮短為1小時，能耗降低，降低了成本。
權利要求
1.一種保藏編號為CCTCC M204081的云芝菌株。
2.一種補料培養(yǎng)云芝培養(yǎng)物的方法，其特征在于，包括如下步驟在發(fā)酵罐中接種CCTCC M204081的云芝種子培養(yǎng)液，種子液和培養(yǎng)基的體積百分比為5-20％；在攪拌轉速120-300rpm、通風0.4-1.0v/v/m、溫度25-30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后4-5天，獲得含菌絲體的發(fā)酵液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在起始培養(yǎng)后20-50小時之間，補加pH調節(jié)劑和營養(yǎng)物質，補料后培養(yǎng)基的pH控制在4.5-6.0。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，pH調節(jié)劑為0.05～0.2N的氫氧化鈉。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，營養(yǎng)物質選自重量濃度為1-4％的葡萄糖、重量濃度為0.5-2％玉米漿、重量濃度為0.1-0.6％蛋白胨中的一種或其混合物，營養(yǎng)物質的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積的0.5～6％。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養(yǎng)基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麩皮5-30克，蛋白胨1-20克，豆餅粉10-40克，磷酸氫二鉀1-10克，硫酸鎂0.2-1克。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的種子液為菌種CCTCCM204081的斜面培養(yǎng)物經兩級液體發(fā)酵培養(yǎng)的產物；斜面培養(yǎng)基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養(yǎng)基含有土豆200克，葡萄糖10克，蔗糖10克，酵母粉1克，瓊脂2-2.5％；接種后，26-28℃培養(yǎng)5-6天；一級、二級液體培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養(yǎng)基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麩皮5-30克，蛋白胨1-20克，豆餅粉10-20克，磷酸氫二鉀1-10克，硫酸鎂0.2-1克，pH自然；接種后培養(yǎng)40-70小時，溫度25-30℃，轉速150-200rpm。
8.一種從云芝培養(yǎng)菌絲體中提取云芝胞內糖肽的方法，其特征在于，包括如下步驟含菌絲體的發(fā)酵液過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；加入菌絲體重量3～8倍的水，經高壓均質機在400～600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮沸0.5～2小時，板框過濾，濾餅用95～100℃的沸水洗滌，板框過濾；濾過液采用截留分子量為0.5～2萬的超濾膜超濾，體積的濃縮倍數為3-10倍，得到云芝胞內糖肽濃縮液；加入超濾濃縮液體積的2～5倍的、體積濃度為75～95％的乙醇醇沉，靜置6-8小時，收集云芝胞內糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞內糖肽產品。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥用微生物發(fā)酵領域，具體涉及云芝胞內糖肽生產菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法。發(fā)明人篩選得到可產生高含量有效成分的云芝胞內糖肽生產菌種云芝(Coriolus versicolor)CCTCC M204081，并提供了一種通過補料和控制pH優(yōu)化發(fā)酵過程的新方法；本發(fā)明還公開了新的從菌絲體提取云芝胞內糖肽的提取工藝。本發(fā)明的方法，提高菌絲體量，有利于云芝胞內糖肽的合成，從而提高了云芝胞內糖肽產率。獲得的云芝胞內糖肽產品，其總糖≥35％，還原糖≤10％，肽≥20％，主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間一致，符合國家藥品標準WS－XG－021－2002的要求。
文檔編號C12P21/00GK1807573SQ20051011230
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權日2005年12月29日
發(fā)明者余曉斌, 胡衛(wèi)珍, 濮文林 申請人:江南大學, 南京老山藥業(yè)股份有限公司